尖吻蝮蛇血凝酶-c的制作方法
【专利说明】尖吻蝮蛇血凝酶-c
[0001] 本发明是下述发明的分案申请： 申请日：2013年02月21日；【申请号】201310055128. 3 ;发明名称：尖吻蝮蛇血凝酶-C〇
技术领域
[0002] 本发明涉及一种丝氨酸蛋白酶，具体地说是一种蛇毒血凝酶-C，本发明还涉及其 分离纯化方法。
【背景技术】
[0003] 据国内外文献的报导，在蝮亚科（Crotalinae)蛇毒中多存在一类与血液凝固相关 的蛋白酶，通常称之为"类凝血酶"(thrombin_likeenzyme,简称：TLC)。类凝血酶与凝血 酶（thrombin)的作用相似，可以使血浆中纤维蛋白原转化为纤维蛋白而"凝固"。迄今已经 发现现已在30多种蛇毒中含有类凝血酶成分，并有20余种得到分离纯化，其中有10余种 类凝血酶的全部或部分氨基酸序列得到阐明。已发现的TLC分子量多在29?45kD之间， 大多数为酸性糖蛋白。
[0004] 在以往已经发现的蛇毒TLC中，蛋白质一级结构多为单链。其代表产品"立芷雪" (Reptilase)是由巴西矛头蝮蛇atrox)蛇毒中分离出的凝血酶，该酶前体由255 个氨基酸构成，N端有24个氨基酸形成的引导肽，活性酶含231氨基酸，相对分子量39? 43kD，为单链糖蛋白。翟宁等(上海医药工业研究院&浙江海正药业）2005年报道：从皖南 五步蛇acytes)中分离到一种"类凝血酶"，具有凝血作用。SDS-PAGE显示 为单链，还原和非还原电泳分子量分别为59. 25kD和52. 58kD，显示存在链内二硫键，比活 为41.5/u/mg，苯甲基磺酰氟（PMSF)可导致该酶不可逆失活。
[0005] 近十多年来的研究发现在蝮亚科蛇毒TLC中也存在双链分子结构，链间由二硫键 连接。Xin Cheng等（中国科技大学）1999年报导：从五步蛇acwtes)中分 离到一种"类凝血酶"，命名为"Agkisacutacin"。该蛋白由两条肽链构成，a-亚基分子量 15kD,亚基分子量14kD。Agkisacutacin能够水解纤维蛋白原中的a链。肖昌华（中 科院昆明动物研究所）2004年从五步蛇acwtes)中分离到两种"类凝血酶"， 均为双链分子结构。凝血酶I的A亚基含有132个氨基酸，分子量16kD ;B亚基含有123个 氨基酸，分子量14kD，酶比活性为：160U/mg。凝血酶II的A亚基含有122个氨基酸，分子量 15kD ;B亚基含有120个氨基酸，分子量13kD，酶比活性为：70U/mg。该两种TLC经药理实 验证明：均具有止血功效。唐松山2004年从五步蛇acwtes)中分离到一种 "类凝血酶"，具有凝血作用。该酶由17kD和15kD两个亚基组成，等电点5.9。
[0006] 本发明阐述从我国的广西尖吻蝮蛇（J政isfrot/o/? 蛇毒中分离得到一种新 的蛇毒血凝酶--尖吻蝮蛇血凝酶-C。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种蛇毒血凝酶，其是从尖吻蝮蛇蛇毒中分离得到的一种 类凝血酶-C。
[0008] 本发明的另一个目的在于提供一种分离纯化上述血凝酶的方法。
[0009] 本发明血凝酶-C是从中国尖吻蝮蛇（J政acwtes)蛇毒中分离得到的血 凝酶。该酶具有如下特征：①酶蛋白含252个氨基酸，分子量为29213. 4D，等电点pi为5. 7。 ②由a、0两条链构成，链间由二硫键连接。③a链含129个氨基酸，分子量为14661. 7D， 其氨基酸序列如SEQIDNo. 1所示邛链含123个氨基酸，分子量为14551. 7D，其氨基酸序 列如SEQIDNo. 2所示。④酶活性可被苯甲基磺酰氟（PMSF)完全抑制，表明其是一种丝氨 酸蛋白酶。
