专利名称：高启动强度宽宿主范围组成型表达质粒pETPc及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是基因工程领域表达质粒及应用，尤其是关于高启动强度宽宿主范 围组成型表达质粒PETPc及其在生物降解和生物修复领域的应用。
背景技术：
基因表达系统在生物降解和生物修复领域具有重要作用，是进行外源基因表达的 重要工具。现在常用的基因表达系统，比如tac启动子表达系统、Tn7启动子表达系统以及 一些光照诱导型或者温度诱导型启动子表达系统等，都有一个共同的缺陷，即启动子诱导 表达需要额外添加诱导因子，如IPTG、温度变化、光照变化等。这为生物降解和生物修复带 来了额外的操作，增加了成本，而且，在环境领域应用时增加了表达系统实施的难度，并可 能会给环境带来负面的影响(Di Gennaro et al. ,2008 ；Choi et al.，2005)。因而，有必 要开发新的不受上述限制的组成型表达质粒。芳烃类化合物是一类重要的致癌物质，在环境中广泛存在，不但对环境造成了严 重污染，而且严重威胁人类健康。利用微生物，通过生物降解和生物修复来消除环境污染已 经成为现在重要的研究课题。儿茶酚又称邻苯二酚，是许多芳烃类化合物代谢的中间产物。 儿茶酚双加氧酶能够作用于芳烃类化合物代谢的中间产物邻苯二酚，它催化苯环的邻位裂 解。这一特性使该酶在芳烃类化合物代谢中处于重要的地位，对消除芳烃类化合物的环境 污染具有重要的意义。参考文献Di Gennaro P,Ferrara S,Bestetti G,et al. Novel auto-inducing expression systems for the development of whole—cell biocatalysts. Appl Microbiol Biotechnol，2008，79 :617_625.Choi K H, Gaynor J B, White K G, et al. (2005)A Tn7_based broad-range bacterial cloning and expression system. Nat Methods, 2005, 2 :443-448.
发明内容
针对现有质粒的缺陷以及现阶段环境污染的现状，本发明的目的是提供一种高启 动强度宽宿主范围的组成型表达质粒，并使其应用于在革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌中表 达儿茶酚双加氧酶。本发明所述高启动强度宽宿主范围组成型表达质粒，命名为pETPc，由复制子 Ori1■、筛选标记基因Kan(卡那霉素抗性基因)、多克隆位点、基因间序列和高启动强度组 成型启动子Pc;其特征在于，所述质粒pETPc的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示；其中，所 述高启动强度组成型启动子Pc的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。本发明所述的质粒pETPc的构建方法是合成启动子Pc，共225bp。以上述合成的Pc片段为模板，设计引物如下
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Pc. f (划线部分为 MluI 酶切位点)CATGACGCGTTGCCGATACAAGAACAAPc. r (划线部分为 XbaI 酶切位点)GTCATCTAGAACGGGTTCGCTACCTGC然后配制反应体系ddH2034 μ l，dNTP Mixture (2. 5mM each)4 μ 1, IOXEasy Taq Buffer 5 μ 1, Sense Primer (20 μ Μ) 0. 5 μ l,Anti Primer (20 μ Μ) 0. 5 μ 1, life.DNA(^^ 启动子 Pc 片段)0. 5 μ 1, Easy Taq 1μ 1。体系配好以后进行聚合酶链式反应(PCR)，循环如下940C 4min ；之后 94°C 30s，55°C 30s, 72°C 30s，共 29 个循环；最后 72°C IOmin0分别用相应的核酸内切酶对扩增产物和宽宿主范围表达质粒pET28a(核苷酸序 列如SEQID No.3所示)进行酶切，DNA连接酶连接，进行鉴定，获得阳性重组质粒，命名为 PETPc ；所述质粒pETPc的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示。本发明所述质粒pETPc在革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌中表达儿茶酚双加氧酶 的应用。其中，所述儿茶酚双加氧酶的表达是以在质粒PETPc启动子Pc后插入儿茶酚双加 氧酶的基因bphC(核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示)实现。