专利名称：小麦渐渗系抗非生物胁迫基因Tamyb31及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及抗非生物胁迫基因Tamyb31及其应用。
背景技术：
据有关部门预计，2010年世界人口将达到70亿，2039年将超过100亿。与此相 反，世界上可供耕种土地则以每年38610方哩的速度减少。盐渍化是土地退化的一个重要 原因。据统计，中国约有10%的耕地存在不同程度的盐渍化，其中大部分是由自然条件引发 的，如长时间风化的岩石中Na+、Mg2+等盐离子的积累，降雨带来的盐分等。干旱也是土地退 化的重要因素。干旱、半干旱区占全球陆地面积的33%，而我国则更为严重，已占全国陆地 面积的38%，达5. 7亿亩。除了传统育种方法外，利用基因工程和细胞工程等新技术可以快速稳定地获得具 有优良抗盐/旱能力的作物新品种。利用转基因技术将新的抗盐/旱功能基因转入到作物 中，以此高效开发抗逆转基因作物新品种，用于在盐渍/干旱地区种植是一项具有广阔应 用前景的技术。其前提是，必须较系统地了解植物抗逆机制，分离高效的与抗逆旱相关的基 因。多年来，有关植物抗逆机制方面的研究已取得了较大的进展，克隆了分生物胁迫 相关基因，为进一步阐明植物抗逆的分子机制提供了理论线索和依据。一些实验表明，将植 物本身以及其他生物中与抗旱相关的基因转入植物中，其异源转录和翻译产物可以使转基 因植物的抗旱能力发生改变。用于转化的功能基因包括两类一类基因转化后可以直接提 高植物的抗逆能力，这可以通过被转基因的过量表达或诱导型表达提高植物的抗逆能力； 另一类是通过抑制或诱导型抑制植株本身的组成型表达提高植物的抗逆能力。MYB蛋白是一类非常重要的转录因子，参与植物对多种非生物胁迫的响应过程。近 年来已有试验表明，拟南芥中的MYB基因可以提高拟南芥的抗逆能力，但有关小麦MYB基因 在植物抗旱过程中的作用尚未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种抗逆基因——小麦渐渗系抗非生 物胁迫基因Tamyb31及其应用。本发明的技术方案在于从小麦体细胞杂种渐渗系山融3号中分离得到了小麦MYB 等位变异基因——Tamyb31，并构建双子叶植物表达载体pSTART/Tamyb31转化模式植物拟 南芥，以鉴定基因的功能并最终将该基因用于小麦等重要农作物的转化，提高农作物的抗 逆性。本发明提供的小麦渐渗系抗逆基因名称为小麦体细胞杂种渐渗系山融3号MYB基 因Tamyb31，所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。本发明还提供了含上述抗逆基因Tamybl的植物表达载体pCAMBIA3301/Tamyb31。
本发明所述基因Tamyb31及含所述基因Tamybl的植物表达载体 PCAMBIA3301 (pSTART) /Tamybl在培育抗逆植物中的应用。其中所述植物优选是普通小麦或 拟南芥。将本发明所述基因导入植物细胞，使其在植物中过量表达就可以使转基因植物获 得抗逆能力。为了便于对转基因植物或细胞系进行筛选，可以对含有所述基因Tamyb31的 植物表达载体pSTART/Tamyb31进行加工，如可以加入选择标记(⑶S等)或者具有抗性的 抗生素标记物(潮霉素，卡那霉素，庆大霉素等)等。 本发明所述的基因可广泛用于培育抗逆农作物新品种，并可为深入阐明植物抗逆 机制提供理论依据。本发明的有益效果利用现有的植物基因工程技术，本发明首次克隆得到了小麦 渐渗系山融3号抗非生物胁迫新基因Tamyb31，并通过根瘤农杆菌介导的方法将该基因转 入拟南芥，经过比较分析证明，转基因植株的抗逆能力明显增强。据此可通过过表达策略开 发和培育抗逆作物新品种。
