促进水产动物肠道健康的复合微生物菌剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种促进水产动物肠道健康的复合微生物 菌剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 近几年来食品安全备受关注，水产品的健康养殖势在必行，目前在水产养殖过程 中，多数使用光合细菌、枯草芽孢杆菌、乳酸菌等微生物制剂改善养殖环境，降低疾病的发 生，取得了较好的效果，然而水产养殖动物的疾病发生还与水产动物机体本身有关，因此这 几年来针对水产动物肠道健康的研究较多，其中也有一部分利用微生物促进水产动物的肠 道健康。如罗源、江海英等申请的中国专利（专利号=201210029204.9)公开了一种短小芽 孢杆菌、益生菌制剂及其制备方法和应用。发明的有益效果是：利用短小芽孢杆菌具有强的 胞外蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性，对弧菌具有广泛的抑制性，起到抑制对虾肠道病原弧菌 生长、减少对虾弧菌病的发生，同时促进对虾生长、降低饵料系数；但其缺陷在于：对病原 菌的抑制性较为单一，只提及对弧菌类病原菌有广泛的抑制作用。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题在于提供一种促进水产动物肠道健康的复合微生物 菌剂，并同时揭露了该复合微生物菌剂的制备方法。
[0004] 本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的： 一种促进水产动物肠道健康的复合微生物菌剂，其由以下质量百分数的组分组成： 经培养、浓缩及固化后的菌株FA08 5-25% ； 经扩培、浓缩与固定后的菌株DS31 10-25% ； 余量为载体； 其中：载体为硅藻土或沸石粉或麦饭石粉，且硅藻土、沸石粉、麦饭石粉的粉碎细度均 为120-250目； 所述菌株FA08为地衣芽抱杆菌菌株FA08 于2014年08 月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北 辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo:9544 ; 所述菌株DS31为干酿乳杆菌菌株DS31 casei)，于2014年11月28 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo:10073。
[0005] 同时揭露了上述促进水产动物肠道健康的复合微生物菌剂的制备方法，其具体步 骤为： (1)地衣芽孢杆菌菌株FA08的培养：取所述的地衣芽孢杆菌菌株FA08 )并将其接种至LB培养基中，且于28-40°C、150-200rpm下活化培养5-10h;活化好即得种子液，接着按1-10%接种量将种子液接种至LB培养基，并于28-40°C、 150-200rpm条件下培养 12-24h; (2) 地衣芽孢杆菌菌株FA08的浓缩与固化：将经步骤（1)培养所得的菌液置于 8000-10000rpm离心5-10min，弃上清得湿菌液；于所得湿菌液中添加粉碎细度为120-250 目的硅藻土或麦饭石粉或沸石粉50g/L-2000g/L，之后30-40°C条件下进行干燥，得固化 后的地衣芽孢杆菌菌株FA08,备用； (3) 干酪乳杆菌菌株DS31的扩培：取所述的干酪乳杆菌菌株DS31 (Lacte知ciBm 并将其接种至MRS培养基中，且于30-45°C、摇床150-200rpm下活化培养5-10h; 活化好即得种子液，接着按1-10%接种量将种子液接种至MRS培养基，并于30-45°C、摇床 150-200rpm条件下培养 12-24h; (4) 菌株吸附：于步骤（3)扩培后的菌液中添加粉碎细度120-250目的硅藻土或麦饭石 粉或沸石粉50g/L-2000g/L，并于100-150rpm下吸附l-5h; (5) 浓缩与固定：步骤（4)吸附后的菌液于8000-10000印111下离心5-10111；[11，弃上清得湿 菌液，并加入0. 1-1. 0ml/L的保护剂，30-40°C搅拌干燥，得固定后的干酪乳杆菌菌株DS31， 备用； (6) 复配：先按照下列质量百分数称取组分：5-25%步骤（2)所得的固化后的地衣芽 孢杆菌菌株FA08、10-25%步骤（5)所得的固定后的干酪乳杆菌菌株DS31、余量为粉碎细度 120-250目的硅藻土或沸石粉或麦饭石；接着将称取好的各组分混合并搅拌均匀，之后进 行分装包装即得所述的复合微生物菌剂。
