一种芳烃降解酶制剂及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及环境微生物技术领域，特别是涉及一种芳烃降解酶制剂及其制备方法 和应用。
【背景技术】
[0002] 芳烃类物质作为一种分子中含有苯环结构的碳氢化合物，土壤环境中因富含有机 质，芳烃的亲脂性使其常被吸附在土壤颗粒表面，减弱了其可降解性；低分子量的芳烃类物 质易挥发，具有一定的水溶性，亲脂性差，是水体污染的主要部分之一。关于土壤及水体中 芳烃类有机污染物修复方法研宄已广泛开展，包括化学修复、生物修复及化学-生物联合 修复等多种方式。生物修复中以微生物强化修复措施的研宄和应用最为广泛。然而，依靠 微生物代谢有机污染物的方式进行有机污染治理存在周期较长，微生物群落易变等劣势， 微生物群落的演替使该方法很难保证稳定的芳烃降解能力；再有，外源微生物物种的添加 存在潜在的生态风险，即改变固有微生物群体结构，破坏原有生境状态。
[0003] 生物酶剂修复技术是人为提取具有降解功能的微生物细胞内的降解酶类，依赖于 酶对有机污染底物的直接催化加氧等作用达到高效快速降解污染物的目的，避免了有机物 分子转移进入微生物细胞内进行代谢的耗时过程，有效解决了功能微生物群落难以稳定持 续存在的问题，同时回避了外源微生物群落入侵等造成的二次污染问题。酶制剂应用的理 论基础源于人们对微生物代谢石油污染物的代谢通路的认知。芳烃作为石油组成成分的一 种，主要以加氧氧化的方式开始被降解的过程。其中，真菌和细菌分别以单加氧和双加氧的 方式将空气中的氧添加到芳烃的环状结构内，形成单、双羟基化的中间分子，再通过C-0键 的断裂步骤开启开环降解的过程，并结合脱氢、加氢、水解、水合、脱羧、乙酰化等步骤逐级 代谢，最终将芳烃大分子完全矿化为〇) 2和H20。在矿化的整个酶促反应过程中，第一步的 芳烃开环反应被认为是限速步骤，而原核生物体的开环催化反应多由多组件形成的酶体复 合物及辅酶的共同参与完成，各组成成员接力完成递H和加氧的过程。由此，在多环芳烃生 物代谢的全过程中，需要单、双加氧酶（包括NADH辅酶、铁硫氧化还原蛋白、铁硫氧化还原 蛋白还原酶、加氧活性中心）、脱氢酶、水解酶、水合酶、乙酰化酶等多种酶体或酶系的共同 参与。鉴于此，在有机污染治理的工程应用中以原核生物细胞内的混合发酵酶液作为研宄 对象，可以涵盖多种芳烃代谢通路中的关键酶类，达到广泛深度代谢的效果。
[0004] 酶作为生物蛋白类的活性物质，离体条件下易受极端环境影响而失去功能。生物 固定化技术通过载体材料对降解酶的固定化作用，有效增强生物酶对离体环境的冲击，提 高对极端PH、极端温度等条件的耐受能力。同时，降解酶经固定化所形成的酶剂提高了污染 环境中降解酶类的分布密度，疏松多孔的载体结构又具有较高的吸附有机物分子的能力， 从而有效提高酶剂活性位点与污染底物的接触几率，在延长生物蛋白酶寿命的同时提高对 底物的降解效率。目前，酶固定化的方法包括吸附法（物理吸附和离子吸附）、包埋法（脂 质体包埋、微囊型包埋和网格型包埋）、交联法和共价键结合法等。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种芳烃降解酶制剂及其制备方法和应用。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
[0007] -种芳烃降解酶制剂，酶制剂为具有芳烃降解功能的土著微生物经发酵培养后超 声破碎提取胞内混合物，再经固定化处理制成酶剂；其中，具有芳烃降解功能的土著微生 物为荧光假单胞菌，已于2011年7月22日，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号： CCTCCN0:M2011260〇
