专利名称：棘球白素b母核的分离方法
技术领域：
本发明涉及光谱抗真菌药物的研发，具体地，本发明涉及阿尼芬净的前体棘球白素B母核的分离方法。
背景技术：
上世纪以来，由于大量使用广谱抗真菌药物和免疫抑制剂，真菌感染性疾病造成的死亡率逐渐提高，因此，研究安全新型的抗真菌药物显得非常重要。棘球白素类 (echinocandins)即是以真菌细胞壁为作用靶点的新型抗真菌药物，它可以非竞争性地抑制细胞壁上β _1，3葡聚糖合成酶的活性，造成真菌细胞的死亡。棘球白素类主要有三种类型B、C以及D，其中棘球白素B是最主要的类型，但由于它的水溶性较差，毒性较高，因此使用受阻。然而，将棘球自素B的侧链断开后生成棘球白素B母核(Echinocandin B Nucleus, 简称ECB Nucleus)，再接上修饰基团构成阿尼芬净，此药目前已经上市，市场潜力巨大。棘球白素B母核是通过游动放线菌对棘球白素B进行转化得到的，文献 DEACYLATION OF ECHN0CANDIN B BY ACTINOPLANES UTAHENSIS(MAR 1989 THE JOURNAL OF ANTIBIOTICS)介绍了其分离提取工艺转化液用HP-20大孔吸附树脂进行初分，然后用反向HPLC精制得到纯品，此法虽然步骤简单，得到的棘球白素B母核纯度较高，但该工艺的设备要求高，因此难以实现规模化生产。
发明内容
鉴于现有技术的上述缺陷，本发明提供一种简单的制备棘球白素B母核的方法， 其不仅能够很好的去除色素，且适合大规模的工业生产，具有很好的商业价值。本发明方法能将棘球白素B母核的最终纯度提高到92%以上。本发明的技术方案如下提供一种棘球白素B母核的分离方法，该方法包括如下步骤1)含棘球白素B母核的转化液抽滤后，将滤液pH调整到5-8，上大孔苯乙烯非极性吸附树脂，用水甲醇溶液洗脱，再用甲醇水溶液将棘球白素B母核集中洗下；2)将步骤1)收集液上大孔丙烯酸树脂，再用酸水溶液将棘球白素B母核集中洗下；3)将步骤2)收集液的pH调整到4-5，然后浓缩冻干制得棘球白素B母核。所述含棘球白素B母核的转化液按照下列步骤得到将培养好的转化用菌体放入 PH为6. 0-7. 0的磷酸缓冲液悬浮，加入棘球白素B母核精制品混勻，25-30°C下进行转化反应3-5小时，得到含棘球白素B母核的转化液。上述步骤1)结束后，棘球白素B母核的收率为75-80%，纯度为65_70% ；上述步骤2)结束后，棘球白素B母核的收率为90%以上，纯度为95-96% ；上述方法的总收率在 60%以上，最终棘球白素B母核纯度为95%左右。优选地，步骤1)中使用的水甲醇溶液和甲醇水溶液的体积可以为2-4CV ；步骤2)中使用的酸水溶液的体积可以为2-4CV。上述步骤1)中含棘球白素B母核的转化液抽滤后的滤液pH对上柱影响较大，在 PH为6-8时吸附效果较好，在pH > 8时破坏严重，在pH < 5时则吸附效果很差。根据本发明，步骤1)中所述水甲醇溶液的浓度可以为5%-15%，优选9%。该步骤中用水甲醇洗脱是除杂的关键，甲醇含量可以在5%-15%之间，但随着甲醇含量的增加，棘球白素B母核的损失也逐渐加大，因此优选9%的甲醇洗脱。根据本发明，步骤1)中所述甲醇水溶液的浓度可以为33%-100%，优选50%。该步骤中用甲醇水将棘球白素B母核集中洗脱下来，其中甲醇与水的比例在1 2到100%甲醇都可以，但1 1时洗脱色素含量较少，目的产物纯度相对高。根据本发明的一个优选的实施方式，步骤幻中的大孔丙烯酸树脂可以用乙醇或甲醇预洗除杂。其中乙醇除杂更为集中。根据本发明，步骤2、中的酸水溶液可以选自盐酸水溶液、硝酸水溶液或磷酸水溶液，优选盐酸水溶液。所述酸水溶液的浓度可以为0.005-0. 5N，优选0.01N。该步骤的目的是用酸水溶液将棘球白素B母核集中洗下，酸的浓度在0. 005-0. 5N都可以，但0. OlN洗脱时色素下来少，纯度较高。