专利名称：一种检测都柏林念珠菌的dna探针、基因芯片及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测都柏林念珠菌的DNA探针、基因芯 片及其应用。
背景技术：
侵袭性真菌感染是真菌入侵人体而导致血液感染、各个脏器感染或全身播散的严 重感染。近20年来侵袭性真菌感染的发病呈明显增长趋势，这与大量应用广谱抗生素、抗 癌放疗、化疗以及其他免疫抑制剂、类固醇药物、器官移植、静脉插管和各种侵袭性操作有关。
侵袭性真菌感染主要的致病真菌有念珠菌属、曲霉属、隐球菌属等条件致病真菌， 还有组织胞浆菌、皮炎芽生菌、孢子丝菌等地方流行性致病真菌。不同环境下，感染的真菌 种类不同。侵袭性真菌感染早期没有特异性表现，所以很容易被掩盖，病死率很高。
目前临床常用的检测真菌的技术主要有
(一 )镜检及培养、鉴定如六胺银染色、PAS染色、银氨G-S染色法、10% KOH法 以及真菌培养法是临床最常用的鉴定手段，但直接镜检特异性差、敏感性不足，不能鉴定出 真菌种类。真菌培养虽能鉴定真菌种类，但培养条件苛刻，培养时间长，假阴性高，敏感性不 足，无法辅助临床治疗。
(二)免疫学方法免疫学方法的基本原理是利用抗原与抗体的特异结合，来达到 相互间的特异探察。该法主要用于检测真菌的抗原、抗体、代谢产物及细胞成分。能根据真 菌抗原性的不同将真菌分类。但抗体的特异性限制了该项技术的发展。
免疫组化、酶联免疫吸附试验、免疫印迹法及凝集反应都是基于免疫学方法检测 真菌的手段，但目前广泛应用于临床的仅有G试验，G试验检测的是真菌的细胞壁成分(1， 3) - β -D-葡聚糖，人体的吞噬细胞吞噬真菌后，能持续释放该物质，使血液及体液中含量 增高(浅部真菌感染无类似现象)。适用于除隐球菌和接合菌外的所有深部真菌感染的早 期诊断，尤其是念珠菌和曲霉菌，但不能确定菌种。临床应用中发现有诸多假阳性可能，例 如
(1)使用纤维素膜进行血透标本或患者暴露于纱布或其他含有葡聚糖的材料；
(2)静脉输注免疫球蛋白、白蛋白、凝血因子或血液制品；
(3)链球菌血症；
(4)操作者处理标本时存在污染。
另外，使用多糖类抗癌药物、放化疗造成的粘膜损伤导致食物中的葡聚糖或定植 的念珠菌经胃肠道进入血液等也可能造成假阳性。
(三)分子生物学技术
包括原位杂交、聚合酶链反应、DNA中G+C mol %含量测定、随机扩增多态性 DNA(RAPD)分析、限制性内切酶多态性分析(RFLP)等，但上述技术均耗时耗力，不具有高通 量的特点，不能用少量的样本快速同时检测多种可能存在的真菌，因此多局限于实验室研3究，尚不能真正应用于临床。 发明内容
本发明的目的是提供一种检测都柏林念珠菌的DNA探针，具有SEQ ID No. 1所示 序列，其与都柏林念珠菌DNA特异性结合，检测都柏林念珠菌灵敏度高。
本发明所述DNA探针可广泛应用于生物学、医学领域，如与以PCR技术为基础的核 酸杂交技术结合，进行生物学分析或临床诊断。
本发明结合基因芯片技术，可实现小样本、高通量、特异、快速、自动化检测都柏林 念珠菌的目的。本发明提供的一种用于真菌检测的基因芯片，通过将特异性寡核苷酸探针 固定在固相载体表面形成，所述寡核苷酸探针包含具有SEQ ID No. 1所示序列的DNA探针。 探针、引物与真菌目的基因之间的关系如表1所示。
表1.本发明所述基因芯片所使用的引物及探针
权利要求
1.一种用于检测都柏林念珠菌的DNA探针，具有SEQ ID No. 1所示序列。
2.一种用于都柏林念珠菌检测的基因芯片，通过将寡核苷酸探针固定在固相载体表面 形成，其特征在于，所述寡核苷酸探针包含权利要求1所述DNA探针。
3.根据权利要求2所述的基因芯片，其特征在于，所述固相载体选自硝酸纤维素膜、尼 龙膜、聚苯乙烯、玻璃片、硅片、微粒和塑料片。
4.根据权利要求2或3所述的基因芯片，其特征在于，所述寡核苷酸探针还包括阳性对 照探针、阴性对照探针。
5.根据权利要求4所述的基因芯片，其特征在于，所述阳性对照探针如SEQID No. 4所示。
6.根据权利要求4所述的基因芯片，其特征在于，所述阴性对照探针如SEQID No. 5所示。
7.一种用于检测都柏林念珠菌的试剂盒，包含权利要求1所述DNA探针。
8.一种对可能含都柏林念珠菌的样品进行检测的方法，包含以下步骤 步骤1 提取并扩增样品的核酸序列，所述扩增将信标分子标记到扩增产物；步骤2 取步骤1所得扩增产物与固定于权利要求2-6任一项所述基因芯片上的探针 进行杂交；步骤3 根据所述信标分子采用相应检测方法对基因芯片进行扫描分析。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤1所述扩增步骤的引物具有序列表 SEQ ID No. 2 或 SEQ ID No. 3 所示的序列。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述信标分子可以为荧光素或同位素， 所述荧光素包括Cy3、Cy5、异硫氰酸荧光素、德克萨斯红；所述同位素包括32P。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，公开了一种检测都柏林念珠菌的DNA探针。本发明所述检测都柏林念珠菌的DNA探针具有序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，其检测都柏林念珠菌特异性强，灵敏度高达0.04ng。本发明还提供包含所述DNA探针的基因芯片。采用本发明所述基因芯片可实现对可能含都柏林念珠菌的样品的高通量、自动化及快速检测，特异性强，可保证检测结果的精确性，具有广泛的应用前景。
文档编号C12Q1/04GK102031291SQ20101025813
公开日2011年4月27日 申请日期2010年8月18日 优先权日2010年8月18日
发明者李国辉 申请人:李国辉