儿茶酚双加氧酶基因bphC表达的酶为儿茶酚双加氧酶BphC，该酶的特性在于，它 可以迅速的催化化合物儿茶酚生成2-羟基粘糠酸半醛，2-羟基粘糠酸半醛是一种有黄颜 色的化合物，而儿茶酚是无色的。实验中通过核酸内切酶酶切、DNA连接、转化等分子操作， 将儿茶酚双加氧酶基因bphC插入到启动子Pc后边，然后将质粒转化不同的菌株，通过向转 化子平板喷涂儿茶酚水溶液，观察转化子的颜色变化来方便的检测转化子是否具有催化化 合物儿茶酚生成2-羟基粘糠酸半醛的能力，从而检测本发明质粒是否可以组成型表达以 及质粒的宿主适用范围，并通过儿茶酚双加氧酶活性的测定检测质粒的其它特性。上述质粒pETPc的应用步骤为从假单胞菌P. putida B6-2 (CGMCC No. 3758)中提 取基因组，以此为模板，PCR扩增得到基因bphC，然后分别设计带有不同核酸内切酶酶切位 点的引物，以扩增产物为模板重新进行扩增，然后分别用相应的核酸内切酶对扩增产物和 质粒pETPc进行酶切，DNA连接酶连接，进行鉴定，获得阳性重组质粒pETPcbphC。以此为 基础，将重组质粒以电穿孔转化法转化不同的宿主，如革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。通过 喷涂」L茶酚水溶液以及菌落PCR检测。研究结果表明pETPc可以优选适用于革兰氏阴性菌 大肠杆菌((Escherichia coli Mach Tl)购买自北京全式金生物技术有限公司(TransGen Biotech, Co.))、荧光假单胞菌 CICC 23254 ((Pseudomonas f luorescens CICC 23254)购 自中国工业微生物菌种保藏管理中心)和革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌168((BacillUS subtilis 168，ATCC 23857)购自美国标准生物品保藏中心)等。本发明进一步对质粒pETPcbphC表达儿茶酚双加氧酶的酶活进行了检测。首先， 将经过验证正确的含有构建质粒的转化子Escherichia coli Mach/pETPcbphC过夜培养。 然后，按1 %接种量转接50ml/500ml LB三角瓶，摇床震荡培养。每两个小时取样，测定菌体 浓度(OD6J以及儿茶酚双加氧酶BphC的酶活。所述酶活测定方法为超声波破碎细菌，离心去除细胞碎片，取一定量粗酶液用 APbuffer (含10%丙酮的pH 7.5的PB缓冲液)稀释至3ml，加入50 μ 1的0. 2Μ的儿茶酚 溶液，振荡混勻。然后用UV-2500紫外分光光度计测定酶活的具体数据(见图3)。本发明利用细菌III型整合子中的启动子Pc与宽宿主范围表达质粒pET28a构建 了新的表达质粒pETPc，由于启动子Pc具有不需要诱导(即组成型表达)、启动强度高、启动速度快和适用范围广的特点(Xu et al.，2007)，将该启动子插入到质粒上，使得构建的 质粒具有该启动子的优点，即不需要诱导、启动强度高、启动速度快和适用范围广，正是目 前基因表达系统的很好的替代系统。为了检测本发明的质粒在生物降解和生物修复领域的 应用潜力，本发明以假单胞菌(P.putida)B6-2基因组为模板，聚合酶链式反应(PCR)克隆 儿茶酚双加氧酶的基因bphC，通过核酸内切酶酶切、DNA连接、转化等系列分子操作将其插 入到表达质粒PETPc中启动子Pc的后面，并检测了儿茶酚双加氧酶的酶活。通过自然转化 法和电穿孔转化法将构建质粒转化不同的革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，发现本发明的质 粒优选应用于革兰氏阴性菌大肠杆菌、荧光假单胞菌或革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌。以上 特点表明本发明的质粒PETPc具有宿主范围宽、组成型表达、启动效率高的特点，不需要外 加任何诱导物或者进行任何额外的诱导操作。本发明所提供的质粒的特点使其成为目前使 用的基因诱导表达系统的很好的替代系统，在生物降解和生物修复领域具有巨大的应用前
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ο所述的宿主，是指质粒转化的细菌细胞。所述的转化子，是指质粒转化到细菌中，接受质粒的细菌细胞叫做转化子。所述的活性检测，是指在启动子Pc后面连接外源基因，然后转化宿主细胞，通过 检测外源基因表达的酶的活性，来表征获得的启动子Pc片段是否具有功能活性。所述的组成型表达，是与诱导型表达相对应的一个概念，是指基因无需诱导即可 实现表达的一种基因表达方式。所述的诱导型表达，是指基因在通常情况下不表达或表达程度很低，但在诱导物 的作用下，该基因的转录和表达被启动或增强的一种基因表达方式。参考文献Xu H, Davies J, Miao V. (2007)Molecular characterization of class 3integrons from Delftiaspp. J Bacteriol,2007,189 :6276_6283.
