、701：退火1111111和721：延伸2111111，共30个循环，引物为65 P2(TCTGGGTAITCCCGTGTCACTGTCTTG，SEQIDN0.4)和试剂盒中的NUPM。3'-RACE反应条件 同 5'-RACE第二轮PCR反应的条件，引物为GSP(CITTGTGCCTGAGAAGITTGAGGAGAT，SEQID NO. 5)和UPM。将PCR产物进行胶回收后连接至pMD19T载体，转化大肠杆菌DH5a感受态 细胞，蓝白斑筛选，挑取阳性克隆，菌落PCR验证，菌液送到上海生工生物工程有限公司测 序。将测序得到的5' -和3' -片段与已知的序列片段进行拼接，得到编码MiClo基因的全 长cDNA序列。
[0056] 4)根据RACE技术得到MiClo的cDNA全长序列设计引物：上游引物F1 : CGCCTACTCAAACCG(SEQIDN0.6);下游引物R1 :CCCTGCCTAGTCCAAA(SEQID勵.7)，进行卩0? 扩增。PCR反应程序为94°C预变性5min，35个循环包含94°C变性30s、57°C退火45s、72°C 延伸2min，最后72°C延伸10min。按照上述方法进行胶回收、TA克隆、菌落PCR验证后， 菌液送到上海生工生物工程有限公司测序，证实缺刻缘绿藻MiClo的cDNA全长序列（SEQ IDN0. 1) 〇
[0057]5)利用上述设计的MiClo全长cDNA序列验证引物（即F1和R1)，以缺刻缘绿藻 DNA为模版进行PCR扩增。扩增条件为94°C预变性5min，35个循环包含94°C变性45s、60°C 退火45s、72°C延伸2min，最后72°C延伸10min。PCR产物按上述方法经胶回收、TA克隆和 菌落PCR验证后，送上海生工生物工程公司测序，得到缺刻缘绿藻MiClo的DNA全长序列 (SEQ ID NO. 2)〇
[0058] 6)根据MiClo的cDNA全长序列设计带Hindlll和EcoRI酶切位点的引物：
[0059]上游引物YF1(SEQIDN0.8):aagcttATGTTGTGCAAGCTGCAAGG，其中小写字母为 HindllI酶切位点；
[0060]下游引物YR1(SEQIDNO. 9) :gaattcGCGCCTGCCCCCCTT，其中小写字母为EcoRI酶 切位点。
[0061] 根据eYFP序列设计带EcoRI和Xbal酶切位点的引物：
[0062]上游引物YF2(SEQIDNO.10):gaattcATGGTGAGCAAGGG，其中小写字母为EcoRI酶 切位点；
[0063]下游引物YR2(SEQIDNO. 11) :tctaga!TTACTTGTACAGCTCG，其中小写字母为Xbal 酶切位点。
[0064] 使用上述分别含有Hindlll/EcoRI和EcoRI/Xbal酶切位点的引物，利用PCR构建 pMD19T/MiClo和pMD19T/eYFP质粒。25yL的PCR扩增反应体系包含2. 5yL的ExTaq缓 冲液、2yL的dNTP、2yL的Mg2+、2yL的cDNA模版、1yL的引物、0? 25yL的ExTaq酶及 14. 5yL无菌水。扩增条件为94°C预变性5min，35个循环包含94°C变性45s、64°C(eYFP 退火温度为60°C)退火45s、72°C延伸2min，最后72°C延伸lOmin。PCR产物按上述方法经 胶回收、TA克隆，送上海生工生物工程公司测序以确保序列的准确性。
[0065] 7)从大肠杆菌DH5a中抽提pMD19T/MiClo和pMD19T/eYFP质粒。用限制性内切酶 EcoRI和Xbal对pMD19T/eYFP进行双酶切消化反应，同时对pYES2质粒也进行EcoRI/Xbal 双酶切消化反应。反应体系为4yL的10XM缓冲液，4yL的0. 1 %BSA，DNA约2yg，Xbal 及EcoRI各1yL，加无RNase水至20yL。37°C消化反应4h。割胶回收酶切后的目的片段， 并用T4DNA连接酶将酶切后的eYFP片段与pYES2片段连接得到重组载体pY-eYFP。连接反 应体系为2. 5yL的缓冲液，eYFP的DNA约0? 3pmol，载体pYES2的DNA约0? 03pmol，1yL 的1^嫩连接酶，加无RNase水至25yL。16°C连接过夜。连接后转化大肠杆菌DH5a感受 态细胞，按照上述方法进行克隆、菌落PCR验证和测序。从大肠杆菌DH5a中抽提pY-eYFP 质粒，-20°C保存备用。然后用限制性内切酶Hindlll和EcoRI对pMD19T/MiClo和pY-eYFP 质粒分别进行双酶切消化反应，采用与上述相同的方法得到重组载体pY-MiClo-eYFP。
[0066] 8)酵母感受态细胞制备。将酵母接种于SC培养基中，30°C复苏培养过夜，然后按 1:100放大培养，以200rpm转速振荡培养至细胞密度约为1X108cells/mL(约4?5h)。冰 上冷却15min使细胞停止生长，4°C条件下以5000rpm转速离心5min收集酵母细胞，预冷无 菌水洗涤细胞3次，同样条件下离心收集。20mL预冷的1M山梨醇洗涤细胞1次，然后溶于 0. 5mL预冷的1M山梨醇，调整细胞的浓度在lXKTcells/mL。冰上保存细胞，便于电击使 用。
[0067] 9)利用电穿孔仪（Bio-Rad)电击，将重组载体pY-MiClo-eYFP转化酵母BY4741 感受态细胞。取在冰上预冷的待转化重组载体pY-MiClo-eYFP的DNA约5?10yL(5? 200ng)与酵母感受态细胞混匀，并与0. 2cm的电击杯一起冰上预冷，然后将DNA与细胞混合 液转移到预冷的电击杯轻轻混匀，冰浴5min后，选择程序Sc2电击一次，移走电击杯，立刻 加入lmL预冷的1M山梨醇，轻轻转移到新的YH)培养基中，30°C轻微振荡5h，将菌液涂布 于含有1M山梨醇的尿嘧啶缺陷合成培养基（SC-U)上，30°C倒置静置培养48-72h，挑取菌 落于液体SC-U培养基中培养。菌落PCR验证后，用含2%葡萄糖的SC-U培养基保存菌种。 另外，按上述同样方法将空载pY-eYFP电转到BY4741上。
