专利名称：一种诱导扇贝组织细胞体外转化的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种诱导扇贝组织细胞体外转化的方法，即 利用重组泛嗜性慢病毒介导外源基因整合到体外培养的栉孔扇贝细胞中。
背景技术：
海洋双壳类具较高的经济价值，是我国海水养殖业的重要组成部分。建立海洋双 壳类细胞的体外培养体系，将为其基础生物学、病原体侵染机制、新品种开发研究以及功能 基因的分析等搭建平台，并最终为扇贝细胞系的建立构建基础。但在目前的研究中多涉及 添加促进细胞分裂的营养因子，其研究过程漫长、工作量大且进展缓慢。对比于其他组织，心脏组织由于心脏围心膜的存在，在体外培养时较易克服微生 物的污染，但是心脏细胞属于终末分化细胞，退出了细胞分裂周期，导致体外培养时间有 限，所以采用传统方法进行心脏细胞体外培养比较困难。工作量大且易发生污染。因此急 需建立一种新的体外转化方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种诱导扇贝组织细胞体外转化的方法，以克服现有技术的 不足。本发明特别使用重组泛嗜性慢病毒感染扇贝体外培养心脏细胞，使已经退出细胞 分裂周期的心脏细胞重获分裂增殖能力，表明该方法用在具有一定分裂能力的扇贝其他组 织细胞中同样可以获得成功转化的细胞，具有通用性。本发明的技术方案如下构建重组SV40LT以及报告基因GFP的慢病毒表达质粒， 并利用293FT细胞包装出能够表达目的基因的重组泛嗜性慢病毒；其特征在于使用重组泛 嗜性慢病毒感染扇贝体外培养组织细胞，并用浓度为2 7微克/毫升的灭瘟素筛选得到 产生荧光或具有分裂能力的转化细胞。扇贝体外培养心脏细胞的培养方法是首先将扇贝心脏组织样品，尤其是栉孔扇 贝心脏组织用煮沸的过滤海水清洗干净，在栉孔扇贝心脏组织专用消毒液中浸泡20分钟， 煮沸的过滤海水清洗后移至栉孔扇贝心脏组织剪切液中，剪切至1立方毫米大小后均勻排 布于含1. 5毫升培养基的25毫升培养瓶中，再置于23°C的生化培养箱中培养16 24小时， 之后每天替换2毫升栉孔扇贝心脏细胞培养基，至栉孔扇贝心脏细胞迁出后即得到栉孔扇 贝体外培养心脏细胞，每3天换液一次栉孔扇贝心脏细胞培养基，以维持体外培养心脏细 胞正常生长。所述的栉孔扇贝心脏细胞培养基配制方法首先在溶解了 13. 7克L15培养基粉末 的1升水溶液中添加NaCl 20. 2克、KCl 0. 54克、CaCl2O. 60克、MgSO4I克和MgCl23. 9克，成 为1100毫渗透摩尔的高渗透压的基本培养基，即使L15培养基粉末水溶液获得与煮沸的过 滤海水相近的渗透压；用0. 22微米的微孔滤膜过滤除菌；然后再添加已经过滤除菌的5% 胎牛血清、6毫摩尔钙离子、2毫摩尔L谷氨酰胺、50毫摩尔牛磺酸、100单位/毫升青霉素、100微克/毫升链霉素、50微克/毫升卡那霉素和1微克/毫升制霉菌素；最后调节PH值 至 7. 2 7. 4。所述的栉孔扇贝心脏组织专用消毒液配方是含有500单位/毫升青霉素、500微克 /毫升链霉素、100单位/毫升庆大霉素和2微克/毫升制霉菌素的煮沸的过滤海水的水溶 液。所述的栉孔扇贝心脏组织剪切液为煮沸的过滤海水或含5%胎牛血清的L15基本
培养基。所述的煮沸的过滤海水较已有的高压灭菌过滤海水及其制备方法更加简单、节省 时间，且能很好的达到除去过滤海水中微生物的目的。所述栉孔扇贝的组织细胞的重组泛嗜性慢病毒感染方法是将含1000 3000个重 组泛嗜性慢病毒的病毒液加入1毫升的栉孔扇贝心脏细胞培养基中，之后培养栉孔扇贝心 脏细胞12 16小时，同时加入6微克/毫升聚凝胺。所述的灭瘟素筛选方法为，使用上述重组泛嗜性慢病毒感染扇贝体外培养组织细 胞3 5天后，在2毫升扇贝组织细胞培养基中添加4 14微克灭瘟素对转化细胞进行培 养，每3 4天重新添加上述含有灭瘟素的培养基，培养7 10天呈现被筛选出的转化细 胞。本发明利用重组泛嗜性慢病毒高效的将外源基因转移到栉孔扇贝体外培养心脏 细胞中，将外源基因稳定的整合到栉孔扇贝心脏细胞基因组中，使该外源基因能够持续的 表达，促进细胞增殖，为进一步构建栉孔扇贝细胞系奠定基础。
具体实施例方式本发明首先将重组SV40LT以及报告基因GFP的慢病毒表达质粒，与商品化的包 装载体一同转染到293FT细胞中即产生重组泛嗜性慢病毒，收集含有重组泛嗜性慢病毒的 293FT细胞培养液并低温保存。然后将栉孔扇贝心脏组织样品用煮沸的过滤海水清洗3次，去除表面的微生物； 配制栉孔扇贝心脏组织专用消毒液，配方是含有500单位/毫升的青霉素、500微克/毫升 链霉素、100单位/毫升庆大霉素和2微克/毫升制霉菌素的煮沸的过滤海水的水溶液；使 用上述栉孔扇贝心脏组织专用消毒液浸泡心脏组织20分钟，煮沸的过滤海水清洗3次后移 至0. 5毫升栉孔扇贝心脏组织剪切液中，将心脏剪切至1立方毫米大小后均勻排布于含1. 5 毫升栉孔扇贝心脏细胞培养基的25毫升培养瓶中，再置于23°C的生化培养箱中培养16 24小时，之后每天替换2毫升栉孔扇贝心脏细胞培养基，1天 4天后心脏组织块周围迁出 大量细胞，即得到栉孔扇贝体外培养心脏细胞，随后每3天替换栉孔扇贝心脏细胞培养基2 毫升，以维持体外培养心脏细胞正常生长。诱导扇贝组织细胞体外转化的方法，将含1000 3000个重组泛嗜性慢病毒的病 毒液加入1毫升的栉孔扇贝心脏细胞培养基中，同时加入6微克/毫升聚凝胺，之后培养栉 孔扇贝心脏细胞12 16小时即完成扇贝组织细胞体外转化(即重组泛嗜性慢病毒成功感 染扇贝组织细胞，使重组SV40LT或报告基因GFP能够表达)。灭瘟素筛选转化细胞的方法使用上述重组泛嗜性慢病毒感染扇贝体外培养组织 细胞3 5天后，在2毫升扇贝组织细胞培养基中添加4 14微克灭瘟素对转化细胞进行
4培养，每3 4天重新添加上述含有灭瘟素的培养基，培养7 10天呈现被筛选出的转化 细胞。实施例1本发明首先根据已发表的SV40LT基因序列设计正、反向引物，扩增出2. Ikb的 SV40LT基因，在TOPO酶的作用下将SV40LT基因连接到慢病毒表达质粒中，获得重组慢 病毒表达质粒；采用促转染试剂Lipofectamine 2000将重组慢病毒表达质粒pLenti6/ V5-D-T0P0/LT转染包装细胞株293FT细胞，转染24h后，镜下观察，细胞与转染前相比，状态 较差，形状变圆，将转染72h时收集含有重组泛嗜性慢病毒的293FT细胞培养液，并-80°C保 存。将栉孔扇贝心脏组织样品用煮沸的过滤海水清洗3次，去除表面的微生物；栉孔 扇贝心脏组织专用消毒液是含有500单位/毫升的青霉素、500微克/毫升链霉素、100单 位/毫升的庆大霉素和2微克/毫升的制霉菌素的煮沸的过滤海水的水溶液；配制栉孔扇 贝心脏细胞培养基首先在溶解了 L15培养基粉末的水溶液中添加NaCl 20. 2克/升、KCl 0. 54克/升、CaCl2O. 60克/升、MgSO4I克/升和MgCl23. 9克/升；用0. 