一种邵伯鸡鉴定用引物及其应用和快速鉴定邵伯鸡的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及邵伯父母代和商品代的鉴定，具体涉及一种利用PCR技术快速鉴定邵伯鸡的方法，属于分子生物学技术领域。
【背景技术】
[0002]邵伯鸡配套系由江苏省家禽科学研究所主持进行攻关，通过在我国优质地方鸡种中导入dw基因，在国内外首次育成矮小型青腿麻羽优质肉鸡品系(S2系)并参与配套。该配套系已通过国家级品种(配套系)审定(农09新品种证字第12号)，是具有自主知识产权的首个国家级优质肉鸡配套系。经鉴定，该项技术成果达国际先进水平。性连锁矮小基因(dw)是生长激素受体(GHR)基因缺陷型，Dw基因是位于Z染色体上的伴性遗传基因，处于肝脏坏死基因in位点和无翼基因we位点之间，靠近银色(S)、金色(s)羽基因和慢羽(K)、快羽(k)基因。正常基因DW对dw为显性，因此只有矮小型纯合型公鸡和携带矮小型基因的母鸡表现出矮小性状。dw和DW为不完全等位基因，dw基因同时具有质量性状基因和数量性状基因的特性，矮小型鸡是鸡纯合型性连锁矮小基因(dw)的表型，具有个体小、耗料少、基础代谢低、产蛋率高、饲养密度大、饲料报酬高、节约成本等优点。
[0003]邵伯鸡配套系与同类鸡种相比，邵伯鸡种鸡开产日龄提前10%、产蛋性能提高20%、每只种鸡节省饲料25%以上，邵伯鸡配套系商品代为青腿麻羽、体貌美观；性早熟，肉质好，适应性强，既能在丘陵地区放养，也适应于规模化笼养；市场接受程度高，售价高15?20%左右，饲养综合效益可提高10%?15%以上。市场应用前景十分广阔，多地出现假冒邵伯鸡出售的现象，需要简单快捷的方法加以鉴定。
[0004]PCR技术是一种分子生物学技术，被广泛地运用在医学和生物学的实验室，例如用于判断检体中是否会表现某遗传疾病的图谱、传染病的诊断、基因复制以及亲子鉴定。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种邵伯鸡鉴定用引物及其应用和快速鉴定邵伯鸡的方法，本发明利用性连锁矮小基因(dw)不同扩增条带大小，鉴别不同真伪邵伯鸡，该方法不受环境影响，具有操作简单、检测快速、结果准确、通用性强、成本低廉等优点。
[0006]本发明提供了一种引物，包括引物Fl和引物F2，
所述引物 Fl 上游引物 F:5，-tcccagactacacttctattca-3，；
所述引物 Fl 下游引物 R:5’ -cgggacagatcaaagacaatac-3’ ；
所述引物 F2 上游引物 F:5，-acctccaaagaaatctgtcgag-3，；
所述引物 F2 上游引物 R:5，-tggccaaatcctgaagtcct-3，。
[0007]本发明还提供了上述引物作为邵伯鸡种质资源的分子鉴定标记的应用。
[0008]此外，本发明又提供了一种快速鉴定邵伯鸡的方法，以受测鸡种的血液提取的DNA基因组为模板，用权利要求1所述引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，根据条带判断是否含有DW和/或dw基因，DW基因鸡仅扩增出417 bp单一条带；只含有dw基因鸡仅扩增出217 bp单一条带；含有DW和dw基因鸡扩增出417 bp和217 bp两个条带；父母代父系仅有417bp条带，父母代母系仅有217bp条带，商品代有417 bp和217 bp两个条带。所述PCR扩增产物中仅出现417 bp单一条带或217 bp单一条带的，为假邵伯商品鸡。
[0009]所述PCR扩增的反应体系为20 UL，所述反应体系由以下成分组成:10XPCRBuffer 2.0 μ L, Mg2+ 2.2 μ L, dNTP Mixture 0.8 μ L, TacfMk 聚合酶(5 U/ μ L ) 0.2μ L，所述引物Fl和引物F2的上、下游引物各I yL，cDNA模板I μ L，ddH20 9.8 μ L0
[0010]所述PCR扩增的反应条件为:95°C预变性5 min ;95°C变性30 s，61.4°C退火30s，72°C延伸30 s，30个循环；72°C延伸8 min ;4°C保存。
