专利名称：基于异丁醇的安莎霉素p-3生产优化方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物工程与技术领域的方法，具体是一种基于异丁醇的安莎 霉素P-3生产优化方法。
背景技术：
Ansamitocin是珍贵橙色束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)来源的美登素 衍生物，其母核为19-C的大环内酰胺环，C-3连接不同长度的碳链，主要活性成份安莎霉素 P-3(AP-3)的侧链为异丁酰基，在低浓度下可抑制非白血性白血病细胞系及人类固体肿瘤。 由于肠胃副效应及神经毒性，其研究还停留在临床二阶段。然而，由于Ansamitocin可在临 床一期中作为抗体毒素结合物及免疫结合物，各方面的研究仍在进行中，并且其在2009年 被世界卫生组织列为非常重要的抗菌药物。次级代谢产物的产量受不同环境条件影响，如培养基中组成、氧供应及发酵温度 等。而优化培养基的组成是传统也是重要的一步用于提高代谢物产量。目前，已报道的野 生型珍贵橙色束丝放线菌产Ansamitocin主要为液体发酵，尽管有报道利用培养基优化的 方法及高表达调节基因的方法提高AP-3产量，但得到的产率仍只在50mg/L[6，7]左右；因 此，利用各种方法提高AP-3产率是其应用的一个关键步骤。异丁醇是一种重要的化工原 料，同时也有报道其可作为能源燃料，在发酵生物质产乙醇的过程中作为副产物积累；由于 异丁醇是一种分支醇，可作为分支链脂肪酸的前体，这就为其在需要以分支链脂肪酸为底 物的生物培养过程的利用提供可能；然而，对于醇(特别是异丁醇)作为生物培养过程中的 添加剂或营养因子是鲜有报道的。本发明的目标产物AP-3属于大环内酯类抗生素，其合成 需要一系列来源于脂肪酸的CoA，这使利用异丁醇添加提高AP-3产量成为可能。经过对现有技术的检索发现，K.Hatano, E. Higashide, S. Akiyama, and Μ.Yoneda(1984)在 Selective accumulation of Ansamitocin P_2, P_3and P_4, and biosynthetic origins of their acylmoieties (P_2，P_3 及 P_4 的选择性积累及其酰基 基团来源)(Agric. Biol. Chem. 48(7) :1721_1729) 一文中记载了缬氨酸也可以作为AP-3的 前体以提高其产量[6，8]，但由于缬氨酸在使用前需要过滤除菌，但其在水中的溶解度低， 为添加操作带来极大的不便，且提高AP-3产量的幅度(仅为20% -60% )远不如异丁醇 (200% -400% )，故在AP-3发酵过程中，我们提出添加异丁醇提高目标产物产率的方法。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种基于异丁醇的安莎霉素P-3生产 优化方法，即通过在野生型珍贵橙色束丝放线菌比较添加与不添加异丁醇的AP-3产量，获 得一个有效提高AP-3产量的方法，此方法有助于提高AP-3产率，并减少副产物的生成，可 为简化后续的分离纯化工作作奠定基础。本发明是通过以下技术方案实现的，包括如下步骤第一步、配制种子培养基，采用甘油保存的珍贵橙色束丝放线菌接种于种子培养基并进行培养操作，获得一级种子，并经二次培养后获得二级种子；所述的野生型珍贵橙色束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum subsp. auranticum)保藏于 The Global Bioresource Center ATCC (国际生物资源中心 ATCC，保 藏号31565)，可通过以下方式获得http //www, atcc. orR/ATCCAdvancedCataloRSearch/ProductDetails/ tabid/452/Default. aspx ？ ATCCNum = 31565&Template = bacteria ；所述的种子培养基的组分及质量百分比含量为酵母提取物质1%、牛肉浸膏 1%、葡萄糖0. 5%、甘油和氯化钠0. 3%以及96. 2%的双蒸水，其PH为7. 4。所述的甘油管种子保存于-70°c冰箱，保存浓度为108CFU/ml，按1.6%接种率接种 于种子培养基中，接种量为1.6%。所述的培养操作是指在28°C环境下以220rpm转速培养2天。所述的二次培养是指取一级种子按1. 6%接种率接种于种子培养基中进行培养 操作。第二步、配制发酵培养基，取二级种子接种于发酵培养基，添加异丁醇并进行摇瓶 培养；所述的配制发酵培养基是指依次配置组分及质量百分比含量如下酵母提取物 质1 %、玉米煮沸滤液2 %、葡萄糖0. 5%、甘油4%、碳酸钙0. 5%、磷酸氢二钾0. 05%及七 水合硫酸亚铁0. 0002%，余量为双蒸水，配置得到的发酵培养基的pH为7. 4。所述的摇瓶培养是指将二级种子按1. 6%接种率接种于发酵培养基中，在28°C 环境下以220rpm培养4_6天。所述的添加异丁醇是指直接在摇瓶培养过程的0-48小时时间段内滴加质量百 分比浓度大于99%的异丁醇，直至发酵培养基中的异丁醇浓度达到72毫摩尔/升。第三步、培养结束的发酵液经离心后，分离出上清液，用等体积的乙酸乙酯提取3 次，合并提取液，旋转蒸干后，再用甲醇溶解并过滤备用，最后采用高相液相色谱分析所得 安莎霉素的纯度。经上述方法优化发酵得到的AP-3产量提高200%以上，并大大减少副产物AP-2的 积累。本发明操作简单，易于实施，便于大规模生产。