[0010] 本发明还提供上述血凝酶的纯化方法，其包括如下步骤： 1) 、蛇毒经硫酸铵分级沉淀预处理； 2) 、将预处理后的蛇毒溶液上经预平衡的DEAE-S印hroseFF阴离子交换层析柱，用 0? 01MpH7. 0 ?7. 5 的PBS洗柱，再用含 0? 02 和 0? 06MNaCl的 0? 01MpH7. 0 ?7. 5 的PBS 分段洗脱，收集〇. 06MNaCl第一个洗脱峰； 3) 、将上述洗脱液适当浓缩后透析或经多次稀释超滤去除NaCl; 4) 、将透析后的溶液再次上经预平衡的DEAE-S印hroseFF层析柱，用0. 01MpH7. 0? 7. 5 的PBS洗柱，再用含 0. 05MNaCl的 0. 01MpH7. 0 ?7. 5 的PBS洗脱，收集 0. 05MNaCl 洗脱的第二个洗脱峰； 5) 、将上述洗脱液适当浓缩后用蒸馏水透析或采用S印hadeX-G25柱脱盐。
[0011] 其中，步骤1)蛇毒预处理的方法是将蛇毒用适量预冷的0. 01MpH7. 0?7. 5PBS 溶解，离心收集上清液，硫酸铵分级沉淀，收集70%硫酸铵沉淀，沉淀经PBS悬浮溶解后 进行透析（透析袋截留分子量为7, 000D~10, 000D)，或采用切向流超滤(膜截留分子量为 5, 000D?10, 000D)方法，将悬浮溶解液反复多次稀释、超滤浓缩脱盐。通过预处理可以去 除不溶的杂质以及部分杂蛋白，并降低溶液离子强度。
[0012] 具体地说，可通过如下步骤进行蛇毒的预处理：称取蛇毒若干克，用蛇毒重量 5~10倍体积预冷的0. 01MpH7. 0?7. 5的PBS于4~8°C的层析柜中搅拌溶解30~60分钟， 向溶解液中缓慢添加硫酸铵至50%饱和度，静置2 - 4小时，之后于4~81：、5,000~10,00(^ 离心10~30分钟。收集离心上清液，再向离心上清液中缓慢加入硫酸铵至70%饱和度，静置 过夜，次日于4~8°C、5,000~10,000g离心10~30分钟。取离心沉淀加适量0. 01MpH7. 0? 7. 5的PBS悬浮溶解得溶解液。将溶解液倾入透析袋（截留分子量为7, 000D~10, 000D)，在 层析柜中4~8°C对0. 01MpH7. 0?7. 5的PBS透析12~24小时，期间更换溶液2~4次；或将 溶解液用分子截留值为5, 000~10, 000D的超滤膜经反复多次加入PBS进行稀释超滤浓缩脱 盐。
[0013] 如上所述，透析步骤(取决于溶液体积）可采用切向流超滤(膜截留分子量为 5, 000~10000D)方法代替，通过PBS稀释、超滤浓缩，再稀释、再超滤浓缩的方式以去除小分 子多肽和脱盐降低溶液离子强度。
[0014] 其中，步骤2)和步骤4)可采用0? 01MpH7. 0?7. 5的PBS预平衡DEAE-S印hrose FF层析柱，然后上样。
[0015] 其中，步骤3)和步骤5)的目的均是去除溶液中存在的NaCl。小体积洗脱液可直 接进行透析，大体积洗脱液可通过PBS稀释、超滤浓缩，再稀释、再超滤浓缩的方式以浓缩 蛋白并脱去NaCl。最终被纯化的酶浓缩液可直接采用Sephadex_G25柱脱盐。
[0016] 除盐后的溶液直接冷冻干燥，或加入冻干保护剂冷冻干燥。所述冻干保护剂可以 是低分子右旋糖酐、甘露醇、蔗糖、甘油、明胶等。不同冷冻保护剂的各自加入量为〇. 1% -2%(w/v)。
[0017] 经本发明方法纯化的血凝酶比活力不低于40U/mg蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)-条带，还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(还原SDS-PAGE)两条带；HPLC分析纯度95% 以上。以蛇毒原料重量计，本法纯化收得率为0. 4% - 0.