专利名称：牛樟芝抗癌活性物质、制备方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明是关于一种牛樟芝抗癌活性物质、制备方法及其用途，特别是指一种可以抑制肝癌细胞增殖，以达到抗肝癌效果的牛樟芝活性物质。
背景技术：
牛樟芝(Antrodia cinnamomea)是一种寄生于牛樟树(Cinnamomum kanchiraiHayata, Lauraceae)中空树干内的微生物，原生于台湾。牛樟芝具有多种促进健康的功效，包括抗氧化、抗发炎、抗肿瘤活性等(Chang and Chou,2004 ；Mau，Huang，Huang， and Chen, 2004 ；Song and Yen, 2003 ；Hseu, Chang, Hseu, Lee, Yech, and Chen, 2002 ；Shen, Chou, Wang, Chen, Chou, and Lu, 2004 ；Ao et al.，2009)。这种真菌在传统上被用于治疗肝脏疾病，但其抗肿瘤活性，特别是抗肝癌活性，已经引起广泛的注意。牛樟芝子实体所含的数种化合物已被分离出来，并且被辨识出具有抗肿瘤的活性。Lien与其它人自干燥的牛樟芝子实体中分离出4，7_ 二甲氧基-5-甲基_1，3_亚甲二氧基苯G，7-dimethoxy-5-methyl-l，3-benzodioxole)，并且发现该化合物可抑制人类结肠细胞的增殖(Lien et al. ,2009) 此外，自牛樟芝中分离的M-methylenelanosta-7， 9-(ll)-diene-3^ ,15 α-diol-21-oic (MMHOl)被证实可以抑制人类血癌细胞U937与胰脏癌细胞 BxPC3 的生长(Chen，Chou, and Chang, 2009)。除了抗肿瘤的活性之外，也有一些被分离出来的牛樟芝活性成分，已被证实具有抗发炎的效果；Yang等人(2009年)从牛樟芝菌丝体中分离出antroquinonol B、 4-acetyl-antroquinonol B、2,3_ (methylenedioxy)-6-methylbenzene-l, 4-diol、2, 4-dimethoxy-6-methyl-benzene-l,3-diol>antrodin D S 5^RM^^S^^M^ 抑制一氧化氮的产生具有一定的效果，进而可以达到一定的抗发炎作用。因为牛樟芝的高医疗价值以及缓慢的生长速度，牛樟的子实体的价格居高不下。 为了满足市场上对此一药用真菌庞大的需求量，目前已有使用液体发酵培养牛樟芝菌丝体来进行工业级生产(Shin，Pan，and Heieh，2006)。虽然牛樟芝的医疗效果已引起人们广泛的注意，但针对牛樟芝菌丝体内抗癌成分的分离与鉴定的研究并不多；Nakamura等人自牛樟芝菌丝体中发现五种苹果酸与琥珀酸的衍生物，这些成分对于LLC肺癌肿瘤细胞株具有细胞毒性效果(cytotoxic effects)，且其半数有效浓度(EC50)的范围在 3. 6 至 20 μ g/mL 之间(Nakamure et al. ,2004) Cheng、 Huang、Chang、Wang与Lu等人则于2005年证实自牛樟芝分离出来的多醣体可以透过抑制血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGF receptor) 讯号传导，而抑制周期素DKcyclin Dl)的表现，导致抑制血管新生。