[0006] 进一步地，所述LB培养基的组分均为：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g，H20 1000 mL。
[0007] 进一步地，所述保护剂为甘油、海藻酸钠、糊精中的任一种。
[0008] 进一步地，所述MRS培养基的组分均为：蛋白胨10. 0g、牛肉膏10. 0g、酵母膏 5.0g、柠檬酸三铵 2.0g、葡萄糖 20.0g、Tween-80 1.0mL、NaAc5.0g、K2HP04 2.0g、 MgS04 ? 7H20 0? 58g、MnS04 ?H20 0? 25g、H20 1000mL、pH6. 2-6. 6。
[0009] 本发明的有益效果在于：通过利用地衣芽孢杆菌菌株FA08 与干酪乳杆菌菌株DS31 casei)所制得的复合微生物菌 齐U，其对水产常见的病原菌溶藻弧菌、嗜水气单胞菌都有抑制作用；且该复合微生物菌剂利 用二者的协同作用，能够降低水产养殖动物的饵料系数，更为有效的促进水产动物肠道的 健康与对饲料的利用率，从而能提高水产动物成活率。
【具体实施方式】
[0010] 本发明中涉及两菌株即地衣芽孢杆菌菌株FA08及干酪乳杆菌菌株DS31，其中，地 衣芽孢杆菌菌株FA08是从采自福建省宁德市养殖池底泥样品中分离并筛选得到能够改善 水产养殖动物肠道的菌株，通过对该菌株进行生理生化特性测定和16srDNA鉴定，最终确 认其为地衣芽孢杆菌JicAefli/bu's)的一个菌株；干酪乳杆菌菌株DS31是从 米自福建省宁德市网箱养殖的健康大黄鱼的鱼肠中分离并筛选得到对水产养殖动物肠道 的改良具有促进作用的功能菌株，通过对该菌株进行生理生化特性测定和16srDNA鉴定， 最终确认其为干酪乳杆菌casei)的一个菌株。
[0011] 一、第一个菌株的分离与鉴定： 1、初筛： 称取l〇g采自福建省宁德市养殖池底泥样品，加入lOOmL0.85%NaCl中，搅拌后取上 层浊液置于LB培养基，之后于37°C、180rpm条件下富集培养30h，富集培养所得菌液置于 75°C水浴20min，水浴后的菌液进行梯度稀释及LB平板涂布法分离操作，然后挑取LB平板 上长起的形态不一的菌落，保存备用。
[0012] 2、复筛： 取初筛得到的各菌落并分别置于LB试管中，于37°C、180rpm下活化6h;活化好的菌液 按10%接种量接种至CMC-Na产酶培养基中，37°C，180rpm发酵48h;所得发酵液经lOOOOrpm 离心6min，得各菌落的上清液，备用； 配制CMC-Na平板，打孔后，分别在各孔内添加50uL所得的上清液，之后置于37°C过夜 反应；反应后的平板用刚果红染色lh，接着用0. 85%NaCl脱色，观察比较各孔中上清液水 解圈的大小，进而筛选出产酶能力较强的菌株，将该菌株标记为菌株FA08。
[0013] 其中，CMC-Na产酶培养基的组分为：蛋白胨10. 0g，酵母膏9. 0g，CMC-Na5. 0g， pH8. 0 ;CMC-Na平板的组分为：CMC-Na15. 0g、硫酸铵1. 0g、酵母膏1. 0g、硫酸镁1. 0g、磷 酸二氢钾l.〇g、H20 1000mL、Agar20.0g。
[0014] 3、鉴定： 将筛选所得菌株FA08接种至LB固体培养基中，37°C下培养，并观察菌落形态，并做部 分生理生化特性的测定，结果如下：菌落白色微黄，中间凸起，表面光滑，边缘不规则，革兰 氏阳性，产芽孢，葡萄糖发酵阳性，水解淀粉阳性。同时对该菌株进行16SrDNA鉴定，得其 16srDNA序列如SEQIDN0 :1 所示。