根据本发明一个优选的实施方式，步骤1)和2)中的上柱流速均可为CV/min， 洗脱流速均可为2% CV/min。本发明含棘球白素B母核的转化液具体通过以下方法得到菌种游动放线菌(Actinoplanes utahensis)保藏号为NRRL 12052。菌体培养条件将保存在冷冻管中的游动放线菌NRRL12052在条件下接入斜面培养基中培养7天，斜面培养基的组成为(％)酵母提取物0.3、麦芽浸出物0.3、蛋白胨0.5、葡萄糖 1.0、琼脂2.7、？!17.0;培养7天后将斜面上长出的菌体按10%接种量接种到转化培养基中培养4天， 培养温度为30°C，转化培养基的组成为(％)蔗糖2.0、燕麦片2.0、麦芽浸出物0.5、酵母 0.25、K2HPO4 0. UKCl 0. 05、MgSO4. 7Η20 0. 05、FeSO4. 7H20 0. 0002、ρΗ7· 0 ；培养 4 天后，将转化菌体用3倍体积的去离子水洗涤次后离心，倒去上清液，留作转化用。菌体转化条件转化底物纯度为95%的棘球白素B精制品，此精制品的制备工艺详见中国专利 “一种制备高纯度阿尼芬净前体Echinocandin B的方法”，申请号200810042128. 9，用含 10% DMSO的水溶解。转化条件将培养好的转化用菌体放入新鲜的pH为6. 8、浓度0. IM磷酸缓冲液悬浮，加入底物混勻，30°C 250r/min进行转化反应3小时得到最终含棘球白素B母核的转化液。
具体实施例方式ECB Nucleus HPLC 检测条件色谱柱=ODS-C18 (5 μ )；检测波长222nm；
流动相乙酸铵缓冲液乙腈=94 6流速0. 8ml/min柱温40°C实施例1-3考察转化液pH对大孔吸附树脂的影响实施例1菌体转化完成后，将转化液抽滤，得到2. 5L过滤液，pH调整为7后上大孔苯乙烯非极性吸附树脂，吸附时没有漏液，上柱吸附后用10 1的水甲醇溶液3CV脱盐除DMS0， 再用1 1甲醇水溶液2CV将ECBNucleus集中洗下，得到ECB Nucleus初制品，纯度为 68 %。再将其上大孔丙烯酸树脂，上柱后用2CV乙醇除杂，再用0. OlN盐酸水溶液2CV将 ECB Nucleus洗下，得到ECB Nucleus精制品，其纯度为96. 6%，将其pH用NaOH调整到4-5 后浓缩，并将浓缩液冻干制得ECB Nucleus冻干纯品，纯度为96. 4%，总收率为64%。实施例2菌体转化完成后，将转化液抽滤，得到2. 7L过滤液，pH调整为6后上大孔苯乙烯非极性吸附树脂，上柱后HPLC检测有10%左右漏液，上柱吸附后用10 1的水甲醇溶液 3CV脱盐除DMS0，再用1 1甲醇水溶液4CV将ECB Nucleus洗下，得到ECB Nucleus初制品，纯度为69%。再将其上大孔丙烯酸树脂，上柱后用3CV乙醇除杂，再用0. OlN盐酸水溶液2CV将ECB Nucleus洗下，得到ECB Nucleus精制品，其纯度为97. 1%,将其pH用NaOH 调整到4-5后浓缩，并将浓缩液冻干制得ECBNucleus冻干纯品，纯度为97. 1%，总收率为 52%。实施例3菌体转化完成后，将转化液抽滤，得到2. 42L过滤液，pH调整为8后上大孔苯乙烯非极性吸附树脂，吸附时没有漏液，上柱吸附后用10 1的水甲醇溶液2CV脱盐除DMS0，再用1 1甲醇水溶液2CV将ECBNucleus洗下，得到ECB Nucleus初制品，纯度为63%。再将其上大孔丙烯酸树脂，上柱后用2CV乙醇除杂，再用0. OlN盐酸水溶液2CV将ECBNucleus 洗下，得到ECB Nucleus精制品，其纯度为93. 9%，将其pH用NaOH调整到4_5后浓缩，并将浓缩液冻干制得ECB Nucleus冻干纯品，纯度为94. 0%，总收率为71 %。