图lTamyb31基因全长cDNA序列的扩增结果其中Maker:DNA 分子量标准，λ DNA/EcoRI+HindIII (下同)。图2Tamyb31在多种处理下山融3号中的半定量RT-PCR分析，不同发育时期 RT-PCR 分析。图3Tamyb31转基因拟南芥植株qPCR及southern鉴定。其中VC:空载体对照(下同)，3-21、4-21、6_10为1^11^31过表达系(下同)。图4Tamyb31转基因拟南芥植株在各种胁迫下种子的萌发率。图5Tamyb31转基因拟南芥植株在盐/旱胁迫下表型。图6Tamyb31转基因拟南芥植株在LiCl/KCl/Mannitol胁迫下表型图7Tamyb31转基因拟南芥植株中胁迫标记基因的qPCR结果。图8Tamyb31转基因小麦植株及检测。图 9PCAMBIA33Ol-Ubi 载体图。
具体实施例方式实施例1、Tamyb31的克隆1.1山融3号RNA提取(1)将PEG渗透胁迫处理的组织材料放入液氮预冷的研钵中，在液氮中充分研磨 成粉末；(2)待液氮挥发干，立即转移到2ml的离心管中，每IOOmg材料约加入Iml Trizol 提取液，剧烈振荡使样品充分裂解，室温放置5分钟；(3) 4"C，12000rpm 离心 15 分钟；(4)用移液器小心将上层水相转移至一个新的1. 5ml的离心管中，加入200 μ 1氯 仿(chloroform)，剧烈振荡混勻15秒，室温放置10分钟； 醇(1 1体积)，充分混勻，-20 0C，沉淀30min或过夜；
(5) 4°C，12000rpm 离心 15 分钟；(6)用移液器小心将上层水相转移至一个新的1. 5ml的离心管中，加入500 μ 1的 异丙醇(1 1体积)，充分混勻，-20°C，沉淀30min或过夜；(7) 40C，12000rpm 离心 lOmin，小心弃去上清液；
(8) RNA沉淀用Iml的75%乙醇洗涤。4°C，8000rpm离心IOmin收集沉淀；(9)重复用75 %乙醇洗涤一次RNA沉淀；(10)去上清，RNA沉淀于无菌操作台上晾干约10_15分钟，RNA略显透明，加入适 当体积(30-50 μ 1)的RNase-free水充分溶解(可放于_80°C长期保存)；(11)紫外分光光度计及1 % Agrose凝胶电泳检测RNA浓度及质量。注a)用紫外分光光度计检测RNA的产量，在260nm处的吸光度，IOD = 40ug/ ml。根据在260nm和280nm处的吸光值，检测RNA的纯度，纯RNA的0D26(1/0D28(1比值应接近 2. O (比值最好在1. 9 2. 1之间)。b)用1 % Agrose凝胶电泳检侧RNA的质量及大小。吸取Iul RNA力卩入3 μ 1的 RNase-free水，力卩1 μ 1上样缓冲液65°C变性5分钟。电泳后用EB染色，另取3μ 1的 IkbDNAMarker 作为对照。1.2cDNA 3'和5'末端第一链的快速扩增5，和 3，RACE 第一链 cDNA 末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNAEnds, RACE)按 Clonetech 公司的 SMART RACE cDNA Amplification Kit 操作指南进行。1.3 Tamyb315'和3’端克隆(1)根据基因芯片的检测结果，获得Tamybl的部分序列并按照SMART RACE cDNAAmplification Kit操作指南设计两对基因特异引物(序列如下)Tamyb31-NT3 5‘ GAACCTCCACTGAGAAACATTACC3‘Tamyb31-NT7 5 ‘ GTTCCAATCTATGAGGGATACACGC3 ‘弓丨物序列Tamyb31-As 5' GATCAAGAACGTCTGGCACA 3，Tamyb31-S :5，GAGGCCATCGAGTAGTCAGC 3，；(2)按照 SMART RACE cDNAAmplification Kit 操作指南分别扩增 Tamyb31 的 5， 和3’末端；(3)将5’和3’端序列拼接，分别在起始密码上游和终止密码下游设计引物(序列 如下)，以5’或3’ RACE产物为模板扩增该基因全长。引物 1 :ATGGTGAGGGCTCCTTGCTGC
