188、189、 201、202、203、224、225、228、239、240、241、243、247、249、252、257、260、261、262、263、265、 277、280、314、316、318、321、341、372、374、391、392、406、410、413 或 415 位，所述非天然半 胱氨酸残基通过二硫键与低分子量的硫醇（RS-CYS)结合，方法是使结合低分子量硫醇的 FIX和含有三芳基膦-3, 3'，3"-三磺酸化合物的混合物反应；b)同时或其后，将至少一个 选择性还原的半胱氨酸（HS-Cys)部分与化学基团结合。
[0024] 在本发明的方法的优选实施方案中，化学基团选自聚乙二醇（PEG)，尤其是平均分 子量为 500-100, 000 的PEG，例如 1000-75, 000 或 2, 000-60, 000。
[0025] 本发明的另一个方面涉及治疗血友病患者的药物制剂，其中包含有效治疗剂量的 本发明的FIX类似物的和药学上可接受的载体。
[0026] 本发明的另一个方面涉及血友病患者的治疗方法，其中包括给予患者有效治疗剂 量的本发明的FIX类似物及药学上可接受的载体。
[0027] 在优选实施方案中，治疗方法包括每周至少一次治疗。在另一优选实施方案中，治 疗方法包括每周只进行一次的治疗。
【具体实施方式】
[0028]FIX是维生素K依赖性凝血因子，结构类似于因子VII、凝血素、因子X和蛋白C。 其循环酶原的血浆半寿期约为18-30小时，由415个氨基酸组成，分为四个明显的结构域， 包括N-末端富含羧基谷氨酸（Gla)结构域，两个EGF结构域和C-末端胰蛋白酶样丝 氨酸蛋白酶结构域。FIX的激活是通过Arg145-Ala146和Arg18°-Val181位氨基酸的限制性酶 切，释放含有35个氨基酸残基的片段，所谓的激活肽（Schmidt和Bajaj2003)。激活肽高 度糖基化，包括两个N-连接多糖和高达四个的0-连接多糖。
[0029] 共价修饰，例如聚乙二醇化或脂连接（lipidattachment)，已经成功地用于几个 蛋白质为基础的制药学中，改进药物的药代动力学和药效学。通过天然或工程化半胱氨酸 残基进行的结合，提供了位点特异性的修饰方法，主要是由于蛋白表面缺乏这种半胱氨酸 残基和硫醇进行的化学反应具有高度选择性。然而，实际上，这种方法通常是复杂的，原因 是加入的半胱氨酸残基与低分子量（LMW)硫醇组成的混合二硫化物如半胱氨酸和谷胱甘 肽会抑制随后的修饰反应。
[0030] 因此，就需要一种方法，其中半胱氨酸残基和低分子量硫醇组成的混合二硫化物 能够在保护天然二硫键的情况下被化学还原。
[0031] 已经从哺乳动物细胞中分离、表达出人因子IX基因（K.Kurachi和E.W.Davie. 编码人因子IX的cDNA的分离与特征描述。PNAS. 79(21I) :6461-6464,1982 ; K.H.Choo，K.G.Gould，D.J.Rees，和G.G.Brownlee;人抗血友病因子IX基因的分子克隆， Nature299(5879) ： 178-180,1982 ；R.J.Kaufman,L.C.ffasley,B.C.Furie,B.Furie,和 C.B.Shoemaker;中国大鼠卵巢细胞中合成的重组羧基因子IX的表达、纯化和特征描 述?J.Biol.Chem. 261 (21) :9622-9628,1986.)，并从cDNA中推导出氨基酸序列。
[0032]目前FIX用于血友病B的治疗通常包括每周两次注射，例如在拔牙或手术前做辅 助注射。FIX在血循环中以无活性酶原形式存在，只有出血时才转变成有活性的FIXa。因 此，FIX预防性治疗的方法是例如每周注射一次，增加患者血液中FIX的循环时间。这样， 患者体内就总会有一定水平的FIX酶原，在任何时候都可以被激活，保证正常的凝血过程。
[0033] 本发明的FIX类似物，其修饰方法是用半胱氨酸残基取代FIX中的一个或多个天 然氨基酸残基。
[0034] 识别FIX中适于加入半胱氨酸残基的位点：
[0035] 要修饰的氨基酸残基位点优选来自相对侧链表面可接触性大于50%的氨基酸 残基库。重链和EGF2结构域的表面可接触性从发表的晶体学数据库中计算而来（1PFX， Hopfher等，1999)，而EGF1结构域表面可接触性的计算是基于猪FIXa晶体结构的同源模型 (1PFX，Brandstetter等，1995)。另外，激活肽中的氨基酸残基（155-177位残基），尚无其 结构信息的，也被认为是重要的。最近的出版物指出，激活肽这部分片段可以被删除，而不 影响FIX的生活活性（Begbie等，2005)。表1中列出了人类FIX中所有相关的氨基酸残基 位点。