实施例4-6考察大孔吸附树脂吸附后不同比例的甲醇水预洗效果实施例4菌体转化完成后，将转化液抽滤，得到1. 8L过滤液，pH调整为7后上大孔苯乙烯非极性吸附树脂，吸附时没有漏液，上柱吸附后用含9 %甲醇的水溶液4CV脱盐除DMS0，再用 1 1甲醇水溶液2CV将ECBNucleus洗下，得到ECB Nucleus初制品，纯度为62. 3%。再将其上大孔丙烯酸树脂，上柱后用2CV甲醇除杂，再用0. OlN盐酸水溶液2CV将ECB Nucleus 洗下，得到ECB Nucleus精制品，其纯度为95. 4%，将其pH用NaOH调整到4_5后浓缩，并将浓缩液冻干制得ECB Nucleus冻干纯品，纯度为95. 2%，总收率为66%。实施例5菌体转化完成后，将转化液抽滤，得到1. 73L过滤液，pH调整为7后上大孔苯乙烯非极性吸附树脂，吸附时没有漏液，上柱吸附后用含5%甲醇的水溶液4CV脱盐除DMS0，再用1 1甲醇水溶液2CV将ECBNucleus洗下，得到ECB Nucleus初制品，纯度为58. 4%。 再将其上大孔丙烯酸树脂，上柱后用2CV甲醇除杂，再用0. OlN盐酸水溶液2CV将ECBNucleus洗下，得到ECB Nucleus精制品，其纯度为92. 6%，将其pH用NaOH调整到4-5后浓缩，并将浓缩液冻干制得ECB Nucleus冻干纯品，纯度为92. 5%，总收率为74%。实施例6菌体转化完成后，将转化液抽滤，得到1. 9L过滤液，pH调整为7后上大孔苯乙烯非极性吸附树脂，吸附时没有漏液，上柱吸附后用含15%甲醇的水溶液4CV脱盐除DMS0，再用 1 1甲醇水溶液2CV将ECBNucleus洗下，得到ECB Nucleus初制品，纯度为71. 3%。再将其上大孔丙烯酸树脂，上柱后用2CV甲醇除杂，再用0. OlN盐酸水溶液2CV将ECB Nucleus 洗下，得到ECB Nucleus精制品，其纯度为97. 1 %，将其pH用NaOH调整到4_5后浓缩，并将浓缩液冻干制得ECB Nucleus冻干纯品，纯度为97. 1 %，总收率为58%。实施例7-8考察大孔吸附树脂洗脱时的甲醇水比例实施例7菌体转化完成后，将转化液抽滤，得到2. 3L过滤液，pH调整为7后上大孔苯乙烯非极性吸附树脂，吸附时没有漏液，上柱吸附后用含10%甲醇的水溶液2CV脱盐除DMS0，再用100%甲醇4CV将ECB Nucleus洗下，得到ECB Nucleus初制品，纯度为58. 6%，洗脱液颜色较深。再将其上大孔丙烯酸树脂，上柱后用4CV乙醇除杂，再用0. OlN盐酸水溶液4CV 将ECB Nucleus洗下，得到ECB Nucleus精制品，其纯度为94. 7%，其中含有少量色素，将其 PH用NaOH调整到4-5后浓缩，并将浓缩液冻干制得ECB Nucleus冻干纯品，冻干粉末呈淡黄色，纯度为94.6%，总收率为69%。实施例8菌体转化完成后，将转化液抽滤，得到2. IL过滤液，pH调整为7后上大孔苯乙烯非极性吸附树脂，吸附时没有漏液，上柱吸附后用含10%甲醇的水溶液2CV脱盐除DMS0，再用含75%甲醇的水溶液4CV将ECBNucleus洗下，得到ECB Nucleus初制品，纯度为61. 2%, 洗脱液颜色较深。再将其上大孔丙烯酸树脂，上柱后用4CV乙醇除杂，再用0. OlN盐酸水溶液4CV将ECB Nucleus洗下，得到ECB Nucleus精制品，其纯度为95. 1 %，其中含有少量色素，将其PH用NaOH调整到4-5后浓缩，并将浓缩液冻干制得ECB Nucleus冻干纯品，冻干粉末呈浅黄色，纯度为95. 1 %，总收率为70 %。实施例9-10考察大孔弱酸树脂洗脱时盐酸浓度实施例9菌体转化完成后，将转化液抽滤，得到1. 5L过滤液，pH调整为7后上大孔苯乙烯非极性吸附树脂，吸附时没有漏液，上柱吸附后用含10%甲醇的水溶液2CV脱盐除DMS0，再用含50%甲醇的水溶液2CV将ECBNucleus洗下，得到ECB Nucleus初制品，纯度为65. 