图1质粒pETPc图谱，图中Ori16tltl为复制子，Kan为卡那霉素抗性基因，fl region 为该质粒的独有区域，与本发明的内容没有关系。图2质粒pETPcbphC图谱，图中Ori16tltl为复制子，bphC为儿茶酚双加氧酶的基因， Kan为卡那霉素抗性基因，fl region为该质粒的独有区域，与本发明的内容没有关系。质粒pETPcbphC的构建是为了通过基因bphC来检测质粒pMMPc的特性。图3为转化子E. coli Mach Tl/pETPcbphC菌体浓度和酶活数据曲线。
具体实施例方式下面结合具体的实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明，而 不用于限制本发明的范围。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法，如 Sambrook 等分子克隆实验室手册(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press， 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1pET28a(购自美国英杰生命技术有限公司(Invitrogen，Co.，USA))质粒提取
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质粒的少量提取使用TIANGEN TIANperp Mini Plasmid Kit质粒小体试剂盒(离 心柱型)完成。①柱平衡步骤向吸附柱CB3 (吸附柱放入收集管中)，加入500 μ 1的平衡液BL， 12, OOOrpm(-13400*g)离心lmin，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。②取l-5ml过夜培养的细菌，加入离心管中，12，OOOrpm(_13400*g)离心lmin，尽 量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。③向留有菌体沉淀的离心管中加入250 μ 1溶液Pl (请先检查是否已加入 RNaseA)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。注意如果有未彻底混勻的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。④向离心管中加入250 μ 1溶液Ρ2，温和地上下翻转4-6次使菌体充分裂解。注意温和的混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有 基因组DNA片段。此时菌液变得清亮粘稠，所用时间不超过5min，以免质粒受到损坏。⑤向离心管中加入350 μ 1溶液P3，立即温和的上下翻转6-8次，充分混勻，此时将 出现白色絮状沉淀。12，OOOrpm(_13400*g)离心lOmin，此时在离心管底部形成沉淀。注意P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀， 可再次离心后取上清。⑥小心将上清倒入或移入吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，注意尽量不要吸 出沉淀。室温放置l-2min，12，OOOrpm(_13400*g)离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将 吸附柱重新放回收集管中。⑦向吸附柱CB3中加入700μ 1漂洗液PW(请先检查是否已加入无水乙醇)， 12，OOOrpm(_13400*g)离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。⑧向吸附柱CB3中加入500 μ 1漂洗液Pff, 12，OOOrpm(_13400*g)离心30-60秒， 倒掉收集管中的废液。⑨将吸附柱CB3重新放回收集管中，12，OOOrpm(-13400*g)离心2min，目的是将吸
附柱上残存的漂洗液除去。注意漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。为确保下 游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱CB3开盖，置于室温或50°C温箱放置数分钟，以 彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。⑩将吸附柱CB3置于一个干净的离心管中，向吸附膜中间部位滴加50-100 μ 1洗 脱缓冲液ΕΒ，室温放置lmin，12，OOOrpm(_13400*g)离心2min将质粒溶液收集到离心管中。DNA凝胶电泳检测，通过试剂盒提取到了质粒pET28a。实施例2假单胞菌(Pseudomonas putida) B6-2 (发明人保藏于中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心CGMCC No. 3758)基因组提取。基因组的少量提取使用Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega Corporation, Madison, WI, USA)完成。①取1. 5ml过夜培养的细菌，加入离心管中，12，OOOrpm(_13400*g)离心lmin，尽 量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。②加入600 μ 1核酸裂解液，轻轻混勻。
