专利名称：一种栉孔扇贝心脏细胞体外培养方法
技术领域：
本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种栉孔扇贝心脏细胞体外培养方法。
背景技术：
海洋双壳类具较高的经济价值，是我国海水养殖业的重要组成部分，然而近年来， 我国沿海地区养殖贝类大规模死亡事件频繁发生，使贝类养殖业遭受重大的经济损失，而 目前的研究多集中在电镜水平，仅能从细胞结构改变加以分析，难以得出确切的致病机理。 而建立海洋双壳类细胞的体外培养体系，将从细胞和分子水平揭示宿主-病原体作用机 理，构建合适的诊断工具。此外，海洋双壳类细胞培养在经济品种生长及繁殖调控、遗传育 种、环境检测、活性物质开发等方面具有巨大的应用前景。由于海洋双壳类大部分器官直接与海水接触，被各种微生物及原生动物污染，常 导致组织消毒不彻底，原代培养遭受污染；同时没有专门为软体动物设计的培养基，很难满 足其体外培养细胞的营养代谢需求，迫切需要建立一种海洋双壳类细胞培养的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种栉孔扇贝心脏细胞的体外培养方法，弥补现有技术的不足。本发明的技术方案首先将栉孔扇贝心脏组织样品用煮沸的过滤海水清洗干净， 在栉孔扇贝心脏组织专用消毒液中浸泡20分钟，煮沸的过滤海水清洗后移至栉孔扇贝心 脏组织剪切液中，剪切至1立方毫米大小后均勻排布于含1. 5毫升培养基的25毫升培养瓶 中，再置于20 23°C的生化培养箱中培养16 24小时，之后每天替换2毫升栉孔扇贝心 脏细胞培养基，至栉孔扇贝心脏细胞迁出后即得到栉孔扇贝体外培养心脏细胞，每3 7天 换栉孔扇贝心脏细胞培养基一次，以维持体外培养的心脏细胞正常生长。所述的栉孔扇贝心脏细胞培养基配制方法首先在溶解了 13. 7克商品化的L15 培养基粉末的1升水溶液中添加NaCl 20. 2克、KCl 0. 54克、CaCl2O. 60克、MgSO4I克和 MgCl23. 9克，成为1100毫渗透摩尔的高渗透压的基本培养基，即使L15培养基粉末水溶液 获得与煮沸的过滤海水相近的渗透压；然后再添加5%胎牛血清、6毫摩尔钙离子、2毫摩尔 L谷氨酰胺、50毫摩尔牛磺酸、100单位/毫升青霉素、100微克/毫升链霉素、50微克/毫 升卡那霉素和1微克/毫升制霉菌素；最后用0. 22微米的微孔滤膜过滤除菌，调节PH值至 7. 2 7. 4。所述栉孔扇贝心脏组织专用消毒液配方是含有500单位/毫升青霉素、500微克/ 毫升链霉素、100单位/毫升庆大霉素和2微克/毫升制霉菌素的煮沸的过滤海水的水溶 液。所述栉孔扇贝心脏组织剪切液为煮沸的过滤海水或含5%胎牛血清的L15基本培养基。所述的煮沸的过滤海水较已有的高压灭菌过滤海水及其制备方法更加简单、节省时间，且能很好的达到除去过滤海水中微生物的目的。本发明在启动栉孔扇贝心脏细胞原代培养过程中选用合适的抗生素种类和浓度， 能够有效克服细菌等微生物污染，同时对细胞活力无影响。在栉孔扇贝心脏细胞培养基中 添加维持细胞代谢需求的若干种营养因子，实现栉孔扇贝心脏细胞体外的较长期培养。本 发明的方法成本低效率高，为后续获得栉孔扇贝心脏细胞系建立基础。
