一种氨基甲酸乙酯水解酶基因及其编码的蛋白质和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种氨基甲酸乙酯水解酶基因UH及其编码的蛋白质和应用，具有如SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列，如SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列；采用本发明提供的UH基因构建的基因工程菌株，其酶活力为83.5U/g湿菌体，具有广泛的应用基础。
【专利说明】一种氨基甲酸乙酯水解酶基因及其编码的蛋白质和应用
【技术领域】
[0001]本发明公开了一种氨基甲酸乙酯水解酶基因及其编码的蛋白质，特别是一种来源于梭形赖氨酸芽孢杆菌的氨基甲酸乙酯水解酶基因及其编码的蛋白质。
【背景技术】
[0002]氨基甲酸乙酯(英文名:urethane或ethyl carbamate,简称EC)又名乌拉坦、尿烧，是一种医药、农药、香料的中间体，或用于生产安眠药、镇静剂、注射剂的助溶剂和印染工业着色剂，也可用于生物化学研究。此外，尿烷本身可作成药使用，具有抗癌性能，用于治疗多发性骨髓瘤和慢性白血病等。
[0003]20世纪40年代，Nettleship实验证明了氨基甲酸乙酯具有致癌作用。主要可以引起肺肿瘤、淋巴癌、肝癌、皮肤癌等。氨基甲酸乙酯作为副产物广泛存在于发酵食品(如面包、酸牛奶、乳酪、酱油等)和酒精饮料(如葡萄酒、黄酒、苹果酒和日本清酒等)中。人体摄取氨基甲酸乙酯主要是通过饮用酒精饮料和食物。氨基甲酸乙酯已成为影响人类健康的一个不可忽视的因素。
[0004]目前各国政府对发酵食品中EC的含量已出台相应的限量标准。我国生产的白酒、葡萄酒、酱油等中也广泛存在着氨基甲酸乙酯，这不仅制约我国相关产品的出口，更影响普通消费者的健康。因此采取有效的方法控制或消除发酵食品或饮料中的氨基甲酸乙酯迫在眉睫。
[0005]上世纪90年代，日本科学家筛选到一些能够降解氨基甲酸乙酯的菌株，例如Bacillus Iicheniformis> Citrobacter sp.>Micrococcus species 等,倉泛够将氛基甲酸乙酯降解为乙醇、氨和二氧化碳，将致癌物转变成无毒的有机分子，有效的解决了食品的安全性问题。但野生菌产酶量小、蛋白纯化步骤繁琐、有些为非安全性菌株等原因，一直未在食品工业中广泛应用，这使得挖掘具有氨基甲酸乙酯水解酶活性的基因、构建高效外源表达体系具有重要的意义。通过基因工程的手段，直接克隆和表达所需的氨基甲酸乙酯水解酶，改变野生菌产酶量不足等问题，为氨基甲酸乙酯水解酶的工业化应用提供了新思路并奠定了基础。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的技术问题为提供一种氨基甲酸乙酯水解酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示或为编码SEQ ID N0:2所示蛋白质的核苷酸序列。
[0007]本发明通过将纯化自梭形赖氨酸芽孢杆菌的氨基甲酸乙酯水解酶做N端测序，将N端12氨基酸残基与NCBI数据库比对，通过设计特异性引物将编码氨基甲酸乙酯水解酶的基因扩增并构建重组载体转化宿主细胞，对此基因在大肠杆菌中进行表达。因此，本发明的目的是提供一种氨基甲酸乙酯水解酶基因、含有该基因的重组载体、该重组载体转化得到的重组基因工程菌，以及其在制备重组氨基甲酸乙酯水解酶中的应用。
[0008]本发明采用的具体技术方案是通过将已经测序得到的氨基甲酸乙酯水解酶N端12个氨基酸残基与NCBI数据库比对，根据比对结果设计特异性引物扩增目的基因并连接克隆载体，测序得到其核酸序列，如序列表中SEQ ID N0.1所示，其中，其编码序列(CDS)从DNA第I个碱基起至第1419个终止，ATG为转录起始密码子，TAA为转录终止密码子；通过序列翻译得到如序列表中SEQ ID N0.2所示。当然，如本领域技术人员所知，本发明氨基甲酸乙酯水解酶基因还可以是编码由序列表中SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的其它核苷酸序列；而本发明的氨基甲酸乙酯水解酶不仅仅限于是具有序列表中SEQ IDN0.2所示的氨基酸组成的序列，还可以是将序列2中的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有相同酶活性的由序列2衍生的蛋白质，比如在C端和/或N端添加或缺失一个或数个氨基酸残基，添加融合标签等，虽然在形式上进行修饰但不改变蛋白的酶活。