[0011]所述琼脂糖凝胶电泳检测步骤为:取5 UL PCR扩增产物与I yL 6XLoadingBuffer混合后用1.5%琼脂糖凝胶电泳120 V电压下20 min,凝胶成像系统拍照。
[0012]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:
第一，本发明提取待测样本的鸡基因组DNA，PCR扩增父母代父系仅有417bp条带，父母代母系仅有217bp条带，商品代有417 bp和217 bp两个条带，鉴别真伪邵伯鸡。本发明是直接以受测鸡种的血液提取的DNA基因组为模板，利用PCR技术检测出dw基因的片段大小。本发明的优越性体现在:操作简单、检测快速、结果准确、通用性强、成本低廉等优点；第二，本发明公开了矮小基因(dw)作为邵伯鸡父母代、商品代的分子鉴别标记的应用。
[0013]本发明包括:dw基因PCR扩增的上下游引物混合物和PCR反应试剂。PCR反应试剂为lOXbuffer，dNTP, rTaq酶。本发明包括DW基因PCR扩增的上下游引物混合物，PCR所需试剂。本发明方法效果显著，检测方法简单快捷，且不受外界环境的影响。本发明应用于邵伯鸡品种鉴定，主要用于邵伯鸡祖代、父母代和商品代的鉴定，本发明设计合理，使用方便、结果可靠且成本低廉。
【附图说明】
[0014]图1是父母代父系公鸡的扩增图；
图2是父母代母系母鸡的扩增图；
图3是商品代的扩增图。
【具体实施方式】
[0015]一种引物，包括引物Fl和引物F2，
所述引物 Fl 上游引物 F:5，-tcccagactacacttctattca-3?；
所述引物 Fl 下游引物 R:5’ -cgggacagatcaaagacaatac-3’ ；
所述引物 F2 上游引物 F:5，-acctccaaagaaatctgtcgag-3，；
所述引物 F2 上游引物 R:5，-tggccaaatcctgaagtcct-3，。
[0016]上述引物作为邵伯鸡种质资源的分子鉴定标记的应用。
[0017]一种快速鉴定邵伯鸡的方法，其特征是，以受测鸡种的血液提取的DNA基因组为模板，用权利要求1所述引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，根据条带判断是否含有DW和/或dw基因，Dff基因鸡仅扩增出417 bp单一条带；只含有dw基因鸡仅扩增出217 bp单一条带；含有DW和dw基因鸡扩增出417 bp和217 bp两个条带；父母代父系仅有417bp条带，父母代母系仅有217bp条带，商品代有417 bp和217 bp两个条带。PCR扩增产物中仅出现417 bp单一条带或217 bp单一条带的,为假邵伯商品鸡。
[0018]PCR扩增的反应体系为20 μ L，所述反应体系由以下成分组成:10 X PCR Buffer2.0 μ L, Mg2+ 2.2 μ L, dNTP Mixture 0.8 μ L, TacfMk 聚合酶(5 U/ μ L ) 0.2 μ L，所述引物Fl和引物F2的上、下游引物各I yL，cDNA模板I μ L，ddH20 9.8 μ L0
[0019]PCR扩增的反应条件为:95°C预变性5 min ;95°C变性30 s，61.4°C退火30 S，72°C延伸30 S，30个循环；72°C延伸8 min ;4°C保存。
[0020]琼脂糖凝胶电泳检测步骤为:取5 yL PCR扩增产物与I μ L 6 X Loading Buffer混合后用1.5%琼脂糖凝胶电泳120 V电压下20 min，凝胶成像系统拍照。
[0021]实施例1
1、试验材料
实验所用邵伯鸡来自江苏省家禽科学研究所，10只矮小型父母代母系公鸡(Zdw zdw)、10只杂合子商品代公鸡(ZDw Zdw)、10只正常型父母代父系公鸡(Zdw ZDw)、10只矮小型母系母鸡(Zdw W)、10只正常型父系鸡母鸡(Zdw W)，所有鸡翅静脉采血，肝素钠抗凝。
[0022]2、操作步骤
PCR 扩增:PCR 扩增体系为 20 yL:10XPCR Buffer 2.0 μ L, Mg2+ 2.2 μ L，dNTPMixture 0.8 μ L，T^DNA 聚合酶(5 U/μ L ) 0.2 μ L，F1 和 F2 上、下游引物各 I yL，cDNA模板 I μ L，ddH20 9.8 μ L0 反应条件:95°C预变性 5 min ;95°C变性 30 s，61.4°C退火 30s，72°C延伸30 s，30个循环；72°C延伸8 min ;4°C保存。
