一种编码缺刻缘绿藻油体钙蛋白的dna序列及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，具体地说，涉及一种编码缺刻缘绿藻油体钙蛋白 (MiClo)的DNA序列及其应用。
【背景技术】
[0002] 能源是人类社会发展的基础。目前全球正面临着能源危机，石油资源供应紧张， 而可再生性使生物能源的开发越来越受到社会的关注。微藻生物柴油以其不与人争粮、 不与粮争地、不与畜争料的独特优势吸引了越来越多科研工作者的关注。为了提高各种 油料作物的产油量，油体（oilbody, 0B)以及油体结合蛋白（proteinassociatedoil bodies)逐渐成为植物生物技术的新研宄目标。不同种类的微藻积累油滴的能力不同，其 中绿藻、硅藻等真核微藻的油脂含量比较高，有希望成为生物柴油的生产藻种。实验中所使 用的缺刻缘绿藻（MyrmeciaincisaReisiglH4301)是一种淡水单细胞微藻，隶属绿藻门 (Chlorophyta)。该藻能大量积累三酰甘油（TAG)，尤其是在缺氮条件下，这些TAG包裹在半 单位膜内以油滴的形式存在于细胞中，是潜在的微藻生物柴油藻种。
[0003]细胞的油体也称脂质体（lipidbody,LB)或脂滴（lipiddroplet,LD)，它们将为 细胞的未来生长提供所贮存的碳源和能量。细胞内的油体为了避免与质膜及细胞内膜的融 合，在其半单位膜上镶嵌着油体结合蛋白。研宄表明，这些油体结合蛋白中的油体钙蛋白 (caleosin)主要存在于真菌或者单细胞藻类，而油质蛋白（oleosin)主要存在于高等植物 中。某些低等植物例如藓类、苏铁类等植物也是以油体钙蛋白而不是油质蛋白作为它们的 主要油体结合蛋白。这表明油体钙蛋白具有维持油体结构完整性的保守功能。植物特别是 其种子中的油体可用来表达高附加值的蛋白质或携带疏水性的药物，通过油体结合蛋白也 能成功地生产出具有生物活性的葡萄醛酸酶（GUS)、木聚糖酶和水蛭素等。此外，植物油体 结合蛋白还可以通过与营养价值高的外源蛋白或多肽融合，改善种子的营养成分、提高种 子食用及作为饲料的品质、在作物高产和基因工程安全性等方面发挥着作用。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种分离的DNA序列。
[0005] 本发明的再一的目的是，提供上述分离的DNA序列的用途。
[0006] 本发明的另一的目的是，提供一种表达重组载体。
[0007] 本发明的第四个目的是，提供上述重组表达载体的用途。
[0008] 本发明的第五个目的是，提供一种基因工程化的宿主细胞。
[0009] 本发明的第六个目的是，提供上述基因工程化的宿主细胞的用途。
[0010] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
[0011] 一种分离的DNA序列，所述的DNA序列为：
[0012]a)SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所述的核苷酸序列；或
[0013]b)与a)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
[0014] 为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
[0015] 如上所述的DNA序列在编码油体钙蛋白、增强粮油作物中油体的稳定性或增加粮 油作物的油脂产量中的应用。
[0016] 为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
[0017] -种重组表达载体，所述的载体是由如上所述的核苷酸序列与质粒或病毒所构建 的重组表达载体。
[0018] 优选的，所述的质粒是PYES2质粒。
[0019] 为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：
[0020] 如上所述的重组表达载体在编码油体钙蛋白、增强粮油作物中油体的稳定性或增 加粮油作物的油脂产量中的应用。
[0021] 为实现上述第五个目的，本发明采取的技术方案是：
[0022] 一种基因工程化的宿主细胞，所述的宿主细胞选自于下列中的一种：
[0023]a)用如上所述的核苷酸序列转化或转导的宿主细胞及其后代细胞；
[0024]b)用如上所述的重组表达载体转化或转导的宿主细胞及其后代细胞。
[0025] 所述的宿主细胞是细菌细胞、真菌细胞，或这些宿主细胞的后代。
[0026] 优选的，所述的宿主细胞是酵母细胞。
[0027] 为实现上述第六个目的，本发明采取的技术方案是：
[0028] 如上所述的宿主细胞在编码油体钙蛋白、增强粮油作物中油体的稳定性或增加粮 油作物的油脂产量中的应用。
[0029] 本发明提供了缺刻缘绿藻油体钙蛋白（MiClo)基因序列并对其进行功能鉴定。该 基因是特异性锚定于油体表面的结构蛋白，在粮油作物中过表达能增强油体的稳定性，因 而能导致油体的过积累以增加油脂产量。
[0030] 本发明优点在于：
[0031] 1、本发明基于缺刻缘绿藻转录组高通量的测序数据，筛选出一条与已知油体钙蛋 白基因有很高相似性的一条长810bp的片段。基于该片段序列设计引物并利用cDNA末端 快速扩增（RACE)技术克隆到该基因的全长cDNA序列，通过同源比对确定该基因为油体钙 蛋白基因家族，将此命名为MiClo,并进一步获得了MiClo的DNA全长序列。
