专利名称：一种环氧水解酶基因、编码蛋白及其应用的制作方法
一种环氧水解酶基因、编码蛋白及其应用
技术领域：
本发明属于生物化学与分子生物学中基因工程领域，更具体地讲，涉及一种绿豆环氧水解酶基因及其编码蛋白。
背景技术：
手性环氧化物及其开环产物邻二醇能与各种亲核试剂反应，作为合成化学中重要的手性砌块可以进一步转化成许多具有生物活性的化合物，如白三烯、昆虫信息素、留类物质、肾上腺素阻断剂、神经保护剂和艾滋病毒蛋白酶抑制剂等，在医药、农药、精细化工和化妆品等行业具有广阔的应用前景。在药物研究领域，具有单一光学活性结构的药物往往比具有消旋结构的药物疗效更高，不良反应更少，因此有机化学家、药物化学家一直在致力于发展新的途径和方法得到单一光学活性的化合物。不对称氧化及开环的方法，有化学催化和生物催化两种。以Katsuki-Siarpless 和Jacobsen不对称环氧化为代表的含金属元素类化学催化剂已广泛应用于各种反应中。 近年来，以水解酶类(特别是脂肪酶和酯酶)、卤酸脱卤素酶、单加氧酶、过氧化物酶、卤过氧化物酶和环氧水解酶(Epoxide hydrolases, EHs)为代表的生物催化剂依赖其高度立体选择性、环境友好等优势越来越得到重视，尤其是不依赖于辅因子的环氧化物水解酶 [EC. 3. 3. 2. X]。环氧水解酶广泛存在于自然界各种生物体内，如哺乳动物、植物、昆虫、真菌和细菌等，能立体选择性地将水分子加成到环氧底物上，生成相应的邻位二醇。由于环氧具有张力三元环和极性碳氧键，是非常活泼的亲电试剂，因此环氧化物在生物体内可以和许多具有亲核基团的生物活性分子进行反应，EHs可以降解这种具有潜在毒性的代谢中间体，特别是那些可以致癌的多环芳烃环氧化物；EHs和血管渗透中内源的化学递质如花生四烯酸、 亚麻油酸等氧化脂类的代谢也有关，可防止形成的环氧化物导致的炎症、组织缺氧、高血压等生理机能障碍；多数植物种子含有含氧油脂，例如斑鸠菊脂酸、单加氧的亚麻油酸，它们经过环氧水解酶作用之后得到的相应的二醇是角质素和芳香族化合物合成中重要的中间体，也是植物抗真菌的防卫物。EHs对人体及其他生物体都非常重要。环氧化物的酶促水解反应从20世纪60年代就有科学家开始研究，在自然界中寻找新的EHs酶源是近年来国际上研究的热点。目前已发现了很多具有环氧化物选择性水解活力的细菌、真菌和植物，见参考文件[1-7]，使EHs在不对称合成中的运用成为可能； 随着基因组测序计划的进行，EHs的来源也扩大到利用基因重组方法来制备，见参考文献 [8-11]，如黑曲霉、土豆、大豆等，且已有两种重组EHs作为商品进行销售。一般而言，消旋化合物经酶促转化拆分后最多只能得到50%的单一构型产物。对映体会聚(enantioconvergence)是指将两种构型的外消旋底物同时转化成一种构型的产物，可实现底物的完全转化。常用的对映体会聚的方法有利用两种选择性互补的酶共同作用和化学-酶偶联法两种。我们已发现绿豆中存在独特的环氧水解酶，见参考文献 [12-13]，可以通过对映归一性水解的方式产生单一构型的邻位二醇；对此酶进行了部分纯
3化、动力学和酶学性质研究。本发明中公幵绿豆环氧水解酶的基因与其编码的蛋白序列，以及该酶的重组方法。参考文献[ 1 ] Chri stophe Morisseau, Jeffrey K. Beetham, Franck Pinot et al· Cress and Potato Soluble Epoxide Hydrolases !Purification, Biochemical Characterization, and Comparison to Mammalian Enzymes. Archives of Biochemistry and Biophysics. 2000,378(2) :321-332.[2] Carel A. G. M. Weijers and Jan A. M. de Bont. Epoxide hydrolases from yeasts and other sources versatile tools in biocatalysis Journal of Molecular Catalysis B :Enzymatic. 1999,6 :199-214[3] Martha S. Smi t. Fungal epoxide hydrolases :new landmarks in sequence-activity space. TRENDS in Biotechnology. 