8%。 再将其上大孔丙烯酸树脂，上柱后用2CV乙醇除杂，再用0. 005N盐酸水溶液2CV将ECB Nucleus洗下，得到ECB Nucleus精制品，其纯度为97. 3%，将其pH用NaOH调整到4-5后浓缩，并将浓缩液冻干制得ECB Nucleus冻干纯品，纯度为97. 2%，总收率为55%。实施例10菌体转化完成后，将转化液抽滤，得到1. 37L过滤液，pH调整为7后上大孔苯乙烯非极性吸附树脂，吸附时没有漏液，上柱吸附后用含10%甲醇的水溶液2CV脱盐除DMS0， 再用含50 %甲醇的水溶液2CV将ECBNucIeus洗下，得到ECB Nucleus初制品，纯度为 64. 9 %。再将其上大孔丙烯酸树脂，上柱后用2CV乙醇除杂，再用0. 5N盐酸水溶液2CV将ECBNucleus洗下，得到ECB Nucleus精制品，其纯度为92. 7%,将其pH用NaOH调整到4-5 后浓缩，并将浓缩液冻干制得ECB Nucleus冻干纯品，纯度为92. 6%，总收率为72%。实施例11-14考察不同来源的发酵液对转化的影响对转化菌体游动放线菌NRRL 12052进行自然分离得到三株生长状态良好的菌株 Si、S2、S3，并按照相同的培养方法进行菌体培养，将培养好的菌体进行转化工艺研究。实施例11将转化菌体Sl培养好后进行转化，转化后将转化液抽滤，得到1. 8L过滤液，pH 调整为7后上大孔苯乙烯非极性吸附树脂，吸附时没有漏液，上柱吸附后用10 1的水甲醇溶液3CV脱盐除DMS0，再用1 1甲醇水溶液3CV将ECB Nucleus集中洗下，得到ECB Nucleus初制品，纯度为64%。再将其上大孔丙烯酸树脂，上柱后用2CV乙醇除杂，再用 0. OlN盐酸水溶液2CV将ECB Nucleus洗下，得到ECB Nucleus精制品，其纯度为94.5%, 将其PH用NaOH调整到4-5后浓缩，并将浓缩液冻干制得ECB Nucleus冻干纯品，纯度为 94. 4%，总收率为61%。实施例12将转化菌体S2培养好后进行转化，转化后将转化液抽滤，得到1. 62L过滤液，pH 调整为7后上大孔苯乙烯非极性吸附树脂，吸附时没有漏液，上柱吸附后用10 1的水甲醇溶液3CV脱盐除DMS0，再用1 1甲醇水溶液3CV将ECB Nucleus集中洗下，得到ECB Nucleus初制品，纯度为69%。再将其上大孔丙烯酸树脂，上柱后用3CV乙醇除杂，再用 0. OlN盐酸水溶液2CV将ECB Nucleus洗下，得到ECB Nucleus精制品，其纯度为95.9%, 将其PH用NaOH调整到4-5后浓缩，并将浓缩液冻干制得ECB Nucleus冻干纯品，纯度为 96%，总收率为58%实施例13将转化菌体S3培养好后进行转化，转化后将转化液抽滤，得到1. 73L过滤液，pH 调整为7后上大孔苯乙烯非极性吸附树脂，吸附时没有漏液，上柱吸附后用10 1的水甲醇溶液3CV脱盐除DMS0，再用1 1甲醇水溶液2CV将ECB Nucleus集中洗下，得到ECB Nucleus初制品，纯度为59%。再将其上大孔丙烯酸树脂，上柱后用3CV乙醇除杂，再用 0. OlN盐酸水溶液2CV将ECB Nucleus洗下，得到ECB Nucleus精制品，其纯度为93.8%, 将其PH用NaOH调整到4-5后浓缩，并将浓缩液冻干制得ECB Nucleus冻干纯品，纯度为 93. 7%，总收率为65%对转化菌体游动放线菌NRRL 12052进行基因改造，先构建一个含有酰基转移酶的质粒PSET152，再将其导入转化态的大肠杆菌中复制，最后通过结合转移导入到野生菌 NRRL12052中，挑选阳性克隆子，得到基因工程菌G1，并按照相同的培养方法进行菌体培养，将培养好的菌体进行转化工艺研究。