具有延长的体内半寿期的因子ix类似物的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请是国际申请日为2007年5月24日、国际申请号为PCT/EP2007/055031、进 入国家阶段的申请号为200780019090. 7、发明名称为"具有延长的体内半寿期的因子IX类 似物"的PCT申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及凝血因子IX(FIX)类似物及衍生物，与天然的因子IX相比，它们在血 流中的循环时间延长。
【背景技术】
[0003] 因子IXa(FIXa)是胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，在止血过程中发挥重要作用，它是 凝血因子X酶复合物的组成部分，产生大部分的因子Xa，因子Xa在凝血过程中参与凝血酶 的形成（见综述（Hoffman和Monroe，III2001))。先天性因子IXa缺乏导致X-连锁出血 性疾病-血友病B，男性发病率约为1 : 100, 000。目前，血友病B的治疗主要是使用重组 或血浆凝血因子IX的替代疗法。然而，目前的观点正由传统的按需治疗转变为预防性治 疗。当前的预防性治疗需要每周多次给药，但要达到最佳的血浆浓度和药效，最好每天注射 一次。但考虑到每天给药的实用性和经济限制，目前尚不能用于患者的治疗。因而，显然需 要一种长效的重组因子IX药物。
[0004]W0 2006005058涉及因子IX的一部分与一种或多种分子量为5-150kDa的水溶 性聚合物的结合体。W0 2006018204涉及修饰的维生素K依赖性多肽，包括修饰的激活 肽。W0 2004101740涉及嵌合蛋白，至少包括一种凝血因子和部分免疫球蛋白恒定区。TO 2005001025涉及嵌合单体-二聚体杂交蛋白，其中该蛋白的第一条多肽链包括部分免疫球 蛋白恒定区和生物活性分子，第二条多肽链包括不含生物活性分子的部分免疫球蛋白恒定 区。US2006040856涉及因子IX和聚乙二醇的结合，聚乙二醇通过完整的糖基连接起来并 连接到多肽和修饰基上。
[0005]SE9501285A公开了使用一种混合物在体外合成具有适当折叠和二硫化物交联 的生物活性蛋白的方法，该混合物包括蛋白二硫化物氧化还原酶（如蛋白二硫化物异构酶 (roi))，谷氧还蛋白和氧化还原体系。参考文献主要是关于参与分子内二硫键形成的半胱 氨酸残基。
[0006]W0 2006/134173涉及至少包含一个非天然半胱氨酸残基的重组工程化蛋白的选 择性还原和衍生方法，重组蛋白包括因子IX多肽在内。
[0007] 本发明的目的是提供修饰的FIX类似物或衍生物，与天然FIX相比，它们在血流中 的循环时间延长，但仍能维持足够的生物活性参与凝血。
【发明内容】
[0008] -方面，本发明涉及循环半寿期延长的FIX类似物，其中在下列位点的天然氨基 酸残基中至少有一个被结合（conjugate)化学基团的半胱氨酸残基残基取代，所述化学基 团使得FIX多肽的分子量增加，所述位点为第44、46、47、50、53、57、66、67、68、70、72、74、 80、84、87、89、90、91、94、100、101、102、103、104、105、106、108、113、116、119、120、121、123、 125、129、138、140、141、142、146-180、185、186、188、189、201、202、203、224、225、228、239、 240、241、243、247、249、252、257、260、261、262、263、265、277、280、314、316、318、321、341、 372、374、391、392、406、410、413 或 415 位。
[0009] 在优选实施方案中，FIX类似物在下列位点的天然氨基酸残基中至少有一个被结 合化学基团的半胱氨酸残基取代，所述化学基团使得FIX多肽的分子量增加，所述位点为 第 44、46、47、50、53、57、66、67、68、70、72、74、80 或 84 位。
[0010] 在另一优选实施方案中，FIX类似物在下列位点的天然氨基酸残基中至少有一个 被结合化学基团的半胱氨酸残基取代，所述化学基团使得FIX多肽的分子量增加，所述位 点为第 87、89、90、91、94、100、101、102、103、104、105、106、108、113、116、119、120、121、123、 125、129、138、140、141 或 142 位。