2004,22 (3) :123-129[4]Hee Sook Kim, 0k Kyung Lee, Soo Jung Lee et al. Enantioselective epoxide hydrolase activity of a newly isolated microorganism， Sphingomonas echinoides EH—983，from seawater. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2006，41 :130-135[5] Michae 1 Kotik a，Vac lav Stepaneka，Helena Mare so va et al.Environmental DNA as a source of a novel epoxide hydrolase reacting with aliphatic terminal epoxides. Journal of Molecular Catalysis B :Enzymatic 2009， 56 :288-293[6] van Loo , B. ；Kingma，J. ； Arand，M. ； Wubbo 11 s , Μ. G. ； Janssen , D. B. "Diversity and biocatalytic potential of epoxide hydrolases identified by genome analysis”，Applied and Environmental Microbiology，2006，72 :2905-2917.[7] Smit, M. S. ；Labuschagne，M. "Diversity of epoxide hydrolase biocatalysts，，，Current Organic Chemistry，2006，10 :1145-1161[8]Lishan zhao, Eric J Mathur, David Weiner et al. epoxide hydrolase, nucleic acids encoding them and methods for making and using them. US 6943001[9] H. Visser aS. Vreugdenhi 1 J. A. M de Bont et al. Cloning and characterization of an epoxide hydrolase-encoding gene from Rhodotorula glutinis Appl Microbiol Biotechnol. 2000，53 :415-419[10]Kenji Gomi，Hiroyuki Yamamato and Kazuya Akimitsu Epoxide hydrolase :a mRNA induced by the fungal pathogen Alternaria alternata on rough lemon(Citrus jambhiri Lush)Plant Molecular Biology,2003 53:189-199，[ll]Michael Kotik，Vaclav Stepanek，Pavel Kyslik，et al. Cloning of an epoxide hydrolase-encoding gene from Aspergillus nigerM200， overexpression in E·coli， and modification of activity and enantioselectivity of the enzyme by protein engineering. Journal of Biotechnology 2007，132 :8-15.[12] Wei Xu, Jian-He Xu, Jiang Pan, Qing Gu， and Xin-Yah Wu. Enantioconvergent Hydrolysis of Styrene Epoxides by Newly Discovered EpoxideHydrolases in Mung Bean. Org. Lett. 2006,8(8) :1737-1740.[13]鞠鑫，潘江，许建和.绿豆环氧水解酶催化对硝基苯乙烯氧化物的对映归一性水解·催化学报· 2008，29 (8) =696-700.