[0032] 2、本发明通过在真核模式生物酵母BY4741菌株中与增强型黄色荧光蛋白（eYFP) 融合表达该基因，即基因过表达实验，发现该基因编码蛋白确实定位在酵母细胞的油体上， 从而证实了MiClo基因所编码的蛋白能准确地锚定于油体上，具有维持油体结构完整性的 功能。
【附图说明】
[0033] 附图1是缺刻缘绿藻MiClo的基因结构示意图，图中灰色线是非翻译区，黑色线为 内含子，黑色框为外显子。
[0034] 附图2是酵母细胞的荧光图片，从上到下依次为酵母菌株BY4741，转携带eYFP载 体pY-eYFP的BY4741菌株，转携带目的基因的eYFP融合表达载体pY-MiClo-eYFP的BY4741 菌株。Bright为明场图，Yellow为eYFP发射的黄色荧光蛋白信号图，Red为NileRed染 色后发射的红色荧光信号图，Merged为前面三幅图的叠加图。
[0035] 附图3是pMD19T载体图谱。
[0036] 附图4是pYES2载体图谱。
【具体实施方式】
[0037] 下面结合附图对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0038] 本发明的技术路线是：
[0039] 1)在温度为25°C、光照强度为115ymolphotonsm^V1的条件下，于BG-11培养 基中培养缺刻缘绿藻。收集藻细胞，并提取基因组DNA和RNA。
[0040] 2)自缺刻缘绿藻转录组测序数据中筛选得到一条与已知油体钙蛋白基因有很高 相似性的长810bp的片段，基于该片段序列，利用RACE技术得到油体钙蛋白基因的cDNA序 列全长，我们将其命名为MiClo。然后，利用缺刻缘绿藻RNA反转录的cDNA为模版对MiClo 的cDNA全长序列进行该序列验证。
[0041] 3)根据MiClo全长的cDNA序列设计引物，利用缺刻缘绿藻DNA作为模版进行PCR 扩增，得到MiClo的DNA全长序列。
[0042] 4)根据MiClo的cDNA全长序列以及eYFP(enhancedyellowfluorescent protein，增强型黄色荧光蛋白）的序列设计引物，利用PCR构建pMD19T/MiClo和pMD19T/ eYFP质粒。
[0043]5)对pYES2载体和pMD19T/eYFP质粒进行双酶切（EcoRI/Xbal)，回收目的片段， 再用T4连接酶连接得到携带eYFP的重组表达载体pY-eYFP。
[0044] 6)接着对pY-eYFP载体和pMD19T/MiClo质粒进行双酶切（Hindlll/EcoRI)， 回收目的片段，再用T4连接酶连接得到携带目的基因与eYFP融合表达的重组载体 pY-MiClo-eYFP。
[0045] 7)分别将重组载体pY-eYFP和pY-MiClo-eYFP用电穿孔仪电击法转化酵母 BY4741，应用尿嘧啶缺陷的合成培养基（SC-U)筛选转化株，筛选得到转基因酵母pY-eYFP 和pY-MiClo-eYFP。
[0046] 8)将转目的基因、转空载体（S卩只携带eYFP的pYES2载体）和未转基因的酵母 BY4741接种于SC培养基，培养72h后收集酵母。
[0047] 9)利用油体特异性荧光染料尼罗红（NileRed)对酵母菌株及转基因酵母进行细 胞染色，利用激光共聚焦显微镜观察发现：在转PY-eYFP的酵母细胞内黄色荧光呈弥散状； 而在转目的基因MiClo与eYFP融合表达载体的酵母细胞中，黄色荧光与染油体的红色荧光 重合。该结果证明了MiClo所编码的蛋白定位于油体上，具有维持油体结构完整性的功能。 [0048] 实施例
[0049] 1、实验材料
[0050] 1)缺刻缘绿藻（MyrmeciaincisaReisiglH4301)购自捷克布拉格查理斯大学藻 类培养中心（CAUP)。在温度为25°C、光照强度为115ymolphotonsm-2 ?s-1，光/暗比为 12h/12h的条件下培养，培养基为BG-11，购自上海沪宇生物科技有限公司。
[0051] 2)pMD19T载体（载体图谱见图3)、pYES2载体（载体图谱见图4)购自Invitrogen 公司。酵母缺陷株BY4741(Matahis3Aleu2Ametl5Aura3A)购自德国EUROSCARF。将酵 母接种于SC培养基，在30°C下以200转/分钟（rpm)转速振荡培养。SC培养基购自上海 酶联生物科技有限公司。
[0052] 2、实验方法
[0053] 1)取100mg新鲜的缺刻缘绿藻细胞置于预冷的研钵中，加入液氮充分研磨。
[0054] 2)分别利用CTAB法（十六烷基三甲基溴化铵法）和TRIzol法提取藻细胞的基因 组DNA和总RNA，-20°C保存备用。
[0055] 3)在缺刻缘绿藻转录组高通量测序数据库中筛选到一条与Auxenochlorella protothecoides这种绿藻的油体妈蛋白编码序列有81 %相似性的长810bp片段 (Contig2882_5)，根据其序列设计引物，利用Clontech公司的SMART?RACEcDNA扩增试剂盒 进行PCR扩增。5' -RACE采用巣式PCR，第一轮的PCR反应条件为：94°C变性30s、68°C退 火 30s及 72°C延伸 2min，20 个循环，引物为GSP1 (AGCACAGTTCTGTTGGCACTGGGTTTG，SEQID NO. 3)和试剂盒中的UPM;第二轮PCR反应取1. 5yL第一轮PCR产物直接作为第二轮反应 模板，反应条件为94°〇变性308