肝癌是流行于中国、台湾、韩国与撒哈拉沙漠以南的非洲等地区致死率最高的恶性月中瘤之[(Seow, Liang，Leow, and Chung，2001 ；Kern, Breuhahn, andSchirmacher， 2002)。数篇研究指出，牛樟芝菌丝体可以保护肝脏免于酒精、四氯化碳(CC14)以及脂多醣 (Iipopolysaccharide)的伤害(Dai et al.，2003 ；Lu et al.，2007 ；Hsiao et al.，2003 ；Song and Yen, 2003 ；Hattori and Sheu，2006 ；Ao et al.，2009)。Guo 等人发现牛樟芝菌丝体对于由二甲基亚硝胺(dimethylnitrosamine，DMN)所引起的肝纤维化具有逆转的效果 (Guo,2002)。牛樟芝菌丝体甲醇萃取物也被发现于体外试验中可抑制肝癌细胞的增殖，且其对H印G2与IfepIBB肝癌细胞株的半数抑制浓度(IC50)分别为49. 5与62. 7 μ g/mL(Song, Hsu, and Yen, 2005) 0 Pan等人使用5吨的发酵槽培养牛樟芝，发现牛樟芝菌丝体乙醇萃取物对H印G2肝癌细胞的半数抑制浓度(IC50)为4. 25 μ g/mL (Pand, Chen, Sheen, andChiang, 2008)。虽然已有足够的证据显示牛樟芝菌丝体具有抗肝癌的功能，但其确切的生物活性组成物为何仍不清楚。
发明内容
本发明的目的即在于提供一种牛樟芝抗癌活性物质，该活性物质具有抑制肝癌细胞增殖进而达到抗肝癌的效果。本发明的次一目的即在于提供一种牛樟芝抗癌活性物质的制备方法，是以牛樟芝菌丝体做为材料萃取而得该牛樟芝抗癌活性物质。本发明的另一目的即在于提供一种牛樟芝抗癌活性物质的用途，是将该活性物质用于制备抗癌的药物。可达成上述发明目的的牛樟芝活性物质，是将牛樟芝菌丝体经过下列步骤所产生者步骤1 将牛樟芝菌丝体以液体酸酵培养；步骤2 将步骤1所得菌丝体经过乙醇萃取，得到乙醇萃取物；步骤3 将步骤2所得乙醇萃取物浓缩后溶于水中，并加入等体积的乙酸乙酯 (ethyl acetate)萃取，得到乙酸乙酯萃取物；步骤4 将步骤3所得乙酸乙酯萃取物以胶体管柱层析纯化，并以正己烷/乙酸乙酯梯度流洗液(hexane/ethyl acetate gradient elution)做为流洗液(100%/0%正己烷/乙酸乙酯拉梯度至0% /100%正己烷/乙酸乙酯)，最后再以100%甲醇(methanol) 冲洗，每七百毫升收集一瓶；其中以80 %正己烷/20 %乙酸乙酯至70 %正己烷/30 %乙酸乙酯流洗可得到片段f、以70 %正己烷/30 %乙酸乙酯到60 %正己烷/40 %乙酸乙酯流洗可得到片段g ；步骤5 将步骤4所得流洗液片段g以胶体管柱层析纯化，并以正己烷/乙酸乙酯梯度流洗液(80% /20%正己烷/乙酸乙酯拉梯度至50% /50%正己烷/乙酸乙酯)做为流洗液，最后再以100%乙酸乙酯冲洗，每五十毫升收集一瓶，即可取得流洗液片段E、F、G、 H、I ；其中片段E为80%/20%正己烷/乙酸乙酯至75%/25%正己烷/乙酸乙酯流洗所得到，片段F、G为75% /25%正己烷/乙酸乙酯流洗依序分别所得到，片段H为75% /25%正己烷/乙酸乙酯至70% /30%正己烷/乙酸乙酯流洗依序分别所得到，片段I为70% /30% 正己烷/乙酸乙酯流洗所得到；步骤6 于步骤5所得的“流洗液片段E、F、G、H、I”可进一步以适用的纯化分离方法，将该些活性物质进一步纯化分离出4-安卓奎诺尔BG-acetylantroquinonol B)；该纯化分离方法包含但不限于胶体管柱层析；其中该乙醇萃取物、乙酸乙酯萃取物、流洗液片段f、流洗液片段g、流洗液片段E、F、G、H、I及4-安卓奎诺尔B(4-acetylantroquinonol B)即为牛樟芝抗癌活性物质。