[0023]琼脂糖凝胶电泳检测:取5 UL PCR扩增产物与I μ L 6 X Loading Buffer混合后用1.5%琼脂糖凝胶电泳120 V电压下20 min，凝胶成像系统拍照。
[0024]3、结果
矮小型父母代母系公鸡扩增图如图2所示，杂合子商品代公鸡扩增图如图3所示、父母代父系公鸡扩增图如图1所示、矮小型母系母鸡扩增图如图2所示、I正常型父系鸡母鸡扩增图如图1所示。由此可见，PCR扩增片段大小可作为邵伯鸡品种鉴定的方法。
【主权项】
1.一种引物，其特征是，所述引物包括引物Fl和引物F2， 所述引物 Fl 上游引物 F:5，-tcccagactacacttctattca-3，； 所述引物 Fl 下游引物 R:5’ -cgggacagatcaaagacaatac-3’ ； 所述引物 F2 上游引物 F:5，-acctccaaagaaatctgtcgag-3，； 所述引物 F2 上游引物 R:5，-tggccaaatcctgaagtcct-3，。
2.如权利要求1所述的引物作为邵伯鸡种质资源的分子鉴定标记的应用。
3.一种快速鉴定邵伯鸡的方法，其特征是，以受测鸡种的血液提取的DNA基因组为模板，用权利要求1所述引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，根据条带判断是否含有DW和/或dw基因，Dff基因鸡仅扩增出417 bp单一条带；只含有dw基因鸡仅扩增出217 bp单一条带；含有DW和dw基因鸡扩增出417 bp和217 bp两个条带；仅有417bp条带为父母代父系，仅有217bp条带为父母代母系，有417 bp和217 bp两个条带为商品代；所述PCR扩增产物中仅出现417 bp单一条带或217 bp单一条带的，为假邵伯商品鸡。
4.根据权利要求3所述的快速鉴定邵伯鸡的方法，其特征是，所述PCR扩增的反应体系为20 μ L，所述反应体系由以下成分组成:10 X PCR Buffer 2.0 μ L7Mg2+ 2.2 μ L, dNTPMixture 0.8 μ L,5 U/μ L聚合酶0.2 μ L，所述引物Fl和引物F2的上、下游引物各 I μ L，cDNA 模板 I μ L, ddH20 9.8 μ L。
5.根据权利要求4所述的快速鉴定邵伯鸡的方法，其特征是，所述PCR扩增的反应条件为:95°C预变性 5 min;95°C变性 30 s，61.4°C退火 30 s，72°C延伸 30 s，30 个循环；72°C延伸8 min ;4°C保存。
6.根据权利要求3所述的快速鉴定邵伯鸡的方法，其特征是，所述琼脂糖凝胶电泳检测步骤为:取5 μ L PCR扩增产物与I μ L 6 X Loading Buffer混合后用1.5%琼脂糖凝胶电泳120 V电压下20 min，凝胶成像系统拍照。
【专利摘要】一种引物，包括引物F1和引物F2，引物F1和引物F2的核苷酸序列如序列表所示。本发明还提供了上述引物作为邵伯鸡种质资源的分子鉴定标记的应用。此外，本发明又提供了一种快速鉴定邵伯鸡的方法，以受测鸡种的血液提取的DNA基因组为模板，用上述引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，根据条带判断是否含有DW和/或dw基因，DW基因鸡仅扩增出417 bp单一条带；只含有dw基因鸡仅扩增出217 bp单一条带；含有DW和dw基因鸡扩增出417 bp和217 bp两个条带。本发明利用性连锁矮小基因（dw）不同扩增条带大小，鉴别不同真伪邵伯鸡，该方法不受环境影响，具有操作简单、检测快速、结果准确、通用性强、成本低廉等优点。
【IPC分类】C12N15-11, C12Q1-68
【公开号】CN104593358
【申请号】CN201410796811
【发明人】赵振华, 黎泰丰, 张晶鑫, 黄华云, 李春苗, 王钱保, 吴兆林, 陈联颐
【申请人】江苏省家禽科学研究所
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2014年12月22日