发明内容本发明的第一个目的是提供绿豆环氧水解酶及其编码基因；本发明的第二个目的是提供一种编码环氧水解酶DNA分子的重组表达载体的构建方法及其所获得的重组表达载体；本发明的第三个目的是提供重组表达载体获得的重组环氧水解酶在水解消旋环氧化物制备光学纯手性中间体中的应用以及环氧水解酶的蛋白序列在植物生长、发育和抗逆中的应用。本发明的第四个目的是提供一种含有上述编码环氧水解酶的DNA分子中8-100个连续核苷酸的互补序列探针分子。本发明所提供的绿豆中获得的一种环氧水解酶基因，命名为VREH1，具有下列特征之一 (1)具有SEQ ID NO 1所示核苷酸序列；( 在严格条件下与SEQ ID NO 1所示DNA 序列杂交的DNA分子；(3)由碱基简并性或/和碱基替代得到的与SEQ ID NO :1所述核苷酸序列90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列，如SEQ ID NO :3。该序列在GenBank中同源搜索，未发现同源序列，为一新基因。所述严格条件是在0. IXSSPE(或 0. 1XSSC)，0. 1% SDS溶液中，65°C下杂交并洗膜。本发明所提供的VREHl编码产物，是具有序列表中序列SEQ ID NO 2氨基酸序列组成的蛋白质，或其活性片段，或由序列SEQ ID NO 2氨基酸序列中经过取代、缺失和/或叠加一个或几个氨基酸、以及在N末端和/或C末端添加数个氨基酸衍生得到的蛋白质或多肽，衍生蛋白或多肽与序列SEQ ID NO :2编码蛋白质具有相同生物学功能，如SEQ ID NO 4。本发明还公开了所述编码环氧水解酶的DNA分子的重组表达载体及其构建方法， 利用重组表达载体构建重组宿主(如大肠杆菌、枯草杆菌等原核细胞和酵母、昆虫、哺乳动物、植物等真核细胞)，以及重组环氧水解酶在水解消旋环氧化物制备光学纯手性中间体中的应用。本发明还包括VREHl的反义序列，该序列可用于抑制细胞内VREHl的表达；还包括可用作探针的DNA分子，通常具有VREHl序列中连续的10-100个碱基的互补序列，可用于检测样本中是否存在编码VREHl的基因或该基因的转录水平。为了解决上述问题，本发明提供了以下技术方案VREHl基因序列的获得抽提绿豆mRNA，反转录得到cDNA ；比对豆科植物环氧水解酶基因的高度保守区， 设计兼并引物；以反转录得到cDNA为模板，PCR扩增保守区序列，RACE延伸得到绿豆环氧水解酶的完整编码区序列。SEQ ID NO 1 =VREHl基因的核苷酸序列全长960bp，编码319个氨基酸ATGGAAGAAATAGAGCACAGAACAGTTGAAGTGAATGGCATAAAAATGCATGTAGCAGAGAAAGGAGAGGGTCCTGTCGTGTTGTTCCTCCATGGCTTCCCCGAGCTCTGGTACTCCTGGCGCCACCAGATTCTCGCTCTCAGCTC CCGAGGCTACCGCGCCGTCGCCCCTGATCTACGTGGCTACGGTGATACAGAGGCACCAGAGTCAATCAGCAGCTACA CCATCATGCATCTCGTGGGTGACATCGTGGCACTCATAGACTCACTTGGTGTGGGTCAAGTCTTCCTCGTTGCGCAT GATTGGGGCGCCATCGTAGGATGGTACCTATGTTTGTTTCGACCAGAGAAAATCAAGGCCTACGTTTGCCTCAGCGT CCCTTTCATGCCCAGAAACCCAAAAGTCAGGCCCGTGGATGCCATGCGGGCCCTCTACGGGGATGACTACTACATCT GCAGATTCCAGGAGCCAGGCAAAGCGGAAGCTCTGTATGGCAGTAATAATAACATTGGAGAAGTAATAAAGAGCATC CTTACAAATCGGAGACCTGGACCACCAATCCTACCCAAAGAAGGGGTTGCCCTTCCTTCAGGGTCCCTTCCCTCAAG ACCCCTTCCATCTTGGCTCTCGGAGGAAGATGTCACTTATTATGCTTCTAAATTTTCAAAAACAGGCCTAACTGGGG