[0009]所述氨基甲酸乙酯水解酶基因可得自梭形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusfusiformis),如 Lysinibacillus fusiformis SC02 等菌株。
[0010]含有SEQ ID N0.1所示核苷酸序列的基因表达载体也为本发明的保护范围，其是用常规的生物技术手段将克隆得到的目的基因序列连接入各种基因表达载体而构建成功，该使用的载体可以是市售的质粒、粘粒、曬菌体等，其中优选表达载体pET20b (+)。
[0011]本发明要解决的另一个问题是构建含有重组基因表达载体的工程菌株，其是将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离得到含有重组氨基甲酸乙酯水解酶的菌体细胞；具体为将含有氨基甲酸乙酯水解酶基因的表达载体转化入相应的表达宿主，构建外源表达体系。如将构建好的上述表达载体pET20b (+) -UH转化入E.coliBL21(DE3)感受态细胞，构建E.coli BL21 (DE3)/pET20b (+)-UH外源表达体系O
[0012]本发明的解决的另一个技术问题是提供制备重组氨基甲酸乙酯水解酶的方法，通过将重组表达载体转化表达宿主构建表达体系，在一定条件下培养并表达，制备得到重组氨基甲酸乙酯水解酶。其中，表达宿主可以是植物、动物或细菌等，较优的表达宿主是大肠杆菌，如得到上述构建的基因工程菌:E.coli BL21(DE3)/pET20b(+)-UH。较优的方法是，将E.coli BL21(DE3)/pET20b(+)-UH基因工程菌培养到一定菌体浓度(如 OD6qq=0.35-0.8)，添加诱导剂(如IPTG最终浓度为0.05-lmM),培养一定时间(如10_30h)，高效表达重组氨基甲酸乙酯水解酶。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为本发明UH的PCR扩增电泳图谱，其中I为UH的PCR扩增产物；2为DNAMarker (2000bp, Takara 公司)
[0014]图2为本发明质粒pET20b(+)_UH的Nde I和BamH I双酶切分析图谱，其中，I为DNA Marker (5000bp, Takara 公司);2 为 pET20b (+) -UH 经 Nde I 和 BamH I 双酶切电泳。
[0015]图3为本发明基因工程菌株E.coli BL21 (DE3) /pET20b (+) -UH表达产物的SDS-PAGE蛋白电泳图，其中I为基因工程菌E.coli BL21 (DE3)/pET20b (+)-UH非诱导产物；2为蛋白分子量标准(碧云天公司)；3为基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET20b(+)-UH经IPTG诱导15小时的产物。【具体实施方式】
[0016]下面用实施例来进一步说明本发明。
[0017]下列实施例中的材料与方法:
[0018]所采用的分子克隆技术参考J.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。
[0019]所使用的限制性内切酶和胶回收试剂盒均购自Fermentas公司，具体的反应条件和使用方法参考其说明书。基因组抽提试剂盒购自Omega公司，使用参考其说明书。
[0020]下面的商品化质粒和大肠杆菌用于基因克隆和表达。
[0021]pMD19-T(Takara,中国)
[0022]pET20b (+) (Novagen,美国)
[0023]E.coli JM109 (Novagen,美国)
[0024]E.coli BL21(DE3) (Novagen,美国)
[0025]实施例1:从梭形赖氨酸芽孢杆菌基因组中克隆UH基因
[0026]将在平板上划线活化的梭形赖氨酸芽孢杆菌单菌落接种于LB液体培养基，培养约15h处于对数生长期时，收集菌体。参考基因组抽提试剂盒步骤，提取其基因组DNA。根据蛋白序列比对结果设计特异性引物，包括正向引物I和反向引物2，正向引物I加上NdeI，反向引物2加上BamH I，如下:
[0027]正向引物1:5，-GGA ATT CCA TAT GAT GCG GAC ATT GCT GTA CGT-3’
[0028]反向引物2:5，-CGG GAT CCT TAG ATA TTA GCA AAA ATA TTT GGT TTT-3，