③80°C，温育5min，然后冷却至室温。④加入3μ 1 RNA酶，混勻，37°C，温育15-60min，然后冷却至室温。⑤加入200 μ 1蛋白抽提液，旋涡混勻。冰浴5min。然后13，OOOrpm，离心3min。⑥将上清转移至新的印pendorf管中，加入600 μ 1异丙醇，混勻。13，OOOrpm，离 心3min，弃掉上清液。⑦向印pendorf管中加入600μ1室温的70%乙醇，轻轻震荡混勻。然后 13，OOOrpm，离心 3min。⑧弃上清，室温放置10-15min，使印pendorf管晾干。⑨加入100 μ 1溶解液65°C放置lh，或者4°C过夜溶解基因组DNA。DNA凝胶电泳检测，通过试剂盒提取到了假单胞菌B6-2的基因组。实施例31.聚合酶链式反应(PCR)克隆基因bphC引物设计如下bphC. f (划线部分为NheI酶切位点)CGTAGCTAGCTCGACGAAGGAGACAGTAATGAGCATCAbphC. r (划线部分为HindIII酶切位点)GATCAAGCTTCTAGATCATGCTTTGTTGCGCGCAG①反应体系的配制ddH2034 μ 1, dNTP Mixture (2. 5mM each)4 μ 1, IOXEasy Taq Buffer 5 μ 1, Sense Primer (20 μ Μ) 0. 5 μ l,Anti Primer (20 μ Μ) 0. 5 μ 1, life. DNA(P. putida Β6-2 SS^l )0. 5 μ 1，Easy Taq 1 μ 1。②聚合酶链式反应(PCR)循环具体步骤为94°C4min ；之后 94°C 30s，55°C 30s，72°C lmin，共 29 个循环；最后 72°C IOmin。DNA凝胶电泳检测，扩增出了基因bphC。2.聚合酶链式反应(PCR)克隆基因Pc(Pc基因片段由北京六合华大基因科技股份 有限公司合成)。引物设计如下Pc. f (划线部分为 MluI 酶切位点)CATGACGCGTTGCCGATACAAGAACAA
Pc. r(划线部分为 XbaI 酶切位点)GTCATCTAGAACGGGTTCGCTACCTGC①反应体系的配制ddH20 34 μ l，dNTP Mixture (2. 5mM each)4 μ 1，IOXEasy Taq Buffer 5 μ 1, Sense Primer (20 μ Μ) 0. 5 μ l,Anti Primer (20 μ Μ) 0. 5 μ 1, life.DNA(AXn^ 成的启动子Pc片段)0.5 μ 1，EasyTaq 1μ L·②聚合酶链式反应(PCR)循环具体步骤为94°C4min ；之后 94°C 30s，55°C 30s，72°C 30s，共 29 个循环；最后 72°C IOmin。DNA凝胶电泳检测，扩增出了基因Pc。实施例4pETPc, pETPcbphC 质粒的构建LpETPc质粒的构建
提取pET28a 质粒，PCR 扩增 Pc 启动子，Pc. f (MluI) Pc. r (XbaI)，用 MluI 和 XbaI 酶 切处理pET28a质粒和PCR扩增的Pc启动子(核酸内切酶MluI 0. 5 μ 1，核酸内切酶XbaI 0. 5 μ 1,10 XBuffer 1μ 1，DNA 8 μ 1，37°C，2小时)，连接，转化大肠杆菌，用菌落PCR方法 筛选转化子。通过筛选得到了质粒pETPc，其核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示。2. pETPcbphC 质粒的构建①提取pETPc质粒，NheI和HindIII双酶切(核酸内切酶NheI 0.5μ1，核酸内切 酶 HindIII 0. 5μ 1，IOXBuffer 1 μ 1，DNA8 μ 1，37°C，2 小时)，切胶回收纯化质粒 pETPc。②扩增基因bphC (bphC. f (NheI) bphC. r (HindIII)), NheI 和 HindIII 酶切 PCR 产 物(酶切反应同步骤①)，然后与上述酶切好的PETPc质粒连接(10XT4DNA Ligase Buffer 1μ l，T4DNALigase 1μ 1，质粒片段1. 5 μ 1，基因bphC片段6. 5 μ 1，16°C，过夜连接)，转化 大肠杆菌，通过常规方法筛选具有基因活性的转化子，得到了质粒PETPcbphC，其核苷酸序 列如SEQ IDNo. 5所示。实施例5构建质粒宿主适用范围检测1.质粒pETPc，pETPcbphC通过自然转化法转化大肠杆菌(大肠杆菌Mach Tl ((Escherichia coll Mach Tl)购买自北京全式金生物技术有限公司(TransGen Biotech, Co.)))