GCCTCAACTACTACAGAAATCTCAACCTCAATTGGGAGCTCACAGCAGCATGGACTGGAGCAAAAGTGAAAGTTCCA GTAAAGTTCATTACTGGTGATTTGGATGTAGTATACACTTCACTAGGGATAAAAGACTACATAGACAGTGGTGCTTT CAAGCGAGATGTGCATTATTTGGAGGAAGTGGTTGTGCAGGAAGGGGTTGCTCACTTCAACAACCAAGAAGCTGCAG AGGATATCAGCAATCACATTTATGAATTCATCAAGAAGTTCTGASEQ ID NO 3 VREHl 基因的同源序列ATGGAAGAAATAGAGCACAGAACAGTTGAAGTGAATGGCATAAAAATGCATGTTGCAGAGAAAGGAGAG GGTCCAGTGGTGTTGTTCCTCCACGGCTTCCCTGAGCTCTGGTACTCATGGCGCCATCAGATTCTCGCTCTCAGCTC CCGAGGCTACCGCGCCGTCGCTCCCGATCTCCGTGGCTACGGTGACACCGAGGCACCAGAGTCAATCAGCAGCTACA CCTGCTTCCATCTAGTGGGTGACATCGTTGCGCTTATTGACTCTCTGGGTGTCGGTCAAGTGTTCCTTGTGGCTCAT GACTGGGGAGCCATCGTAGGTTGGTATCTATGCTTGTTTCGCCCTGAGAAAATCAAGGCCTATGTCTGCCTCAGTGT CCCTTTCATGCCCAGAAACCCAAAAGTCAGGCCCGTGGATGCCATGCGTGCTTTGTATGGAGACGACTACTATATCT GCAGATTTCAGGAGCCAGGGAAAGCGGAGGCTCTGTATGGCAGTAATAATAACATTGGAGAAGTAATAAAGAGCATC CTTACAAATCGCAGACCTGGTCCTCCAATTCTTCCCAAGGAAGGGGTTGCCCTTCCTTCAGGGTCCCTTCCCTCAAG ACCCCTTCCCTCTTGGCTCACAGAAGAAGATCTCGCCTATTATGCTTCTAAATTTTCAAAAACAGGCCTAACTGGGG GCCTCAACTACTACAGAAATTTCAACTTAAATTGGGAGTTGACGGCACCATGGACAGGAGCAAAAGTCAAGGTGCCC GTAAAGTTCATAACAGGTGAGTTGGATGTGGTATACACTTCACTAGGGATAAAAGAGTATATAGACAGCGGTGCGTT CAAGCGAGATGTGCATTATTTAGAGGAAGTGGTTGTGCAGGAAGGAGTGGCTCACTTCAATAATCAAGAAGCAGCAG AGGATATCAGCAATCACATATACGAATTTATCAACAAGTTCTGA获得同源序列的严格条件是对扩增获得的VREHl基因的核苷酸序列按照编码相同氨基酸的原则进行密码子的第三位碱基替代和/或非活性中心氨基酸编码密码子进行碱基替代或在其5’端和/或3’端在不引起后续阅读框的情况下添加/减少数个碱基。SEQ ID NO 2 =VREHl基因编码的蛋白的氨基酸序列MEEIEHRTVEVNGIKMHVAEKGEGPVVLFLHGFPELffYSffRHQILALS SRGYRAVAPDLRGYGDTEAP ESISSYTMHLV⑶IVALIDSLGVGQVFLVAHDWGAIVGWYLCLFRPEKIKAYVCLSVPFMPRNPKVRPVDAMRAL YGDDYYICRFQEPGKAEALYGSNNNIGEVIKSILTNRRPGPPILPKEGVALPSGSLPSRPLPSWLSEEDVTYYAS KFSKTGLTGGLNYYNLNLNffELTAAffTGAKVKVPVKFITGDLDVVYTSLGIKDYIDSGAFKRDVHYLEEVVVQEG VAHFNNQEAAEDISNHIYEFIKKFSEQ ID NO 4 =VREHl基因编码的蛋白的氨基酸同源序列MEEIEHRTVEVNGIKMHVAEKGEGPVVLFLHGFPELffYSffRHQILALS SRGYRAVAPDLRGYGDTEAP ESISSYTCFHLVGDIVALIDSLGVGQVFLVAHDWGAIVGWYLCLFRPEKIKAYVCLSVPFMPRNPKVRPVDAMRAL YGDDYYICRFQEPGKAEALYGSNNNIGEVIKSILTNRRPGPPILPKEGVALPSGSLPSRPLPSWLTEEDLAYYASKFSKTGLTGGLNYYRNFNLNWELTAPWTGAKVKVPVKFITGELDVVYTSLGIKEYIDSGAFKRDVHYLEEVVVQE GVAHFNNQEAAEDISNHIYEFINKF.VREHl基因的重组表达依据VREHl基因的核苷酸序列和表达载体可用的多克隆位点，设计特异性引物， 从cDNA模板中扩增目标基因，限制性酶切后与相应的表达载体连接，转化、筛选得到重组表达质粒。转化相应的宿主细胞，并在其内表达。所述宿主细胞可以是大肠杆菌、枯草杆菌等原核细胞或者酵母、昆虫、哺乳动物、植物等真核细胞。所述特异性引物为FATGGAAGAAATAGAGCACAG ； R TCAGAACTTCTTGATCA A本发明的优点在于，本发明公开的从绿豆中获得的一种环氧水解酶(VREHl)的编码序列，在GenBank中同源搜索，未发现同源序列，为一新基因，并且首次衍生获得VREHl相应的氨基酸序列，分析了其主要功能区。本发明基因的发现不仅扩大了环氧水解酶基因的资源，为进一步阐明该酶在植物抗逆和发育过程中的作用提供了便利，而且为构建生物有机合成中制备光学纯环氧化物和邻二醇的基因工程菌提供了科学依据。
图1为绿豆总RNA抽提结果；图2为PCR扩增目标基因，其中，M代表MarkerIII ； 1代表阴性对照；2代表绿豆环氧水解酶；图3为VREHl的核苷酸序列和编码的蛋白的氨基酸序列；图4为SDS-PAGE分析重组菌的表达，其中1代表1#菌诱导前的样本；2代表1#菌诱后的样本；3代表2#菌诱前的样本；4代表2#菌诱导后的样本；图5为重组酶催化对硝基苯乙烯氧化物前后样本的薄层层析结果图，其中，1代表重组酶作用后样本，底物完全转化生成产物二醇；2代表重组酶作用前的底物对硝基苯乙烯氧化物；图6为重组酶催化对硝基苯乙烯氧化物前后样本的HPLC分析图；图7 (a)、图7 (b)为VREHl基因DNA序列与已报道的环氧水解酶DNA序列的进化分析图，其中(a)序列比对；(b)进化树；图8为VREHl基因编码蛋白序列与已报道的环氧水解酶蛋白的进化分析图；图9为VREHl基因编码蛋白序列与已报道的植物来源的环氧水解酶蛋白序列比对图。
具体实施方式下面结合附图对本发明提供的具体实施方式
做详细说明。实施例IVREHl基因的获得I、RNA的提取和cDNA的获得绿豆总RNA提取取适量绿豆种子，在液氮中研磨成粉，加入Iml Trizol,混勻放置5min后，加入200μ 1氯仿，混勻放置5min，4°C，12000Xg离心IOmin ；取上清，加入 200 μ 1 3Μ NaAc，再次离心取上清；加入氯仿，离心除蛋白和多糖；上清液中加入250 μ 1异丙醇沉淀RNA ；4°C 12000 Xg离心lOmin，弃上清，用75%乙醇洗涤；沉淀用50 μ ITE溶解。电泳和分光光度计检测mRNA质量和纯度。cDNA 的获得取 l-2ug RNA，依照 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)试剂盒步骤进行反转录，获得cDNA。绿豆总RNA抽提结果见图1所示。II、目的基因VREHl的获得根据土豆和大豆环氧水解酶基因的高度同源区设计引物。F GGCTTCCCTGAGCTCTGGTACT, R :CTCCTGTCCATGGTGC，以绿豆反转录得到的 cDNA 为模板，扩增约600bp的部分目标序列。具体步骤如下反应体系总体积为20μ 1，内含 0. 5μ IcDNAU μ 1 引物、10 μ 1 2 XPCRMixture (东盛)。