22微米的微孔滤 膜过滤除菌；然后再添加5%胎牛血清、6毫摩尔钙离子、2毫摩尔L谷氨酰胺、50毫摩尔牛 磺酸、100单位/毫升青霉素、100微克/毫升链霉素、50微克/毫升卡那霉素和1微克/毫 升制霉菌素；最后调节PH值至7. 2。使用上述栉孔扇贝心脏组织专用消毒液浸泡心脏组织 20分钟，煮沸的过滤海水清洗3次后移至0. 5毫升栉孔扇贝心脏组织剪切液中，将心脏剪切 至1立方毫米大小后均勻排布于含1. 5毫升栉孔扇贝心脏细胞培养基的25毫升培养瓶中， 再置于23°C的生化培养箱中培养16小时，之后每天替换2毫升栉孔扇贝心脏细胞培养基， 2天后心脏组织块迁出约4000个细胞，得到栉孔扇贝体外培养心脏细胞。将含约1000个重组泛嗜性慢病毒的病毒液加入1毫升的栉孔扇贝心脏细胞培养 基中，之后培养栉孔扇贝心脏细胞12小时，同时加入6微克/毫升聚凝胺。病毒感染3天 后，在2毫升栉孔扇贝心脏细胞培养基中添加4微克灭瘟素对转化细胞进行筛选，每3天重 新添加上述含有灭瘟素的培养基。筛选10天后，部分细胞脱落死亡，仍然贴壁的细胞出现 分裂现象。实施例2根据已发表的GFP基因序列设计正、反向引物，扩增出700bp的GFP基因。在TOPO 酶的作用下将GFP基因连接到慢病毒表达质粒中，获得重组慢病毒表达质粒；采用促转染 试剂Lipofectamine 2000将重组慢病毒表达质粒pLenti6/V5-D_T0P0/GFP转染包装细胞 株293FT细胞，转染24h后，镜下观察，细胞与转染前相比，状态较差，形状变圆，转染48h后 收集含有重组泛嗜性慢病毒的293FT细胞培养液并-80°C保存。将栉孔扇贝心脏组织用煮沸的过滤海水清洗3次，去除表面的微生物；栉孔扇贝 心脏组织专用消毒液是含有500单位/毫升的青霉素、500微克/毫升链霉素、100单位/毫 升的庆大霉素和2微克/毫升的制霉菌素的煮沸的过滤海水的水溶液；配制栉孔扇贝心脏 细胞培养基首先在溶解了 L15培养基粉末的溶液中添加NaCl 20. 2克/升、KCl 0. 54克 /升、CaCl2O. 60克/升、MgSO4I克/升和MgCl23. 9克/升；用0. 22微米的微孔滤膜过滤除 菌；然后再添加5%胎牛血清、6毫摩尔钙离子、2毫摩尔L谷氨酰胺、50毫摩尔牛磺酸、100 单位/毫升青霉素、100微克/毫升链霉素、50微克/毫升卡那霉素和1微克/毫升制霉菌素；最后调节PH值至7. 4。使用上述栉孔扇贝心脏组织专用消毒液浸泡心脏组织20分钟， 煮沸的过滤海水清洗3次后移至0. 5毫升栉孔扇贝心脏组织剪切液中，将心脏剪切至1立 方毫米大小后均勻排布于含1. 5毫升栉孔扇贝心脏细胞培养基的25毫升培养瓶中，再置于 23°C的生化培养箱中培养24小时，之后每天替换2毫升栉孔扇贝心脏细胞培养基；4天后 心脏组织块迁出约8000个细胞，得到栉孔扇贝体外培养心脏细胞。
将含约3000个重组泛嗜性慢病毒的病毒液加入1毫升的栉孔扇贝心脏细胞培养 基中，之后培养栉孔扇贝心脏细胞16小时，同时加入6微克/毫升聚凝胺。病毒感染5天 后，在2毫升栉孔扇贝心脏细胞培养基中添加14微克灭瘟素对转化细胞进行培养，每4天 重新添加上述含有灭瘟素的培养基。培养7天后，部分细胞脱落死亡，仍然贴壁的细胞在荧 光显微镜下可观察到GFP基因表达产物发出绿色荧光信号。
权利要求
一种诱导扇贝组织细胞体外转化的方法，包括构建重组SV40LT以及报告基因GFP的慢病毒表达质粒，并利用293FT细胞包装出能够表达目的基因的重组泛嗜性慢病毒，其特征在于使用重组泛嗜性慢病毒感染扇贝体外培养组织细胞，并用浓度为2～7微克/毫升的灭瘟素筛选得到产生荧光或具有分裂能力的扇贝体外培养组织转化细胞。