实施例14将转化菌体Gl培养好后进行转化，将转化液抽滤，得到2. 46L过滤液，pH调整为7 后上大孔苯乙烯非极性吸附树脂，吸附时没有漏液，上柱吸附后用10 1的水甲醇溶液2CV 脱盐除DMS0，再用1 1甲醇水溶液3CV将ECB Nucleus集中洗下，得到ECB Nucleus初制品，纯度为71%。再将其上大孔丙烯酸树脂，上柱后用2CV乙醇除杂，再用0. OlN盐酸水溶液2CV将ECB Nucleus洗下，得到ECB Nucleus精制品，其纯度为96.8%,将其pH用NaOH调整到4-5后浓缩，并将浓缩液冻干制得ECB Nucleus冻干纯品，纯度为96. 6%，总收率为 66%。
权利要求
1.棘球白素B母核的分离方法，该方法包括如下步骤1)含棘球白素B母核的转化液抽滤后，将滤液PH调整到5-8，上大孔苯乙烯非极性吸附树脂，用水甲醇溶液洗脱，再用甲醇水溶液将棘球白素B母核集中洗下；2)将步骤1)收集液上大孔丙烯酸树脂，再用酸水溶液将棘球白素B母核集中洗下；3)将步骤2)收集液的pH调整到4-5，然后浓缩冻干制得棘球白素B母核。
2.根据权利要求1所述的棘球白素B母核的分离方法，其特征在于，所述含棘球白素B 母核的转化液按照下列步骤得到将培养好的转化用菌体放入PH为6. 0-7. 0的磷酸缓冲液悬浮，加入棘球白素B母核精制品混勻，25-30°C下进行转化反应3-5小时，得到含棘球白素 B母核的转化液。
3.根据权利要求1所述的棘球白素B母核的分离方法，其特征在于，步骤1)中水甲醇溶液的浓度为5% -15%。
4.根据权利要求3所述的棘球白素B母核的分离方法，其特征在于，步骤1)中水甲醇溶液的浓度为9%。
5.根据权利要求1所述的棘球白素B母核的分离方法，其特征在于，步骤1)中甲醇水溶液的浓度为33% -100%。
6.根据权利要求5所述的棘球白素B母核的分离方法，其特征在于，步骤1)中甲醇水溶液的浓度为50%。
7.根据权利要求1所述的棘球白素B母核的分离方法，其特征在于，步骤1)中使用的水甲醇溶液和甲醇水溶液的体积均为2-4CV ；步骤2、中使用的酸水溶液的体积为2-4CV。
8.根据权利要求1所述的棘球白素B母核的分离方法，其特征在于，步骤2)中的大孔丙烯酸树脂用乙醇或甲醇预洗除杂。
9.根据权利要求1所述的棘球白素B母核的分离方法，其特征在于，步骤2)中的酸水溶液选自盐酸水溶液、硝酸水溶液或磷酸水溶液。
10.根据权利要求9所述的棘球白素B母核的分离方法，其特征在于，步骤2)中的酸水溶液为盐酸水溶液。
11.根据权利要求1所述的棘球白素B母核的分离方法，其特征在于，步骤2)中的酸水溶液的浓度为0. 005-0. 5N。
12.根据权利要求11所述的棘球白素B母核的分离方法，其特征在于，步骤2)中的酸水溶液的浓度为0. OlN0
13.根据权利要求1所述的棘球白素B母核的分离方法，其特征在于，步骤1)和2)中的上柱流速为CV/min，洗脱流速为2% CV/min。
全文摘要
本发明提供一种棘球白素B母核的分离方法，该方法包括如下步骤1)含棘球白素B母核的转化液抽滤后，将滤液pH调整到5-8，上大孔苯乙烯非极性吸附树脂，用水甲醇溶液洗脱，再用甲醇水溶液将棘球白素B母核集中洗下；2)将步骤1)收集液上大孔丙烯酸树脂，再用酸水溶液将棘球白素B母核集中洗下；3)将步骤2)收集液的pH调整到4-5，然后浓缩冻干制得棘球白素B母核。该方法不仅能够很好的去除色素，且适合大规模的工业生产，具有很好的商业价值。本发明方法能将棘球白素B母核的最终纯度提高到92％以上。
文档编号C12P21/04GK102336817SQ201010229390
公开日2012年2月1日 申请日期2010年7月16日 优先权日2010年7月16日
发明者俞建生, 卢亮, 姚黎栋, 李继安, 樊伟明, 石飞燕, 秋祥, 陈代杰 申请人:上海医药工业研究院, 浙江震元制药有限公司