引物 2 TTAAATCTGTGACAAACTCTGCA1. 4Tamybl 全长克隆1.引物序列见1.3部分。2. PCR 反应体系(20 μ L)IOXbuffer2μ 1模板(5，RACE产物)1 μ 1dNTPs (2. OmM each)0. 5 μ 1Primerl (5 μ Μ)1 μ 1Primer2 (5 μ Μ)1 μ 1
高保真Taq 酶(STRATAGEN，Cat No 600380) 0. 5 μ 1ddH2014 μ 13. PCR 反应程序为94°C预变性 5min ；94°C变性 45sec，57. 5°C复性 45sec，72°C延 伸45sec，循环35次；72°C延伸7min。4.扩增片段的回收后与T载体连接、转化大肠杆菌、选取阳性克隆测序。结果见图
Io实施例2、Tamyb31的表达分析2. 1胁迫下RNA的提取山融3号种子正常萌发，Hoagland培养液培养至株高约IOcm时(约3周时间) 开始进行干旱控水、盐胁迫(200mM NaCl)、ABA、GA、ACC, JA和SA处理。处理不同时间后， Trizol法提取幼苗根、叶RNA同上。2. 2逆转录获得cDNA逆转录产生cDNA，按说明书操作。2.3PCR反应及电泳(1)以cDNA为模板，进行PCR反应。引物如下5'端引物GATCAAGAACGTCTGGCACA3'端引物GAGGCCATCGAGTAGTCAGC(2) PCR 体系ddH2012. 6μ 1IOXTaq buff err (Mg2+free)2μ 1MgCl2(25mM)1. 2μ 1Primerl (5 μ Μ)1 μ 1Primer2 (5 μ Μ)1 μ 1dNTP (2mM each)1 μ 1Taq polymerase (5U/ μ 1)0. 2 μ 1模板(逆转录cDNA)1μ 1ToTal Volume20 μ 1(3) PCR 程序95°C 3min，25 30cycles 95°C 30s,60°C 30s, 72°C 60s ；72°C 5min。根据内参Actin的扩增情况确定PCR的循环数，调整cDNA模板的加入量。(4) 1.5%琼脂糖凝胶电泳。结果见图2。实施例3、植物表达载体的构建(35S启动子)植物表达载体pStart是含有35S启动子和NPT II基因的双元载体，在其多克隆位点上含有限制性内切酶BamHI和SmaI的识别位点。据此在目的基因起始密码上游和终 止密码下游设计含BamHI和SmaI识别序列的引物，用高保真Taq酶扩增目的基因，体系同 1. 4。用限制性内切酶BamHI和SmaI对载体pStart和目的基因扩增产物片断分别进行 酶切。完全酶切的载体在0.8%琼脂糖凝胶上电泳分离后，经胶回收，然后与酶切的目的基 因扩增片段相连。
酶切体系，(1)质粒BamHI单酶切IOXBuffer1 μ 1质粒1 2 μ 1BamHI1 μ 1SmaI1 μ 1加ddH20至总体积20 μ 1 于37°C恒温水浴锅酶切2小时以上。酶切后以0. 5XTBE为电泳缓冲液，将酶切产 物进行0. 8%琼脂糖凝胶电泳。在紫外透射仪下用洁净刀片切下pStart大片段和目的基因 条带，回收。(2)回收的载体大片段的脱磷。(3)经酶切的载体片段和目的基因片段以摩尔比1 4的比例进行16°C连接过 夜。