专利名称：杂色鲍钙调蛋白cDNA序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学及功能基因应用相关领域，尤其是涉及杂色鲍钙调蛋白 cDNA序列。
背景技术：
钙调蛋白(Calmodulin)是一种存在于几乎所有的真核细胞中的钙结合蛋白。它 与Ca2+结合后可以进一步结合多种目标蛋白，从而调节包括炎症反应、代谢、细胞凋亡、肌 肉收缩、胞内运动、短期和长期记忆、神经生长及免疫反应等多种生理过程。因此，钙调蛋白 属于细胞信号通路中的上游关键基因，其表达量的上调或下降会引起下游信号途径中一系 列多种多样的反应和变化。目前，尚未在鲍鱼物种中鉴定到钙调蛋白相关基因及产物。
发明内容
本发明的目的是提供一种杂色鲍钙调蛋白cDNA序列。本发明以杂色鲍为材料，提取全组织(肌肉和内脏团)的总RNA，进行反转录后进 一步构建cDNA文库。挑取大量文库克隆送由测序公司测序后，通过生物信息学的方法从众 多序列中鉴定到一个钙调蛋白基因序列，具有钙调蛋白的保守结构域及活性中心。其具体 DNA核苷酸如下
cattagattg ccgtcttgta taacaaaggc atgtccaatc tgtcgcagag ggagaaacag attgatggaa acgggtacat caccctggat ctcggcttga cgcgacaaca gattgtggac ttgaccatta ccttaaacga attcttgtcg tcgtatggtg agatgaggtg ggcatttgac gacgctgatg agctgaagga agtgctgctc gtgaagacta tgattgccaa agtcgacatc tttattactc tttttggcta agactacgta tcaaagttga gtgatggttg ttcctaacgt
gaaacatttc tgtgaatccg agtccgagcg60
ctgtacacca ggttcttcca ccaggtggac120
gaactagcaa ccttgtgcaa aaaactcaag180
gtgtttatga acatggacac cgacaacaac240
gcaatgccaa agattgaacg tgaacaactc300
cagatagaca cagatggcag cggcctgctt360
aaatgtggac gttcattgac gttgtcacaa420
aacggtgacg gcaaattgaa ctttgatgaa480
ctccatgtaa tgacctcagt tcgacgaacg540
cgtg574
其相应的氨基酸序列如下
Met Ser Asn Leu Ser Gln Arg Glu Lys GlnLeu Try Thr Arg Phe
151015 Phe His Gln Val Asp lie Asp Gly Asn GlnTyr lie Thr Leu Asp
1620 2530 Glu Leu Ala Thr Leu Cys Lys Lys Leu LysLeu Gly Leu Thr Arg 31 35 4045 Gln Gln lie Val Asp Val Phe Met Asn MetAsp Thr Asn Asn Asn 46 50 5560
LeuThrIleThrLeuAsnGluPheLeuSerAlaMet ProLyslie
61657075
GluArgGluGlnLeuSerTyrGlyGluMetArgTrp AlaPheAsp
76808590
GlnIleAspThrAspGlySerGlyLeuLeuAspAla AspGluLeu
9195100105
LysGluValLeuLeuLysCysGlyArg SerLeuThr LeuSerGln
106110115120
ValLysThrMetIleAlaLysValAsplieAsnGly AspGlyLys
121125130135