2.如权利要求1所述的诱导扇贝组织细胞体外转化的方法，其特征是所述的扇贝体外 培养的组织细胞是栉孔扇贝体外培养心脏细胞。
3.如权利要求1所述的诱导扇贝组织细胞体外转化的方法，其特征是所述的重组泛嗜 性慢病毒感染扇贝体外培养组织细胞的感染方法是将含1000 3000个重组泛嗜性慢病 毒的病毒液加入1毫升的扇贝组织细胞培养基中，同时加入6微克/毫升聚凝胺，培养扇贝 组织细胞12 16小时即完成诱导扇贝组织细胞体外转化。
4.如权利要求1所述的诱导扇贝组织细胞体外转化的方法，其特征是所述的灭瘟素筛 选方法使用上述重组泛嗜性慢病毒感染扇贝体外培养组织细胞3 5天后，在2毫升扇贝 组织细胞培养基中添加4 14微克灭瘟素对转化细胞进行培养，每3 4天重新添加上述 含有灭瘟素的培养基，培养7 10天呈现被筛选出的转化细胞。
5.如权利要求2所述的诱导扇贝组织细胞体外转化的方法，其特征是所述的栉孔扇贝 体外培养心脏细胞的培养方法是首先将栉孔扇贝心脏组织样品用煮沸的过滤海水清洗干 净，在栉孔扇贝心脏组织专用消毒液中浸泡20分钟，煮沸的过滤海水清洗后移至栉孔扇贝 心脏组织剪切液中，剪切至1立方毫米大小后均勻排布于含1. 5毫升培养基的25毫升培养 瓶中，再置于23°C的生化培养箱中培养16 24小时，之后每天替换2毫升栉孔扇贝心脏细 胞培养基，至栉孔扇贝心脏细胞迁出后即得到栉孔扇贝体外培养心脏细胞，每3天更换栉 孔扇贝心脏细胞培养基一次，以维持体外培养心脏细胞正常生长。
6.根据权利要求5所述的诱导扇贝组织细胞体外转化的方法，其特征是所述的栉孔扇 贝心脏细胞培养基配制方法首先在溶解了 13. 7克L15培养基粉末的1升水溶液中添加 NaCl 20. 2 克、KCl 0. 54 克、CaCl2O. 60 克、MgSO4I 克和 MgCl23. 9 克，用 0. 22 微米的微孔滤 膜过滤除菌；使用前再添加已过滤除菌的5%胎牛血清、6毫摩尔钙离子、2毫摩尔L谷氨酰 胺、50毫摩尔牛磺酸、100单位/毫升青霉素、100微克/毫升链霉素、50微克/毫升卡那霉 素和1微克/毫升制霉菌素；最后调节PH值至7. 2 7. 4即制成。
7.根据权利要求5所述的诱导扇贝组织细胞体外转化的方法，其特征是所述的栉孔扇 贝心脏组织专用消毒液是含有500单位/毫升青霉素、500微克/毫升链霉素、100单位/ 毫升庆大霉素和2微克/毫升制霉菌素的煮沸的过滤海水的水溶液。
8.根据权利要求5所述的诱导扇贝组织细胞体外转化的方法，其特征是所述的栉孔扇 贝心脏组织剪切液为煮沸的过滤海水或含5%胎牛血清的L15基本培养基。
全文摘要
本发明涉及一种诱导扇贝组织细胞体外转化的方法。包括构建重组SV40LT以及报告基因GFP的慢病毒表达质粒，并利用293FT细胞包装出能够表达目的基因的重组泛嗜性慢病毒；其特征在于使用重组泛嗜性慢病毒感染扇贝体外培养组织细胞，尤其是栉孔扇贝体外培养心脏细胞，并用灭瘟素筛选得到产生荧光或具有分裂能力的转化细胞。本发明利用重组泛嗜性慢病毒高效的将外源基因转移到栉孔扇贝体外培养心脏细胞中，将外源基因稳定的整合到栉孔扇贝心脏细胞基因组中，使该外源基因能够持续的表达，促进细胞增殖分裂，为进一步构建栉孔扇贝细胞系奠定基础。
文档编号C12N15/867GK101935676SQ20101025818
公开日2011年1月5日 申请日期2010年8月20日 优先权日2010年8月20日
发明者孙大鹏, 张志峰, 晏萌, 林娜, 王 华, 邵明瑜 申请人:中国海洋大学