(4)连接产物热激法转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，转化菌在含Kan 50 μ g/ml的 LB固体平板上37°C培养16小时左右。(5)重组子的鉴定①载体特异引物的合成为了鉴定目的基因的插入方向，根据35S启动子序列设计一个载体特异引物，序 列如下:GTT GGG GTT TCTACA GGA CGT②重组质粒的PCR验证挑取在kan培养基上的抗性单菌落分别接种于5ml含Kan的LB液体培养基中 37°C振荡培养过夜，碱变性法提取质粒，用载体特异引物和基因的下游引物进行PCR扩增， 体系同2. 3。PCR反应条件如下预变性940C 3min，35个循环为-MV 30sec，55°C 30sec, 72°C lmin，最后，72°C延伸lOmin。PCR产物用1. 0%琼脂糖凝胶电泳鉴定。③质粒酶切鉴定提质粒进行BamHI和SmaI酶切，酶切体系同上。0. 8%琼脂糖凝胶电泳，检测是否 含有预期分子量大小的片段，验证载体的正确构建。实施例4、农杆菌感受态的制备与转化4. 1农杆菌AGL1/EHA105感受态的制备(1)从YEP平板(含50 μ g/ml利福平)上挑取根癌农杆菌单菌落，接种于含 50 μ g/ml利福平的YEP液体培养基中，200rpm/min，28 °C培养过夜。(2)取2ml过夜培养液接种于50ml含相同抗生素的YEP液体培养基中在相同条件 下培养至OD6c 达0.5。(3)菌液冰浴 30min，4°C，5000rpm 离心 lOmin，收集菌体。(4)将菌体重悬于冰浴的IOml 0. 15mol/L的NaCl中，离心收集菌体。(5)再悬浮于Iml 20mmol/L冰预冷的CaC12溶液中，以200 μ 1/管将菌液分装在 1. 5mlEppendorf管中，置液氮中速冻lmin，_70°C保存备用。4. 2冻融法转化根癌农杆菌AGL1/EHA105(1)在室温下融化两管农杆菌感受态细胞，分别加入Iyg表达载体质粒DNA和1 μ g空载体，混勻后冰浴30min。(2)置液氮速冻Imin，迅速移至37°C温浴3min。(3)加入无抗生素的YEP 800 μ 1，28°C震荡培养3hr。(4) 7000rpm离心30s收集菌体，涂于含50 μ g/ml利福平、50 μ g/ml Kan的YEP平 板上，28°C倒置暗培养2-3天。4. 3菌体PCR鉴定菌体PCR方法及程序同上。 实施例5、拟南芥转化及筛选5.1拟南芥种植取拟南芥(哥伦比亚野生型)种子，置于垫有滤纸的平皿内，用少量蒸馏水润湿滤 纸，于4°C冰箱进行春化处理，3-5天后播种于育苗盘内，放置于人工气候箱内(16h光照， 220C /8h黑暗，18°C )，生长6-8周后，待抽苔开花时用于转化。5. 2拟南芥转化(1)转化前一天，取2ml活化的农杆菌AGL 1加到含相应抗生素的200ml YEP培养 基中，过夜培养至OD6tltl = 1.0-1.2。(2)离心收集菌体，并重悬于浸染液(5%蔗糖，0.04% Silwet L-77)中，使OD6tltl = 0. g。(3)将花序浸入浸染液30秒，其间前后摆动花序，使花序上形成一层膜。(4)用保鲜膜覆盖花序，暗培养一天后揭去保鲜膜，继续置人工气候箱使其生长。(5)隔5-7天再用相同的方法浸染一次。(6)大约一个月后收获种子。(7)空载体的转化同上5. 3拟南芥转化阳性株系筛选(1)收获的TO代种子消毒后(75%乙醇5min，清洁剂洗涤10-15min，无菌水冲洗 3-5次)，铺于含50 μ g/mL Kan的MS筛选培养基上。(2)4°C春化48h，移到培养室(16h光照/8h黑暗，22°C恒温)生长7_10天。将抗 性绿色小苗移到土中继续生长。(3)等植物绝大多数花苞已经结荚时，用小绳将植物单株绑起，以便单株收获Tl 代种子。