[0008] 一种芳烃降解酶制剂的制备方法，将具有芳烃降解功能的土著微生物进行诱导发 酵培养，发酵物进行超声处理破碎细胞，而后离心收集上清液得芳烃降解粗酶液，粗酶液经 固定化处理即为芳烃降解酶制剂。
[0009] 所述诱导发酵培养是将具有芳烃降解功能的土著微生物在牛肉膏蛋白胨液体培 养基中于28-30°C、160-180rpm/min的条件下进行小量振荡培养，培养至对数生长期，离 心、清洗并收集菌体，用与菌体等体积的磷酸盐缓冲液（PBS0.2MpH7. 5)重悬后按1-5% (v/v)的接种量将菌液接种至芳烃降解菌无机盐发酵培养基中，于32-35°C培养至OD_值 为2-5,以7500-8500rpm/min离心收集菌体；上述收集的菌体采用磷酸盐缓冲液（PBS0. 2M pH7. 5)清洗，再以7500-8500rpm/min离心收集菌体，而后加入Tris-EDTA缓冲液重悬菌 体，当菌悬液〇D6(J直为1时进行超声破碎30-35min，超声在冰浴条件下进行，超声功率为 180-250W，超声破碎后离心收集上清液即得芳烃降解菌粗酶液，粗酶液经固定化处理即为 芳烃降解酶制剂。
[0010] 所述固定化处理是将粗酶液与固定化载体活性炭以质量比为1:200-1:250的比 例进行混合，4-6°C条件下固定8-10h，即得芳烃降解酶制剂。
[0011] 所述芳径降解菌无机盐发酵培养基成分为：0. 5g/LNaCl，0. 2g/LMgS04,1. 0g/ L(NH4)2S04,2.75g/LK2HP04,2.25g/LKH2P04,0 . 02g/LCaCl2,0.02g/LFeS04，lml微量元素， pH7. 0,lg/L葡萄糖、50ppm菲、50ppm花和 50ppm苯并花。
[0012] 所述，微量元素为MnS04 ?H20, 35. 5mg/L，ZnS04 ?H20,42. 8mg/L，（NH4) 6M〇7024 ? 4H20， 32. 5mg/L〇
[0013] 所述Tris-EDTA缓冲液，其成分为：50mMpH7.9Tris、0.5mMEDTA、50mMNaCl、 5%甘油、1%TritonX-100〇
[0014] -种芳烃降解酶制剂的应用，所述酶制剂作为污染环境中的芳烃降解酶制剂，用 于治理污染环境。
[0015] 所述酶制剂用于降解污染水体或土壤中的芳烃，进而达到修复的目的。
[0016] 所述酶制剂与还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH)按质量比为1:4-1:5的比例 混合后，施用于污染水体或土壤中进行降解芳烃，进而达到修复的目的。
[0017] 本发明所具有的优点：
[0018] 本发明酶制剂以长期受石油污染驯化的土著细菌微生物为主要原料经发酵获得， 来源经济、可靠，克服了传统微生物修复速率较慢、稳定性差的缺陷；在使用过程中添加辅 助因子，提高了菌体代谢效率，能够安全修复芳烃污染水体和土壤，且无二次污染，为有机 污染物的环境污染治理提供一种新的生物修复途径和思路。
【附图说明】
[0019] 图1为本发明实施例提供的添加NADH辅助芳烃降解酶剂对水中芳烃降解效果图， 其中，箭头所指处为不同处理下降解速率减慢的拐点时刻。
[0020] 图2为本发明实施例提供的添加NADH辅助芳烃降解酶剂对土壤芳烃降解效果图， 其中，箭头所指处为不同处理下降解速率减慢的拐点时刻。
[0021] 图3为本发明实施例提供的电动-酶组合处理菲和芘共同污染土壤效果图。
【具体实施方式】
[0022] 以下的实施例进一步详述本发明的相关内容，便于对本发明进行更好地理解，但 不限定本方法。下述实施例中的试验方法均为生物培养及有机物质提取所用的常规方法。
[0023] 微生物培养所用培养基为牛肉膏/蛋白胨培养基、无机盐培养基，所用缓冲液包