该些牛樟芝抗癌活性物质除可直接施用、治疗癌症外，亦可作为制备该些抗癌、治疗癌症的医药组合物、或适用用途的物用原料。本发明所述的“牛樟芝抗癌活性物质”包含乙醇粗萃取液、乙酸乙酯萃取物、流洗液片段f、流洗液片段g、流洗液片段E、F、G、H、I及4-安卓奎诺尔 B(4-acetylantroquinonol B)等经由本发明制备方法所制得的抗癌活性物质。于一较佳实施例所用的牛樟芝是得自寄存于财团法人食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心的牛樟芝BCRC35716，但本发明所述的牛樟芝活性物质不限于由此菌种所得。于一较佳实施例中，该液体酸酵培养步骤为在含有2%葡萄糖与2%麦芽萃取物的发酵培养液(pH值为4. 5 5. 5)，以20 25°C、槽压0. 5 lvvm、20 IOOrpm搅拌速率条件下培养四周。于一较佳实施例中，该乙醇萃取步骤为将牛樟芝菌丝体干燥后，以90 99%乙醇与该菌丝体混合，该牛樟芝菌丝体与乙醇的比例为1 10 1 50(g/ml)，接着以均质机混合12 48小时。于一较佳实施例中，该步骤4所用的胶体管柱为硅胶管柱(silica ge 1 chromatography)，230-400 蹄孑L，750_75mmo于一较佳实施例中，该步骤5所用的胶体管柱为硅胶管柱(silica gel chromatography), 230-400 筛孔，420_25mm。于一较佳实施例中，该步骤6所用的胶体管柱为硅胶管柱Lima 5u Silica (2) 100A column(4.6X250nm)；其中所用的流洗液为正己烷/乙酸乙酯混合液，其比例为80 20。另外，本发明并提供一种抗癌组成物，是包含上述有效量的牛樟芝抗癌活性物质， 以及适当的稀释剂、赋形剂或载体；且该抗癌组成物是可抑制癌细胞的增殖。本发明进一步提供一种用于抗癌的药学组成物，包含一有效量的4-安卓奎诺尔 B (4-acetylantroquinonol B)，以及一载齐Ll ；i亥 4_ 安卓若尔 B (4-acetylantroquinonol
B)具有下列化学结构
权利要求
1.一种牛樟芝抗癌活性物质，是将牛樟芝菌丝体经过下列步骤所产生者步骤1 将牛樟芝菌丝体以液体酸酵培养；步骤2 将步骤1所得菌丝体经过乙醇萃取，得到乙醇萃取物；步骤3 将步骤2所得乙醇萃取物浓缩后溶于水中，并加入等体积的乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯萃取物；步骤4 将步骤3所得乙酸乙酯萃取物以胶体管柱层析纯化，并以正己烷/乙酸乙酯梯度流洗液为流洗液，以80 %正己烷/20 %乙酸乙酯至70 %正己烷/30 %乙酸乙酯流洗可得到片段f、以70%正己烷/30%乙酸乙酯到60%正己烷/40%乙酸乙酯流洗可得到片段g ；步骤5 将步骤4所得流洗液片段g以胶体管柱层析纯化，并以正己烷/乙酸乙酯梯度流洗液，以取得流洗液片段E、F、G、H、I ；其中片段E为80%/20%正己烷/乙酸乙酯至75% /25%正己烷/乙酸乙酯流洗所得到，片段F、G为75% /25%正己烷/乙酸乙酯流洗依序分别所得到，片段H为75% /25%正己烷/乙酸乙酯至70% /30%正己烷/乙酸乙酯流洗所得到，片段I为70% /30%正己烷/乙酸乙酯流洗所得到；以及步骤6 将步骤5所得的流洗液片段E、F、G、H、I，以胶体管柱层析纯化出4-安卓奎诺尔B;其中该乙酸乙酯萃取物、流洗液片段f、流洗液片段g、流洗液片段E、F、G、H、I及4-安卓奎诺尔B，即为牛樟芝抗癌活性物质。