反应程序为95°C预变性5min后，以95°C变性30s、50°C退火30s、72°C延伸Imin 反应25个循环，72°C延伸lOmin。反应结束后进行电泳检测，并回收目的片段。回收的目的片段与克隆载体PMD18T连接获得克隆质粒，挑单克隆培养过夜后，抽提质粒鉴定，阳性克隆测序验证。Blast进行同源搜索，确证是否为目标环氧水解酶序列。根据hvitrogen RACE试剂盒的操作步骤，分别以上述两个引物为3’ -RACE 和5’ -RACE的基因特异性引物，与试剂盒中RACE引物搭配，扩增延伸，电泳检测，回收 800-1500bp之间的目标片段，与克隆载体连接、转化、鉴定、测序，拼接后得到目标绿豆环氧水解酶的编码序列。实施例2环氧水解酶基因VREHl在大肠杆菌中的克隆与表达根据拼接得到的序列设计引物，正向引物F-Nde为GGCATATGGAGCAAATAAAGCAC， 反向引物R-HindIII为:GCAAGCTTCAGAACTTCTTGATCAA(下划线部分分别为引入的酶切位点 Nde I和HindIII)；以绿豆反转录得到的cDNA为模板，PCR扩增，扩增条件为95°C预变性 5min后，以95°C变性30s、50°C退火30s、72°C延伸Imin反应25个循环，72°C延伸lOmin。 反应结束后进行电泳检测，结果如图2所示，并回收目的片段。回收的目的片段与克隆载体 PMD18T连接、转化、抽质粒酶切鉴定，筛选阳性重组子，测序验证。用Nde I和Hind III双酶切阳性克隆载体和空表达载体pET48a(+)，分别回收目标基因片段和线性化载体片段，连接、转化、鉴定，获得阳性表达重组子。重组子转化表达菌E. coli BL21(DE3)，挑单克隆培养过夜，第二天转接，37°C培养至对数期，加入终浓度为0. 5mmol的IPTG在37°C诱导表达3H菌液超声破碎后，电泳检测目标蛋白表达情况，结果见图4。以对硝基苯环氧化物为底物，检测重组酶的活力。实施例3重组酶的同源性分析将VREHl序列与Genebank数据库中已报到的环氧水解酶编码基因进行比对和进化树分析(图7)。图7中各缩写分别代表Ah 落花生DQ889519. 1 ；Asp N黑曲霉Asp N DQ443737 ；Asp N2DQ443738 ；Asp F 烟曲霉 XM749627. 2 ；At 拟南芥 gi30683229 ；Ca 鹰嘴豆 AJ487037. 1 ；Cec 秀丽隐杆线虫 NM_073^1. 3 ;Dmj 黑腹果蝇 NM_137541. 3 ;Gm 大豆，Gml BT093943, Gm2, X78547, Gm3AF529301. 1，Gm4BT095178 ；Hs 人 NM_001979. 4 ；Mm 小鼠 NM_007940. 3 ；Nt 咖啡 GT021148. 1 ；Mt 蒺藜苜蓿 gi 56899956 ；Os 水稻 EF576088. 1 ； 0s2, AY319965. 1 ；St 马铃薯 M1U02498. lSt2U02498. 1 ；Tc 水芹 NM_116467 ；Sc 马铃薯 AM050815. 1 ；VR 绿豆我们的序列VREH1。由图可以发现VREHl与土豆、拟南芥、水芹、苜蓿、 鹰嘴豆、大豆中两种基因属同一分支，且与苜蓿、鹰嘴豆、大豆中两种基因的亲缘关系最近。
将VREHl编码的蛋白序列与Swiss-Port蛋白数据库中相关序列比对，如图8 所示，进化树分析更清楚地表明了 VREHl在进化过程中与其他环氧水解酶的亲缘关系， 进化树所需要的序列全部来自SWISS-PORT蛋白数据库中的环氧水解酶全长序列。图中 Ah 落花生 ACF74284. 1 ；Asp N 黑曲霉 Asp NABE98162. 1 ；Asp N2ABE98163. 1 ；Asp F 烟曲霉XM 749627. 2 ；At 拟南芥NP_193331. 6 ；Ca 鹰嘴豆CAD31713 ；Cec 秀丽隐杆线虫 NP_505662. 1 ；Dmj 黑腹果蝇 NP_611385. 1 ；Gm 大豆 Gml ACU18288, Gm2 CAA55293. 1， Gm3 AAM94615. lGm4 ACU19450 ；Hs 人 NP_001970. 