[0015] 将测得的16srDNA序列输入NCBI进行同源性搜索，发现其相似度最高的为地衣 芽孢杆菌则结合生理生化鉴定结果及16srDNA序列数据库比 对结果，确定该菌株FA08为地衣芽孢杆菌（ifeciBys/icAefli/bu's)的一个菌株。
[0016] 二、第二个菌株的分离与鉴定： 1、 初筛： 将新鲜大黄鱼于冰盘上进行解剖，刮取鱼肠内壁粘膜置于〇. 85%NaCl中，搅拌均匀后 经梯度稀释并涂布于BCP培养基，于37°C生化培养箱中培养24-48h直至菌落长出，挑取周 围变黄的菌落，保存到MRS斜面备用。
[0017]本发明中，BCP培养基的组分：酵母膏25g、蛋白胨5. 0g、葡萄糖5. 0g、溴甲酚紫 0. 004g、琼脂15g、水1000ml，pH7. 0;MRS培养基的组分为：蛋白胨10. 0g、牛肉膏10. 0g、 酵母膏 5.0g、柠檬酸三铵 2.0g、葡萄糖 20.0g、Tween-80 1.0mL、NaAc5.0g、K2HP04 2.0 g、MgS04 ? 7H20 0? 58g、MnS04 ?H20 0? 25g、H20 1000mL、琼脂 15g，pH6. 2-6. 6 ; 2、 复筛： 挑取初筛保存的菌落并接种至MRS试管中活化6h，活化好的菌液按5%接种量接种至MRS培养基中，于37°C、180rpm、摇床培养24h，摇床培养期间每隔2h取样测pH，进而筛选出 产酸能力最强的菌株，将该菌株标记为菌株DS31。
[0018] 3、鉴定： 将筛选所得菌株DS31接种至MRS固体培养基中，37°C下培养，观察菌落形态，并做部分 生理生化特性的测定，结果如下：菌落乳白色，表面光滑，边缘整齐，不透明，革兰氏阳性，无 芽孢，葡萄糖发酵阳性，乳糖发酵阳性。同时对该菌株进行16SrDNA鉴定，得其16srDNA序列如SEQIDNO:2所示。
[0019] 将测得的16srDNA序列输入NCBI进行同源性搜索，发现其相似度最高的为干酪 乳杆菌;则结合生理生化鉴定结果及16srDNA序列数据库比对结 果，确定该菌株DS31为干酪乳杆菌casei)的一个菌株。
[0020] 三、复合微生物菌剂及其制备方法 一种促进水产动物肠道健康的复合微生物菌剂，其由以下质量百分数的组分组成： 经培养、浓缩及固化后的菌株FA08 5-25% ； 经扩培、浓缩与固定后的菌株DS31 10-25% ； 余量为载体； 其中：载体为硅藻土或沸石粉或麦饭石粉，且硅藻土、沸石粉、麦饭石粉的粉碎细度均 为 120-250 目。
[0021] 且该复合微生物菌剂的制备方法的具体操作步骤如下： (1) 地衣芽孢杆菌菌株FA08的培养：取所述的地衣芽孢杆菌菌株FA08 )并将其接种至LB培养基中，且于28-40°C、150-200rpm下活化培养 5-10h;活化好即得种子液，接着按1-10%接种量将种子液接种至LB培养基，并于28-40°C、 150-200rpm条件下培养 12-24h; (2) 地衣芽孢杆菌菌株FA08的浓缩与固化：将经步骤（1)培养所得的菌液置于 8000-10000rpm离心5-10min，弃上清得湿菌液；于所得湿菌液中添加粉碎细度为120-250 目的硅藻土或麦饭石粉或沸石粉50g/L-2000g/L，之后30-40°C条件下进行干燥，得固化 后的地衣芽孢杆菌菌株FA08,备用； (3) 干酪乳杆菌菌株DS31的扩培：取所述的干酪乳杆菌菌株DS31 (Lacte知ciBm 并将其接种至MRS培养基中，且于30-45°C、摇床150-200rpm下活化培养5-10h; 活化好即得种子液，接着按1-10%接种量将种子液接种至MRS培养基，并于30-45°C、摇床 150-200rpm条件下培养 12-24h; (4) 菌株吸附：于步骤（3)扩培后的菌液中添加粉碎细度120-250目的硅藻土或麦饭石 粉或沸石粉50g/L-2000g/L，并于100-150rpm下吸附l-5h; (5) 浓