LeuAsnPheAsp GluPheIleThrLeuPheGly
136140145
本发明还根据上述基因序列设计引物，对杂色鲍名-组织的钙调蛋白表达丰度，
及弧菌病原感染下鳃中表达量变化进行了 RT-PCR分析。发现该基因只在鳃中表达，病原 感染后的1小时，钙调蛋白基因表达被明显诱导，并在4小时后逐渐回落到正常水平，说明 该基因在鲍鱼免疫反应中发挥重要作用。本发明的优点钙调蛋白基因在鲍鱼中属于首次发现，并且只在鲍鱼的重要的免 疫器官鳃中表达。由于弧菌病原的感染能够上调其表达，说明该钙调蛋白基因在鲍鱼免疫 抗病反应中发挥重要作用。
图1是杂色鲍肌肉和内脏团总RNA电泳图；1 肌肉总RNA ；2 内脏团总RNA ；图2是杂色鲍cDNA的一链和二链的合成与均一化电泳图；M :DL2000plus ；泳道 1 :LD_PCR 扩增 cDNA 双链结果；泳道2:11个循环的Control ；泳道3 1/4倍DSN酶处理；泳道4 1/2倍DSN酶处理；泳道5 1倍的DSN酶处理；泳道6 1倍DSN处理的样品再次PCR扩增12个循环；图3是菌落PCR鉴定插入片段电泳图；A图插入片段为0. 5-lkb的文库克隆；B图插入片段为l_3kb的文库克隆；M :DL2000plus ；图4是杂色鲍钙调蛋白基因(plt32_e291)与其它物种中钙调蛋白基因Clustalw 聚类分析结果；图5是RT-PCR检测钙调蛋白(plt32_e291)在鲍鱼各组织中的表达的电泳图；其中，actin为内参基因；图6是RT-PCR检测病原感染下钙调蛋白在杂色鲍鳃中的表达情况的电泳图。
具体实施例方式1.主要试剂弧菌选择性培养基(TCBS)购自北京路桥生物技术有限公司；Trizol总RNA提取 试齐[J购自 Invitrogen 公司；Creator SMART cDNA Construction Kit 购自 Clontech 公司； Trimmer-Director kit ^ g Evrogen ^w] ；Ex TaqdNTP> DL2000 Marker> pDNR-LIB载体连接试剂盒、胶回收试剂盒等购自TaKaRa公司。2.处理与采样杂色鲍暂养于水温24士 1°C、盐度3%的过滤海水中，观察3天后用于实验。取哈 维氏弧菌B2D接种至营养琼脂培养基，28°C培养24h后，接种于TCBS培养基，28°C培养24h， 用灭菌生理盐水稀释至5X 105cfu/mL。取暂养的雌雄各5只杂色鲍，分别注射100 μ L菌 液，24h后，分别取肌肉和内脏团(包括鳃、肝胰腺、外套膜、性腺等)组织、用于提取总RNA。2. cDNA文库的构建2. 1 总 RNA 提取按照Trizol操作手册提取杂色鲍肌肉总RNA和内脏团总RNA，1. 5%琼脂糖凝胶 电泳和紫外分光光度计检测总RNA质量和含量，提取结果见图1，箭头所示的上方条带为 28srRNA,下方为 18s rRNA, 0D260nm/280nm 比值分别为 2. 02 和 2. 05，介于 1. 9 2. 2 之间， 符合RNA纯度要求。然后，等比例混合杂色鲍肌肉总RNA和内脏团总RNA。按照Creator SMART cDNAConstruction Kit的操作手册将混合后的总RNA合成一链和二链，用LD-PCR方法扩 增一链和二链。所得的产物再根据 Trimmer-Director kit (Evrogen, Cat. No. NK002)操作， 去除高拷贝基因，并对DSN处理的样品进行第二次PCR扩增。取5 μ L第二次PCR扩增所得 的产物，于1. 1 %含EB的胶上电泳检测cDNA合成结果(图2的A图)。可见cDNA长度大 于5000bp，Smear条带主要位于0. 5 5kb之间，尤其在0. 75 2kb处有明显的高拷贝基 因带，说明需要对产物做均一化处理。根据Trimmer-Director kit操作说明，进行均一化处理。从图2的B图中可以看 出，1倍DSN处理(泳道5)后，高拷贝基因条带已全部消除、smear带很均勻。