2 ；Mm 小鼠 NP_031966 ；Mt 蒺藜苜蓿 Mt， ABN08020,Mt2ABN08024 ；Nb =Nicotiana benthamiana, NblACE82565 ；Nt 咖啡 GT021148. 1 ； Os 水稻 ABR25676 ；0s2, AAR18812 ；Sc =Solanum commersonii 茄属 CAJ19276. 1 ；St 马铃薯 StlAAA81891, St2AAA81893. 1 ；Tc ^K 芹 NP_567228 ； VR 绿豆我们的序列；Vv =Vitis vinifera CBI39538. 3。从图8、图9的进化树分析和同源比对分析可以看出，VREH 1编码蛋白与豆科植物的环氧水解酶序列具有较高的同源性，催化活性区高度保守。实施例5同源序列的重组、表达与活性分析依照实例4中环氧水解酶氨基酸同源序列比对结果，根据日本东洋坊(Τ0Υ0Β0)定点突变试剂盒(KOD-Plus-Mutagenesis Kit)引物设计原则，设计下列突变引物。
权利要求
1.一种编码环氧水解酶的DNA分子，其序列满足下述任一条件(1)SEQID NO 1所示核苷酸序列；(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交的DNA分子；(3)由碱基简并或/和替代衍生的与(1)所述核苷酸序列90%以上同源性，且与(1) 编码相同功能蛋白质的序列。
2.一种环氧水解酶，其氨基酸序列如(1)或( 所示(1)SEQID NO :2所示的氨基酸序列；(2)在(1)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或/和叠加一个或几个氨基酸衍生得到的，且与(1)编码蛋白质具有相同功能的衍生蛋白质的氨基酸序列。
3.—种权利要求1所述的编码环氧水解酶DNA分子的重组表达载体的构建方法，其特征在于，依据权利要求1所述的环氧水解酶基因的核苷酸序列和表达载体可用的多克隆位点，设计特异性引物，从cDNA模板中扩增目标基因，限制性酶切后与相应的表达载体连接， 转化、筛选得到重组表达质粒，转化相应的宿主细胞，并在所述宿主细胞内表达，所述宿主细胞是原核细胞或真核细胞。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述原核细胞指大肠杆菌或枯草杆菌，所述真核细胞指酵母、昆虫、哺乳动物或植物中的一种。
5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述特异性引物中含F:ATGGAAGAAATAGAGCACAG ；R :TCAGAACTTCTTGATCAA。
6.一种通过权利要求3所述的构建方法获得的重组表达载体，其特征在于，含有权利1 要求所述的DNA。
7.权利要求6所述的重组表达载体获得的重组环氧水解酶在水解消旋环氧化物制备光学纯手性中间体中的应用。
8.权利要求1所述的环氧水解酶的核苷酸序列或权利要求2所述的环氧水解酶的蛋白序列在植物生长、发育和抗逆中的应用。
9.一种探针分子，其特征在于，含有权利要求1所述DNA分子中10-100个连续核苷酸的互补序列。
全文摘要
本发明公开了从绿豆中获得的一种环氧水解酶(VREH1)的编码序列，在GenBank中同源搜索，未发现同源序列，为一新基因，并且首次衍生获得VREH1相应的氨基酸序列，分析了其主要功能区。本发明还公开了所述编码环氧水解酶的DNA分子的重组表达载体及其构建方法，以及在水解消旋环氧化物制备光学纯手性中间体中的应用。本发明基因的发现不仅扩大了环氧水解酶基因的资源，为进一步阐明该酶在植物抗逆和发育过程中的作用提供了便利，而且为构建生物有机合成中制备光学纯环氧化物和邻二醇的基因工程菌提供了科学依据。
文档编号C12N15/63GK102382847SQ20101026694
公开日2012年3月21日 申请日期2010年8月27日 优先权日2010年8月27日 公开号201010266947.9
发明者范立强, 许建和, 贺婉红, 赵健 申请人:华东理工大学