具体实施例方式首先将栉孔扇贝心脏组织样品用煮沸的过滤海水清洗3次，去除表面的微生物； 配制栉孔扇贝心脏组织专用消毒液，配方是含有500单位/毫升青霉素、500微克/毫升链 霉素、100单位/毫升庆大霉素和2微克/毫升制霉菌素的煮沸的过滤海水的水溶液；使用 上述栉孔扇贝心脏组织专用消毒液浸泡心脏组织20分钟，煮沸的过滤海水清洗3次后移至 0. 5毫升栉孔扇贝心脏组织剪切液中，将心脏剪切至1立方毫米大小后均勻排布于含1. 5 毫升栉孔扇贝心脏细胞培养基的25毫升培养瓶中，再置于20 23°C的生化培养箱中培养 16 24小时，之后每天替换2毫升栉孔扇贝心脏细胞培养基，1天 4天后心脏组织块周 围迁出大量细胞，即得到栉孔扇贝体外培养心脏细胞，随后每3 7天替换栉孔扇贝心脏细 胞培养基2毫升，以维持体外培养的心脏细胞正常生长。所述的栉孔扇贝心脏细胞培养基配制方法首先将13. 7克L15培养基粉末溶于1 升双蒸水，在其中添加NaCl 20. 2克、KCl 0. 54克、CaCl2O. 60克、MgSO4I克和MgCl23. 9克， 调节渗透压至1100毫渗透摩尔，用0. 22微米的微孔滤膜过滤除菌，得到的L15高渗基本培 养基分装在100毫升的小瓶中；使用前添加过滤除菌的5%胎牛血清、6毫摩尔钙离子、2毫 摩尔L谷氨酰胺、50毫摩尔牛磺酸、100单位/毫升青霉素、100微克/毫升链霉素，50微克 /毫升卡那霉素和1微克/毫升制霉菌素，最后调节pH值至7. 2 7. 4。所述的栉孔扇贝心脏组织专用消毒液是含有500单位/毫升的青霉素、500微克/ 毫升链霉素、100单位/毫升庆大霉素和2微克/毫升制霉菌素的煮沸过滤海水的水溶液。所述栉孔扇贝心脏组织剪切液为煮沸的过滤海水或含5%胎牛血清的L15基本培 养基。所述的煮沸的过滤海水为在锥形瓶中煮沸15 20min后的过滤海水。实施例1将栉孔扇贝心脏组织样品用煮沸的过滤海水清洗3次，去除表面的微生物；栉孔 扇贝心脏组织专用消毒液是含有500单位/毫升青霉素、500微克/毫升链霉素、100单位 /毫升庆大霉素和2微克/毫升制霉菌素的煮沸的过滤海水的水溶液。本发明的栉孔扇贝心脏细胞培养基的配制首先在溶解了 L15培养基粉末的水溶 液中添加 NaCl 20. 2 克 / 升、KCl 0. 54 克 / 升、CaCl2O. 60 克 / 升、MgSO4I 克 / 升和 MgCl23. 9 克/升，用0. 22微米的微孔滤膜过滤除菌，然后再添加5%胎牛血清、6毫摩尔钙离子、2毫 摩尔L谷氨酰胺、50毫摩尔牛磺酸、100单位/毫升青霉素、100微克/毫升链霉素、50微克 /毫升卡那霉素和1微克/毫升制霉菌素；最后调节PH值至7. 2。使用上述栉孔扇贝心脏 组织专用消毒液浸泡心脏组织20分钟，煮沸的过滤海水清洗3次后移至0. 5毫升栉孔扇贝 心脏组织剪切液中，将心脏剪切至1立方毫米大小后均勻排布于含1. 5毫升栉孔扇贝心脏 细胞培养基的25毫升培养瓶中，再置于23°C的生化培养箱中培养16小时，之后每天替换2 毫升栉孔扇贝心脏细胞培养基，3天后培养瓶中每平方厘米内细菌数小于50 ;1天后心脏组织块迁出约5000个细胞，即得到栉孔扇贝体外培养心脏细胞，并且心脏组织块以及其周围 细胞发生节律性收缩；随后每7天替换栉孔扇贝心脏细胞培养基2毫升，栉孔扇贝体外培养 心脏细胞能够在体外较长期存活。实施例2将栉孔扇贝心脏组织样品用煮沸的过滤海水清洗3次，去除表面的微生物；栉孔 扇贝心脏组织专用消毒液是含有500单位/毫升青霉素、500微克/毫升链霉素、100单位 /毫升庆大霉素和2微克/毫升制霉菌素的煮沸的过滤海水的水溶液；配制栉孔扇贝心脏 细胞培养基首先在溶解了 L15培养基粉末的溶液中添加NaCl 20. 2克/升、KCl 0. 54克 /升、CaCl2O. 60克/升、MgSO4I克/升和MgCl23. 9克/升，用0. 