2.如权利要求1所述的牛樟芝抗癌活性物质，其特征是，所述菌丝体为寄存于财团法人食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心的牛樟芝BCRC35716。
3.如权利要求1所述的牛樟芝抗癌活性物质，其特征是，所述液体酸酵培养步骤为在含有2%葡萄糖与2%麦芽萃取物的发酵培养液内，以20 25°C、槽压0. 5 lvvm、20 IOOrpm搅拌速率条件下培养。
4.如权利要求3所述的牛樟芝抗癌活性物质，其特征是，所述发酵液的pH值为4.5 5 · 5 ο
5.如权利要求1所述的牛樟芝抗癌活性物质，其特征是，所述乙醇萃取步骤为将牛樟芝菌丝体干燥后，以90 99%乙醇与该菌丝体混合，以均质机混合之。
6.如权利要求5所述的牛樟芝抗癌活性物质，其特征是，所述牛樟芝菌丝体与乙醇的比例为 1 10 1 50 (g/ml) O
7.如权利要求1所述的牛樟芝抗癌活性物质，其特征是，所述步骤4所用的胶体管柱为硅胶管柱，230-400筛孔，750-75mm。
8.如权利要求1所述的牛樟芝抗癌活性物质，其特征是，所述步骤5所用的胶体管柱为硅胶管柱，230-400筛孔，420-25mm。
9.如权利要求1所述的牛樟芝抗癌活性物质，其特征是，所述于步骤6的胶体管柱层析所用的胶体管柱为硅胶管柱Lima 5u Silica (2) 100A column^. 6 X 250nm)，且其所用的流洗液为正己烷/乙酸乙酯混合液，其比例为80 20。
10.如权利要求1所述的牛樟芝抗癌活性物质，其特征是，所述抗癌活性物质是可抑制肝癌细胞、大肠癌细胞及摄护腺癌细胞的增殖。
11.一种抗癌组成物，其特征是，包含有权利要求1所述的有效量牛樟芝抗癌活性物质，以及适当的稀释剂、赋形剂或载体。
12.如权利要求11所述的抗癌组成物，其特征是，所述抗癌活性物质是可抑制肝癌细胞、大肠癌细胞及摄护腺癌细胞的增殖。
13.—种4-安卓奎诺尔B的用途，其是用于制备抗癌的药物。
14.如权利要求13所述的用途，其特征是，所述4-安卓奎诺尔B具有下列化学结构
全文摘要
本发明公开了一种牛樟芝抗癌活性物质，制备方法及其用途，所述牛樟芝抗癌活性物质是将牛樟芝菌丝体经过下列步骤所产生者(1)将牛樟芝菌丝体以液体酸酵培养；(2)将所得菌丝体经过乙醇萃取，得到乙醇萃取物；(3)将所得乙醇萃取物浓缩后溶于水中，并加入等体积的乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯萃取物；(4)将所得乙酸乙酯萃取物以胶体管柱层析纯化，并以正己烷/乙酸乙酯梯度流洗液为移动相，得到流洗液片段g；以及(5)将所得流洗液片段g再以胶体管柱层析纯化，并以正己烷/乙酸乙酯梯度流洗液，取特定流洗液片段，即可制得牛樟芝抗癌活性物质。本发明所提供的牛樟芝抗癌活性物质不仅纯化至单一组成分，并且可以在很低的剂量下达到抑制癌细胞的效果，该单一成分亦可使用化学合成方法制成，以达到抗癌效果。
文档编号C12P1/02GK102443613SQ20101050207
公开日2012年5月9日 申请日期2010年9月30日 优先权日2010年9月30日
发明者林育蔚, 蒋丙煌 申请人:蒋丙煌