。①制备大肠杆菌感受态细胞。②将10 μ 1质粒加入100 μ 1感受态大肠杆菌细胞，混合均勻，冰浴30min。③37 °C水浴保温5min。④冰浴2min，加入400 μ 1 LB液体培养基，37°C培养lh。⑤取100 μ 1培养物，涂布抗性平板，培养过夜。经过常规方法验证，得到了Ε. coli Mach Tl/pETPc, Ε. coli Mach Tl/pETPcbphC 转化子。2.质粒pETPcbphC通过电穿孔转化法转化假单胞菌(荧光假单胞菌CICC 23254((Pseudomonas fluorescens CICC 23254)购自中国工业微生物菌种保藏管理中 心))。①制备假单胞菌感受态。②向150μ 1感受态细胞中加入10μ l(50ng/y 1)DNA，转移到冰浴预冷的电转杯 中，冰上放置1 1. 5min。③电击25 μ F，200 Ω，时间常数为4. 5 5. 0ms，低于4. 2ms，则效率明显下降。④电击完毕后取出杯子并立即加入Iml恢复培养基，30°C孵育lh。⑤涂布抗性平板，30°C过夜培养。经过常规方法验证，得到了Pseudomonas fluorescens/pETPcbphC 转化子。3.质粒pETPcbphC通过电穿孔转化法转化枯草芽孢杆菌(枯草芽孢杆菌 168 ((Bacillus subtilis 168，ATCC 23857)购自美国标准生物品保藏中心))。①枯草芽孢杆菌感受态的制备。②向80μ 1感受态细胞中加入1μ l(50ng/y 1)DNA，转移到冰浴预冷的电转杯中， 冰上放置1 1. 5min。
③电击25 μ F，200 Ω，时间常数为4. 5 5. 0ms，低于4. 2ms，则效率明显下降。④电击完毕后取出杯子并立即加入Iml恢复培养基，37°C孵育3h。⑤涂布抗性平板，37 °C过夜培养。经过常规方法验证，得到了 B. subtilis/pETPcbphC转化子。4.向转化子平板喷涂儿茶酚水溶液，通过转化子菌落颜色变化检测质粒是否可以 组成型表达以及它的适用范围。结果发现质粒PETPc可以优选适用于革兰氏阴性菌株菌株大肠杆菌、荧光假单胞 菌或革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌。5.菌落PCR检测转化子挑取转化子菌落至LB摇管，过夜震荡培养，取Iml菌液，离心，弃上清，菌泥用 100 μ 1无菌水悬浮，沸水浴lOmin，然后离心，以上清作为模板，进行实施例3所述的聚合酶 链式反应，扩增出了 SOObp左右的条带，证明转化子中含有正确的构建质粒。实施例6构建质粒诱导强度检测将经过验证正确的含有构建质粒的转化子E. coli Mach/pETPcbphC过夜培养。按接种量转接50ml/500ml LB三角瓶，30°C摇床震荡培养。转化子E. coli Mach/pETPcbphC不加任何诱导物也不进行任何其他的诱导操作。每两个小时取样，测定菌 体浓度(OD6J以及儿茶酚双加氧酶(BphC)的酶活。酶活测定方法超声波破碎细菌，离心去除细胞碎片，取一定量粗酶液用AP buffer (含10%丙酮的pH 7. 5PB缓冲液)稀释至3ml，加入50 μ 1的0. 2Μ的儿茶酚溶液， 振荡混勻。然后用UV-2500紫外分光光度计测定酶活的具体数据(具体数据见图3)。
权利要求
一种高启动强度宽宿主组成型表达质粒，命名为pETPc，由复制子ori1600、筛选标记基因Kan(卡那霉素抗性基因)、多克隆位点、基因间序列和高启动强度组成型启动子Pc组成；其特征在于，所述质粒pETPc的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；其中，所述高启动强度组成型启动子Pc的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.权利要求1中所述质粒pETPc在革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌中表达儿茶酚双加氧 酶的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述儿茶酚双加氧酶的表达是以在质粒 pETPc启动子Pc后插入儿茶酚双加氧酶的基因bphC实现。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述革兰氏阴性菌是大肠杆菌、荧光假单胞 菌，所述的革兰氏阳性菌是枯草芽孢杆菌。
全文摘要
本发明公开了一种启动强度高启动速度快宿主范围宽的组成型表达质粒pETPc及其在革兰氏阴性菌中表达儿茶酚双加氧酶的应用。本发明的质粒不但可以组成型启动外源基因的表达，不需要添加任何诱导物也不需要进行任何额外的诱导操作，而且启动强度高，诱导的速度快，表明该质粒在生物降解和生物修复领域具有巨大的应用潜力。
文档编号C12N9/02GK101955968SQ20101027757
公开日2011年1月26日 申请日期2010年9月9日 优先权日2010年9月9日
发明者徐友强, 许平, 陶飞, 马翠卿 申请人:山东大学