[0036] 表1.位点特异性修饰的FIX相关位点。'ASA1'（以人2表示）是所有氨基酸残基的 可接触位点，'ASA2'（以A2表示）是侧链的可接触位点，'Rel.ASA'是侧链的部分可接触位 点。序列按照糜蛋白酶进行编号，与猪FIXa晶体结构的编号（lPFX.pdb)相同。标记有星号 (*)或负号（_)侧链，被认为在与FVIIa/TF复合物（Chen，C.W?等，ThrombHaemost.2002 ; 88:74-82.)或FVIIIa(Autin，L?等，J.Thromb.Haem. 2005,3:2044-56)的连接中有重要作 用。
[0037]
[0039] ；v,v.'.;.v,'Xv'v!;
【主权项】
1. 循环半寿期延长的FIX类似物，其中在位点146-180的天然氨基酸残基中至少有一 个被结合化学基团的半胱氨酸残基取代，所述化学基团使得FIX多肽的分子量增加。
2. 权利要求1的FIX类似物，其中E162位的氨基酸残基被结合化学基团的半胱氨酸残 基取代，所述化学基团使得FIX多肽的分子量增加。
3. 上述任一权利要求的FIX类似物，其中化学基团选自聚乙二醇（PEG)。
4. 权利要求3的FIX类似物，其中聚乙二醇的平均分子量为500-100, 000,例如 1000-75, 000 或 2, 000-60, 000。
5. 上述任一权利要求的FIX类似物，其中类似物的循环半寿期至少为野生型FIX的 1.5 倍。
6. 上述任一权利要求的FIX类似物，当用凝血实验测定时，其中类似物的生物活性至 少为野生型FIX的20%。
7. -种制备上述任一权利要求的FIX类似物的方法，包括：a)选择性还原工程化FIX 多肽，该多肽在选自146-180的位点至少包括一个非天然半胱氨酸，其通过二硫键与低分 子量硫醇（RS-CYS)结合，方法是使低分子量硫醇结合的FIX与包含氧化还原缓冲体系的混 合物反应；b)与之同时或随后，将至少一个选择性还原的半胱氨酸（HS-Cys)部分与化学基 团结合。
8. -种制备权利要求1-6中任一权项的FIX类似物的方法，其包括：a)选择性还原 工程化FIX多肽，该多肽在选自146-180的位点至少包括一个非天然半胱氨酸，其通过二 硫键与低分子量硫醇（RS-CYS)结合，方法是使低分子量硫醇结合的FIX与包含三芳基 膦-3, 3'，3'' -三磺酸化合物的混合物反应；b)与之同时或随后，将至少一个选择性还原 的半胱氨酸（HS-Cys)部分与化学基团结合。
9. 权利要求7-8的方法，其中化学基团选自聚乙二醇（PEG)。
10. 权利要求9的方法，其中化学基团是聚乙二醇，尤其是平均分子量为 500-100, 000,例如 1000-75, 000 或 2, 000-60, 000 的 PEG。
11. 一种治疗血友病患者的药物制剂，其包含有效治疗剂量的权利要求1-6的FIX类 似物和药学上可接受的载体。
12. 有效治疗剂量的权利要求1-6中任一项FIX类似物和药学上可接受的载体在制备 治疗血友病患者的药物中的用途。
13. 权利要求12的用途，其中治疗包括每周至少一次的治疗。
14. 权利要求13的用途，其中治疗包括每周只进行一次的治疗。
【专利摘要】本发明涉及FIX类似物，与天然FIX相比，其激活前在血流中的循环时间延长(患者注射一周后，FIX的活性仍至少为注射后初始活性峰值的5％)。本发明所要求保护的FIX类似物包含一个插入型氨基酸残基，此氨基酸残基与化学基团结合而进一步被修饰，所述化学基团增加FIX类似物的分子量。
【IPC分类】C12N9-64, A61P7-04, A61K47-48, C12N9-96, A61K38-48
【公开号】CN104593348
【申请号】CN201510017264
【发明人】H.奥斯特加德, O.H.奥尔森, H.R.斯特尼克, T.D.斯蒂恩斯特鲁普
【申请人】诺沃—诺迪斯克保健股份有限公司
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2007年5月24日
【公告号】CA2653154A1, CN101484576A, EP2029738A2, EP2213733A2, EP2213733A3, US20090252720, WO2007135182A2, WO2007135182A3