22微米的微孔滤膜过滤除 菌，然后再添加5%胎牛血清、6毫摩尔钙离子、2毫摩尔L谷氨酰胺、50毫摩尔牛磺酸、100 单位/毫升青霉素、100微克/毫升链霉素、50微克/毫升卡那霉素和1微克/毫升制霉菌 素；最后调节PH值至7. 4。使用上述栉孔扇贝心脏组织专用消毒液浸泡心脏组织20分钟， 煮沸的过滤海水清洗3次后移至0. 5毫升栉孔扇贝心脏组织剪切液中，将心脏剪切至1立 方毫米大小后均勻排布于含1. 5毫升栉孔扇贝心脏细胞培养基的25毫升培养瓶中，再置于 200C的生化培养箱中培养24小时，之后每天替换2毫升栉孔扇贝心脏细胞培养基，4天后培 养瓶中每平方厘米内细菌数小于50 ；4天后心脏组织块迁出约10000个细胞，即得到栉孔扇 贝体外培养心脏细胞，心脏组织块以及其周围细胞发生节律性收缩；随后每3天替换栉孔 扇贝心脏细胞培养基2毫升，栉孔扇贝体外培养心脏细胞能够在体外较长期存活。
权利要求
一种栉孔扇贝心脏细胞体外培养方法，其特征是首先将栉孔扇贝心脏组织样品用煮沸的过滤海水清洗干净，在栉孔扇贝心脏组织专用消毒液中浸泡20分钟，又在煮沸的过滤海水清洗后移至栉孔扇贝心脏组织剪切液中，并剪切至1立方毫米大小后，均布于含1.5毫升栉孔扇贝心脏细胞培养基的25毫升培养瓶中，再置于20～23℃的生化培养箱中培养16～24小时，之后每天替换2毫升栉孔扇贝心脏细胞培养基，至栉孔扇贝心脏细胞迁出后即得到栉孔扇贝体外培养心脏细胞，每3～7天换栉孔扇贝心脏细胞培养基一次，以维持栉孔扇贝体外培养心脏细胞正常生长。
2.根据权利要求1所述的栉孔扇贝心脏细胞体外培养方法，其特征是所述的栉孔扇贝 心脏细胞培养基的配制方法是首先在溶解了 13. 7克L15培养基粉末的1升水溶液中添加 NaCl 20. 2 克、KCl 0. 54 克、CaCl2O. 60 克、MgSO4I 克和 MgCl23. 9 克，用 0. 22 微米的微孔滤 膜过滤除菌；添加5%胎牛血清、6毫摩尔钙离子、2毫摩尔L谷氨酰胺、50毫摩尔牛磺酸、 100单位/毫升青霉素、100微克/毫升链霉素，50微克/毫升卡那霉素和1微克/毫升制 霉菌素，调节PH值至7. 2 7. 4即制成。
3.根据权利要求1所述的栉孔扇贝心脏细胞体外培养方法，其特征是所述的栉孔扇贝 心脏组织专用消毒液是含有500单位/毫升青霉素、500微克/毫升链霉素、100单位/毫 升庆大霉素和2微克/毫升制霉菌素的煮沸的过滤海水的水溶液。
4.根据权利要求1所述的栉孔扇贝心脏细胞体外培养方法，其特征是所述栉孔扇贝心 脏组织剪切液为煮沸的过滤海水或含5%胎牛血清的L15基本培养基。全文摘要
本发明涉及一种栉孔扇贝心脏细胞体外培养方法，其特征是首先将栉孔扇贝心脏组织清洗干净，消毒液中浸泡20分钟，又在煮沸的过滤海水清洗后移至剪切液中剪切至1立方毫米大小后，均布于含1.5毫升培养基的培养瓶中，再置于20～23℃的生化培养箱中培养16～24小时，之后每天替换2毫升培养基，至栉孔扇贝心脏细胞迁出后即得到体外培养心脏细胞，每3～7天换培养基一次，以维持栉孔扇贝体外培养心脏细胞正常生长。本发明成本低且效率高，在启动栉孔扇贝心脏细胞原代培养过程中选用合适的抗生素，能够有效克服细菌等微生物污染，在栉孔扇贝心脏细胞培养基中添加维持细胞代谢需求的若干种营养因子，实现栉孔扇贝心脏细胞体外的较长期培养。
文档编号C12N5/07GK101899415SQ201010258209
公开日2010年12月1日 申请日期2010年8月20日 优先权日2010年8月20日
发明者张志峰, 晏萌, 林娜, 王 华, 邵明瑜 申请人:中国海洋大学