取1倍DSN 处理的样品进行第二次PCR扩增，12个循环后取5 μ L产物电泳检测(图2的C图)。由第 6泳道的结果可见，cDNA片段长度比图B中的结果提高明显，达到了预期效果。2. 2连接产物的转化和文库鉴定将二次PCR产物用胶回收试剂盒纯化后进行SfiI酶切，然后分别割胶回收0. 5 1和1 3kb之间的片段，并与PDNR-LIB载体连接转化大肠杆菌DHlOB感受态。取适量菌 液按比例稀释后涂于氯霉素平板上，37°C培养过夜，统计克隆数并计算文库滴度，两个文库 库容均为 2. 5X 105cfu/mL。3.菌落鉴定及随机克隆测序挑取平板上15个菌落克隆，进行菌落PCR鉴定。PCR反应程序94°C预变性4分 钟；35个循环94°C变性40秒，53. 6°C退火40秒，72°C延伸4分钟；72°C充分延伸10分钟。 取适量PCR产物电泳检测并估算片段长度(图3)。由图3的A图可见插入片段长度基本在 0. 5-lkb之间，图3的B图中插入片段基本在l-3kb之间，并且PCR阳性率均达到了 100%。随机挑取10000个克隆送北京华大基因研究中心测序，使用phrap软件对EST序列进行拼接，并在NCBI网站上进行Blastx比对分析，以查找目标基因序列，发现其中一条 EST序列与其它物种中已知的钙调蛋白序列最相似(氨基酸水平相似性达到60% )，其序列 参见序列表SEQ ID NO. 1，由其推测的氨基酸序列见序列表SEQ ID NO. 2，但聚类结果表明 该序列位于动物、植物钙调蛋白之外的另一分支(图4)。4.钙调蛋白特异引物设计及测序验证根据NCBI的序列分析结果，以本发明的文库中钙调蛋白cDNA序列为模板，利用 NCBI网站上Primer-BLAST软件设计特异引物上游5，-CGAAACATTTCTGTGAAT-3，；下游5，-TGAGGTCATTACATGGAG-3，然后，进行PCR扩增全组织cDNA样品。对扩增得到的目的条带进行凝胶回收并送 由测序公司进行测序验证，测序结果与文库序列完全一致。5.钙调蛋白在鲍鱼各组织中的表达量分别切取成熟杂色鲍的血细胞、外套膜、鳃、性腺、腹足及肝胰腺各组织，提取总 RNAji RNA定量后取等量RNA反转录，以actin基因为内参基因，PCR特异扩增调整模板用 量使其一致，再使用上述钙调蛋白特异引物进行PCR检测，以比较不同组织样品中钙调蛋 白的表达量(图5)。6.病原感染下钙调蛋白基因鳃中的表达变化取哈维氏弧菌B2D接种至营养琼脂培养基，28°C培养24h后，接种于TCBS培养基， 28°C培养24h，用灭菌生理盐水稀释至5X 105cfu/mL，取壳长一致、成熟的杂色鲍雌雄各20 只杂色鲍，各注射100 μ L菌液，分别于0、1、2、4、8小时后取正常鲍鱼的鳃组织，每个时间点 雌雄各3只，合计30个样品，分别提取总RNA。将相同时间点的RNA样品等量混合，反转录 后进行RT-PCR检测。由电泳结果可见(图6)，细菌注射感染的鲍鱼鳃中，钙调蛋白在1小 时和2小时表达量明显上调，4小时后表达量有所回落，直到8小时降至感染之前(0小时) 水平，而注射PBS的鲍鱼中表达量没有明显变化。
权利要求
一种杂色鲍钙调蛋白cDNA序列，其特征在于它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所述。
2.根据权利要求1所述的杂色鲍钙调蛋白cDNA序列，其特征在于它的氨基酸序列如 SEQ ID NO. 2 所述。
全文摘要
本发明公开了一种杂色鲍钙调蛋白cDNA序列，它的核苷酸序列如SEQIDNO.1所述。本发明提供的钙调蛋白基因在鲍鱼中属于首次发现，并且只在鲍鱼的重要的免疫器官鳃中表达。由于弧菌病原的感染能够上调其表达，说明该钙调蛋白基因在鲍鱼免疫抗病反应中发挥重要作用。
文档编号C12N15/12GK101988065SQ201010537738
公开日2011年3月23日 申请日期2010年11月10日 优先权日2010年11月10日
发明者刘广锋, 姜敬哲, 王江勇, 王瑞旋 申请人:中国水产科学研究院南海水产研究所