[0029]以梭形赖氨酸芽孢杆菌基因组DNA为模板，上述特异性引物为引物，对UH酶基因进行扩增。PCR扩增使用Takara公司试剂盒，使用参考其说明书，扩增34个循环。扩增条件如下:
[0030]
步骤I温度I时间-
195 °C 5min
295V-30sec
355V-30sec
472V-IOOsec
572V-IOmin
[0031]用0.8%琼脂糖凝胶分离PCR产物，切胶回收大小越为1.4kb的DNA片段(如图1所示)，通过连接酶将其与PMD19-T载体连接，构建克隆载体pMD19-T-UH，连接产物转化大肠杆菌JM109，摇瓶培养提取质粒，酶切验证并送上海生工生物公司测定核苷酸序列，得到如核苷酸序列表SEQ ID N0.1中所示，通过三联体密码子翻译，得到如氨基酸序列表SEQ IDN0.2中所示。
[0032]实施例2:表达载体和表达体系的构建
[0033]克隆载体pMD19-T-UH和pET20b (+)质粒分别经Nde I和BamH I双酶切后，用0.8%琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，并分别回收1.4kb和3.7kb大小的DNA片段，经连接酶连接反应，构建pET20b (+) -UH表达载体，连接产物转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，经氨苄青霉素平板筛选得到阳性克隆子，培养提取重组质粒，经Nde I和BamH I双酶切验证并送上海生工生物公司测序，证明含有正确的插入片段(如图2所示)，从而得到重组氨基甲酸乙酯水解酶的外源表达体系E.coli BL21 (DE3)/pET20b(+)-UH。
[0034]实施例3:氨基甲酸乙酯水解酶的重组表达
[0035]挑取基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET20b(+)-UH单菌落，接种于25mL、含有50 μ g/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C震荡培养过夜。第二天按2%接种量转接如上液体培养基中，培养至菌浓OD6tltl=0.6时，加入IPTG至终浓度为0.lmmol/L诱导，培养15h，离心收集菌体，通过超声破壁、离心取上清，测定酶活(如文献Zhao C, Kobashi K(1994)Purification and characterization of iron-containing urethanase from Bacilluslicheniformis.Biol Pharm Bulll7(6): 773-778 中测定酶活的方法)并通过SDS-PAGE检测蛋白表达量。从图3中可知，与未连接有目的条带的空载体泳道相比，诱导后泳道在50kDa处有与预测大小一致的目标条带，证明重组蛋白在此表达体系中实现了表达，蛋白表达量占总蛋白量的约20%，酶活力为`83.5U/g湿菌体。
【权利要求】
1.一种氨基甲酸乙酯水解酶基因，其特征在于: 1)具有SEQID NO:1所示的核苷酸序列； 2)编码SEQID N0:2所示蛋白质。
2.如权利要求1所述的氨基甲酸乙酯水解酶基因，其特征在于所述氨基甲酸乙酯水解酶基因源自梭形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)。
3.权利要求1所述氨基甲酸乙酯水解酶基因编码的蛋白质，氨基酸序列如SEQIDN0:2所示或在SEQ ID NO:2所示序列基础上发生一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有相同酶活性的蛋白质。
4.含有权利要求1所述氨基甲酸乙酯水解酶基因的重组载体。
5.含有权利要求1所述氨基甲酸乙酯水解酶基因的转基因细胞系。
6.权利要求1所述氨基甲酸乙酯水解酶基因在制备重组氨基甲酸乙酯水解酶中的应用。
7.利用权利要求1所述氨基甲酸乙酯水解酶基因构建基因工程菌的方法，包括如下步骤:构建含有所述氨 基甲酸乙酯水解酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离得到含有重组氨基甲酸乙酯水解酶的菌体细胞。
【文档编号】C12N15/55GK103451216SQ201310411144
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年9月10日 优先权日:2013年9月10日
【发明者】陈坚, 方芳, 李京京, 刘庆涛, 堵国成 申请人:江南大学