[0068] 10)将活酵母用油体特异焚光染料NileRed(GenmedScientificsInc.USA)染 色，用激光共聚焦显微镜（CarlZeissLSM710,德国）观察，拍照。其中NileRed荧光染料 所用激发波长为543nm，黄色荧光蛋白所用激发波长为514nm。
[0069] 3、实验结果
[0070] 1)根据RACE技术获得并经过PCR扩增验证，得到缺刻缘绿藻MiClo的cDNA全长 序列（SEQIDNO. 1);其5' -非翻译区（UTR)长142bp，3' -非转录区长711bp，开读框架 长840bp，第143-145bp是起始密码子，第980-982bp是终止密码子，编码一个由279个氨 基酸组成的蛋白。利用缺刻缘绿藻基因组DNA为模版进行PCR扩增反应，产物经序列分析 后得到MiClo的DNA全长序列（SEQIDNO. 2);它总长2099bp，存在4个内含子，这些内含 子的长度从5' -端到3' -端依次分别为140bp(第345bp到第484bp处）、93bp(第614bp到第 706bp处）、94bp(第 891bp到第 984bp处）和 102bp(第 1068bp到第 1169bp处），从 而将该基因的编码序列分隔成5个外显子（图1);其中，第143-145bp是起始密码子，第 1408-1410bp是终止密码子。
[0071] 2)酵母以及转基因酵母在半乳糖诱导培养后，利用油体特异荧光染料NileRed对 其细胞进行染色，通过激光共聚焦显微镜在不同的激发波长下观察。在转空载pY-eYFP的 酵母细胞内，发现黄色荧光弥漫除核以外的整个细胞空间；在转目的基因MiClo与eYFP融 合表达的酵母中，黄色荧光主要集中在由NileRed特异性地发射红色荧光的区域（图2)。 说明融合表达的MiClo能将eYFP从细胞内的其他部位集中至油体上，从而证明了MiClo基 因所编码的蛋白能准确地锚定于油体上，具有维持油体结构完整性的功能。
[0072] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为 本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种分离的DNA序列，其特征在于，所述的DNA序列为： a) SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2所述的核苷酸序列；或 b) 与a)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
2. 权利要求1所述的DNA序列在编码油体钙蛋白、增强粮油作物中油体的稳定性或增 加粮油作物的油脂产量中的应用。
3. -种重组表达载体，其特征在于，所述的载体是由权利要求1所述的核苷酸序列与 质粒或病毒所构建的重组表达载体。
4. 根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述的质粒是pYES2质粒。
5. 权利要求3或4所述的重组表达载体在编码油体钙蛋白、增强粮油作物中油体的稳 定性或增加粮油作物的油脂产量中的应用。
6. -种基因工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞选自于下列中的一种： a) 用权利要求1所述的核苷酸序列转化或转导的宿主细胞及其后代细胞； b) 用权利要求3或4所述的重组表达载体转化或转导的宿主细胞及其后代细胞。
7. 根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞是细菌细胞、真菌细 胞，或这些宿主细胞的后代。
8. 根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞是酵母细胞。
9. 权利要求6所述的宿主细胞在编码油体钙蛋白、增强粮油作物中油体的稳定性或增 加粮油作物的油脂产量中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种编码缺刻缘绿藻油体钙蛋白的DNA序列，所述DNA序列包括：a)SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列；或b)与a)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。本发明还提供了含有上述核苷酸序列的重组表达载体和基因工程化的宿主细胞及其用途。本发明的优点在于：筛选获得了缺刻缘绿藻油体钙蛋白基因的cDNA全长序列和DNA全长序列，通过将该基因在真核模式生物酵母BY4741菌株中与增强型黄色荧光蛋白(eYFP)融合表达该基因，发现该基因编码蛋白确实定位在酵母细胞的油体上，从而证实了MiClo基因所编码的蛋白能准确地锚定于油体上，具有维持油体结构完整性的功能。
【IPC分类】C12N15-81, C12N15-11, C12N1-19
【公开号】CN104593362
【申请号】CN201510007643
【发明人】孙诤, 李婷, 周志刚
【申请人】上海海洋大学
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年1月8日