(4)重复步骤(1)_(3)，将单株收获的Tl代种子继续在含卡那的MS培养基上进行 筛选，挑选抗性比为3 1的单插入独立株系移栽，并单株收获种子得到T2，继续重复步骤 (1)_(3)，直至T2代单株种子在卡那抗性培养基上不再分离，至此得到纯合的T2代植株用 于后续的进一步研究。空载体纯合体的筛选方法同上。(5)CTAB法提取野生型、空载体对照及不同转基因株系的基因组DNA，提取相应材 料的总RNA并逆转录合成cDNA。(6)PCR扩增以上述不同材料的基因组DNA为模板，使用基因特异引物、空载体检 测特异引物(35S启动子序列)，PCR反应体系和反应条件如前。(7)qPCR及Southern验证表明，Tamyb31在转化植株中正常表达。结果见图3。实施例6、转Tamybl拟南芥胁迫抗性分析
6. 1萌发率测定将空载体对照、三个株系的转Tamyb31拟南芥种子经消毒(方法同上)后，铺入含 有NaCl,ABA的MS培养基中，25°C培养，观察萌发情况，子叶完全张开为萌发，萌发率的=子 叶展开的种子数/用于萌发试验的种子总数X 100%。结果见图4。6. 2植株胁迫抗性分析(1)拟南芥种子消毒、萌发(方法同上)；(2)将萌发2天的幼苗转移至含Mannitol、NaCl、KCl和LiCl的MS培养基中垂直 培养，观察幼苗生长差异。结果见图5、6。(3)将土培3周左右的转基因植株及对照控水10天再浇水使其恢复生长3天，观 察植株抗旱状况。结果见图5。6. 3转Tamyb31拟南芥幼苗中抗旱相关Marker基因分析(1)拟南芥种子消毒、萌发、培养(方法同上)；(2)经旱、ABA处理后的对照及转基因株系，提取植株总RNA，逆转录形成cDNA，进 行RT-PCR分析。方法同实施例2，结果见图7。实施例7、转Tamyb31小麦植株及检测7. lTaMYB31-pCAMBIA3301 载体构建TaMYB31-0RF 用 TaMYB31-CDS-3301_S(Sacl)和 TaMYB31-CDS-3301_As(BamHl)扩 增后，连入pCAMBIA3301-ubi载体的Sacl和BamHl位点。转化子通过测序鉴定。pCAMBIA3301_ubi 载体图如图 9。7. 2小麦转化 将构建好的载体转入农杆菌EHA105同实施例4。采用本实验室建立的生长点转化 小麦的专利方法转化了小麦栽培品种济麦21和济南17。转化幼苗在农杆侵染后壮苗恢复 生长1周，移栽至纸杯中，利用PCR鉴定阳性植株，结果见图8。
权利要求
一种小麦渐渗系抗非生物胁迫基因Tamyb31，其特征在于所述基因cDNA的核酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.一种含有权利要求1所述基因Tamyb31的植物表达载体pSTART/Tamyb31。
3.权利要求1所述基因Tamyb31在培育抗非生物胁迫植物中的应用。
4.权利要求2所述植物表达载体pSTART/Tamyb31在培育抗非生物胁迫植物中的应用。
5.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于所述植物是普通小麦或拟南芥。
全文摘要
本发明公开了一种小麦渐渗系抗非生物胁迫(盐、旱等)新基因Tamyb31及含有所述基因Tamyb31的植物表达载体pStart/Tamyb31；本发明还公开了所述基因Tamyb31及含有所述基因Tamyb31的植物表达载体在培育抗非生物胁迫(盐、旱等)中的应用。实验证明，本发明所述过表达转基因植株的抗非生物胁迫(盐、旱等)能力明显提高。
文档编号C12N15/29GK101864430SQ20101020779
公开日2010年10月20日 申请日期2010年6月24日 优先权日2010年6月24日
发明者吕建, 夏光敏 申请人:山东大学