图1为实施例中野生型珍贵橙色束丝放线菌在添加不同浓度异丁醇条件下的 AP-3产量。图2为实施例中野生型珍贵橙色束丝放线菌在不同培养时间添加异丁醇条件下 的AP-3产量。
具体实施例方式下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行 实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。所使用的微生物珍贵橙色束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum ATCC31565)。液体发酵之前，菌体先接两级种子(60ml/250ml，220rpm, 28°C各2天)，再以1. 6%的接种量 接种发酵培养基，在培养初始或培养过程中添加不同浓度的异丁醇，培养结束后，再用等体 积的乙酸乙酯萃取Ansamitocin，蒸干后溶于甲醇，过滤后低温保存或直接HPLC检测。实施例1采用的菌种珍贵橙色束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum ATCC31565)；种子及发酵培养种子培养基成份为酵母提取物质1%、牛肉浸膏1%、葡萄糖 0. 5 %，甘油1 %和氯化钠0.3%。发酵培养基成份为酵母提取物质1 %、玉米煮沸滤液1 %、 葡萄糖0. 5 %，甘油4 %，碳酸钙0. 5 %，磷酸氢二钾0. 05 %及七水合硫酸亚铁0. 0002 %。 250-ml摇瓶装液量60ml。低温保存的甘油管种子1ml，于28°C，220rpm培养2天，按1. 6% 的接种量转接二级种子，28°C，培养2天，再以1. 6%的接种量转接发酵培养基，并添加不同 浓度的异丁醇(7. 2、18、36和72mM，对应为40、100、200、400微升)，以不添加为对照，每个 条件设三个生物学重复，培养4-6天。样品处理及检测方法液体培养结束后，发酵液离心取上清用等体积的乙酸乙酯 萃取3次，合并3次乙酸乙酯萃取液。上述乙酸乙酯液于50°C旋转蒸发后，加入Iml的甲醇 溶解，用0. 22 μ m有机膜过滤后于高相液相色谱(HPLC)检测AP-3和AP-2含量；所使用的 HPLC柱为C18反向柱，柱温28°C，流动相为85%甲醇和15%水，流速0. 6ml/min。结果表明，添加异丁醇浓度为36mM能有效地提高AP-3产量。实施例2采用的菌种如实施例1;种子及发酵培养如实施例1，不同的是在培养的初始(即第0小时)、第12小时、 第24小时、第36小时及第48小时添加36mM的异丁醇，以不添加为对照，每个条件设三个 生物学重复，培养4-6天。样品处理及检测方法如实施例1。结果表明，在培养初始，即第0小时，添加终浓度为36mM的异丁醇能使AP_3产量 达 93. 8mg/L。
权利要求
一种基于异丁醇的安莎霉素P 3生产优化方法，其特征在于，包括如下步骤第一步、配制种子培养基，采用甘油保存的珍贵橙色束丝放线菌接种于种子培养基并进行培养操作，获得一级种子，并经二次培养后获得二级种子；第二步、配制发酵培养基，取二级种子接种于发酵培养基，添加异丁醇并进行摇瓶培养；第三步、培养结束的发酵液经离心后，分离出上清液，用等体积的乙酸乙酯提取3次，合并提取液，旋转蒸干后，再用甲醇溶解并过滤备用，最后采用高相液相色谱分析所得安莎霉素的纯度。
2.根据权利要求1所述的基于异丁醇的安莎霉素P-3生产优化方法，其特征是，所述的 种子培养基的组分及质量百分比含量为酵母提取物质1%、牛肉浸膏1%、葡萄糖0.5%、 甘油和氯化钠0. 3%以及96. 2%的双蒸水，其pH为7. 4。
3.根据权利要求1所述的基于异丁醇的安莎霉素P-3生产优化方法，其特征是，所述 的甘油管种子保存于-70°C冰箱，保存浓度为108CFU/ml，按1.6%接种率接种于种子培养基 中，接种量为1.6%。
4.根据权利要求1所述的基于异丁醇的安莎霉素P-3生产优化方法，其特征是，第一步 中所述的培养操作是指在28°C环境下以220rpm转速培养2天。
5.根据权利要求1所述的基于异丁醇的安莎霉素P-3生产优化方法，其特征是，第一步 中所述的二次培养是指取一级种子按1. 6%接种率接种于种子培养基中进行培养操作。
6.根据权利要求1所述的基于异丁醇的安莎霉素P-3生产优化方法，其特征是，所述 的配制发酵培养基是指依次配置组分及质量百分比含量如下酵母提取物质1%、玉米煮 沸滤液2%、葡萄糖0. 5%、甘油4%、碳酸钙0. 5 %、磷酸氢二钾0. 05%及七水合硫酸亚铁 0. 0002%，余量为双蒸水，配置得到的发酵培养基的pH为7. 4。
7.根据权利要求1所述的基于异丁醇的安莎霉素P-3生产优化方法，其特征是，第二步 中所述的摇瓶培养是指将二级种子按1. 6%接种率接种于发酵培养基中，在28°C环境下 以220rpm培养4-6天。
8.根据权利要求1所述的基于异丁醇的安莎霉素P-3生产优化方法，其特征是，所述 的添加异丁醇是指直接在摇瓶培养过程的0-48小时时间段内滴加质量百分比浓度大于 99%的异丁醇，直至发酵培养基中的异丁醇浓度达到72毫摩尔/升。
全文摘要
一种生物工程技术领域的基于异丁醇的安莎霉素P-3生产优化方法，通过在野生型珍贵橙色束丝放线菌比较添加与不添加异丁醇的AP-3产量，获得一个有效提高AP-3产量的方法，此方法有助于提高AP-3产率，并减少副产物的生成，可为简化后续的分离纯化工作作奠定基础。
文档编号C12R1/01GK101914587SQ20101026691
公开日2010年12月15日 申请日期2010年8月30日 优先权日2010年8月30日
发明者林锦霞, 钟建江 申请人:上海交通大学