[0011] 在另一优选实施方案中，FIX类似物在下列位点的天然氨基酸残基中至少有一 个被结合化学基团的半胱氨酸残基取代，所述化学基团使得FIX多肽的分子量增加，所述 位点为第 185、186、188、189、201、202、203、224、225、228、239、240、241、243、247、249、252、 257、260、261、262、263、265、277、280、314、316、318、321、341、372、374、391、392、406、410、 413 或 415 位。
[0012] 在另一优选实施方案中，FIX类似物在位点146-180的天然氨基酸残基中至少有 一个被结合化学基团的半胱氨酸残基取代，所述化学基团使得FIX多肽的分子量增加。
[0013] 可以理解，由于位点146-180相当于FIX的活性肽，该活性肽在FIX激活时被释放 (remove)，那么，对于这样一种FIX类似物，其中在选自位点146-180的天然氨基酸残基中 至少有一个被半胱氨酸残基取代，所述半胱氨酸残基结合了使FIX多肽的分子量增加的化 学基团，在类似物激活后，所述化学基团将不存在于类似物中。
[0014] 在另一优选实施方案中，FIX类似物在下列位点的天然氨基酸残基中至少有一个 被结合化学基团的半胱氨酸残基取代，所述化学基团使得FIX多肽的分子量增加，所述位 点选自第 155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、167、168、169、170、171、172、173、 174、175、176、177 位。
[0015] 在另一优选实施方案中，FIX类似物在下列位点的天然氨基酸残基中至少有一个 被结合化学基团的半胱氨酸残基取代，所述化学基团使得FIX多肽的分子量增加，所述位 点选自第 160、161、162、163、164、165 和 166 位。
[0016] 在另一优选实施方案中，FIX类似物的氨基酸残基E162被结合化学基团的半胱氨 酸残基取代，所述化学基团使得FIX多肽的分子量增加。
[0017] 另一方面，本发明涉及循环半寿期延长的FIX类似物，其C-末端T415后至少附加 一个半胱氨酸残基，该半胱氨酸残基与化学基团结合，所述化学基团使得FIX多肽的分子 量增加。
[0018] 在本发明优选实施方案中，与非天然半胱氨酸残基结合的化学基团是聚乙二 醇（PEG)。在进一步的优选实验方案中，聚乙二醇的平均分子量是500-100, 000,例如 1000-75, 000 或 2, 000-60, 000。
[0019] 优选的FIX类似物，其循环半寿期至少是野生型FIX半寿期的1. 5倍。
[0020] 在进行凝血实验时，本发明优选的FIX类似物，其生物活性至少是野生型FIX的 20%。
[0021] 另一方面，本发明涉及FIX类似物的制备方法，包括以下步骤：a)选择性还原工程 化（engineered)FIX多肽，该多肽在下列位点至少包含一个非天然半胱氨酸，所述位点选 自第 44、46、47、50、53、57、66、67、68、70、72、74、80、84、87、89、90、91、94、100、101、102、103、 104、105、106、108、113、116、119、120、121、123、125、129、138、140、141、142、146-180、185、 186、188、189、201、202、203、224、225、228、239、240、241、243、247、249、252、257、260、261、 262、263、265、277、280、314、316、318、321、341、372、374、391、392、406、410、413 或 415 位， 所述非天然半胱氨酸残基通过二硫键与低分子量的硫醇（thiol) (RS-CYS)结合，方法是使 结合低分子量硫醇的FIX和含有氧化还原缓冲体系的混合物反应；b)同时或其后，将至少 一个选择性还原的半胱氨酸（HS-Cys)部分与化学基团结合。
[0022] 在优选实施方案中，制备方法包含氧化还原缓冲体系（redoxbuffer)，氧化还原 缓冲体系包括含有还原型和氧化型谷胱甘肽的混合物。在进一步的优选实施方案中，氧化 还原缓冲体系还包括谷氧还蛋白。
[0023] 另一方面，本发明涉及FIX类似物的制备方法，包括以下步骤：a)选择性还原工程 化FIX多肽，该多肽在下列位点至少包含一个非天然半胱氨酸，所述位点选自第44、46、47、 50、53、57、66、67、68、70、72、74、80、84、87、89、90、91、94、100、101、102、103、104、105、106、 108、113、116、119、120、121、123、125、129、138、140、141、142、146-180、185、186、