专利名称：一种高效杀虫真菌及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物防治领域，具体地涉及一种高效杀虫真菌及其用途。
技术背景
农业、林业、园艺等植物以及牧草、草坪经常遭受病虫害侵袭，其中金龟子类 害虫的为害十分严重，且缺乏高效的治理方法。我国金龟子种类多，1500种，分布广， 其主要为害在幼虫阶段，由于幼虫整个生活历期全在土壤中，隐蔽性强，食量巨大，啃 食植物根、根茎或根系，造成严重减产或植株损害。一般年份造成10-30%的农作物损 失，有的区域严重损失至50-80%，甚至绝收。长期以采用化学农药防治，使其抗药性 明显增加，一般农药很难达到有效治理，有时不得不使用高毒农药，造成残留和环境污 染，成为阻碍农产品出口创汇的障碍，也直接威胁着人民的健康生活。近年我国加大农 药残留与环境污染治理，以保障农产品安全和环境生态平衡，原先使用的高毒性农药已 经被禁用或限用，尚无有效的高效低毒农药。随着人们生活水平的提高，对有机和无公 害农产品需求日益增加，发展和应用生物农药等无公害的植保技术成为生产急需解决的 问题。
与化学农药相比，生物农药在植物病害虫防治中具有独特优势，如对不同目标 害虫的特效性，田间持效性，害虫不易产生抗药性，对天敌、人畜安全性及与环境兼容 性等，因而能够在有效控制病虫害的同时，维护生态食物链和环境平衡，成为近年的研 究与开发热点。
利用对害虫有控制作用的天然生物资源，是解决上述问题的重要途径。绿僵菌 是一类最有潜力作为生物农药的昆虫病原真菌，李增智等的综述中报告有200多种昆虫 曾径被绿僵菌侵染。绿僵菌由于能在自然土壤环境下长期存活，可有效地控制地下害虫 暴发和为害。绿僵菌作为生物农药资源，其优点是源于自然环境生物，对特定的病虫草 害具有特效控制作用，对非靶生物安全性高，无污染无残留，与环境友好兼容，适用于 农作物无公害生产过程，加上可利用工业发酵技术进行规模化繁殖生产，极具市场开发 潜力。
绿僵菌基于对害虫的体壁接触侵染机制和在田间土壤中长期存活的特性，在防 治地下害虫尤其是金龟类害虫方面有独特潜力和明显优势。但不同菌株对不同害虫种 类的毒力有较强专一性。地下害虫种类繁多、生活历期长和抗药性强，加之土壤环境复 杂，要得到真正有防治应用潜力的菌株必须经过人工筛选和改良菌株。发明内容
为了解决上述问题，本发明的发明人提出并完成了本发明。
本发明的目的是提供一种能够有效防治金龟类地下害虫、与环境友好兼容的高 效杀虫真菌绿僵菌菌株MBJQH2-2。
本发明的再一目的是提供上述绿僵菌菌株MBJQH2-2的培养方法。3
本发明的再一目的是提供上述绿僵菌菌株MBJQH2-2的应用。
本发明的再一目的是提供一种金龟子类地下害虫的生物杀虫剂。
本发明的发明人分别从河北、山东、江苏、北京、贵州等地的农田或林地采集 到土壤和感染绿僵菌病症的蛴螬虫尸，在实验室内进行微生物分离、纯化，保存纯化的 绿僵菌菌种在PDAY试管培养基中，共得到12个菌株。将纯化的菌种接种在PDAY平板 培养基上，于25士 1°C培养箱中培养10-12天，收集分生孢子粉，进行生物测定，根据蛴 螬最终死亡率筛选得到3个具有较高毒力作用的菌株。将这3个菌株反复接种蛴螬虫体 并从病虫上再分离纯化及生物学测定选择，得到系列复壮菌株。先后从不同田间环境采 集到不同种类的蛴螬，分别是花生田暗黑鳃金龟、大黑鳃金龟和铜绿丽金龟，2种草坪金 龟，1种果树金龟，1种高原灌木金龟，用上述相同方法进行生物测定，比较复壮菌株与 原来初始菌株的杀虫活性，最终筛选出高效菌株Metarhizium anisopliae MBJQH2-2。该 绿僵菌菌株MBJQH2-2 (Metarhizium anisopliae)于2010年10月27日保存于中国普通微 生物菌种保藏中心(保藏中心地址北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究 所，邮编100101)，其保藏编号是CGMCC No.4275。
所述菌株的ITSl-5.8S_r^2 rDNA区域的核苷酸序列如SEQ ID No.l所示CCG AGTTAAGGGAAACCGACTTCCACTCCCACCCCTGTGATTATACCTTTAATTGTTGCTTC GGCGGGACTTCGCGCCCGCCGGGGACCCAAACCTTCTGAATTTTTTAATAAGTATCTT CTGAGTGGTTAAAAAAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGG CATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGA ATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGTCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTT CGAGCGTCATTACGCCCCTCAAGTCCCCTGCGGACTTGGTGTTGGGGATCGGCGAGG CTGGTTTTCCAGCACAGCCGTCCCTTAAATTAATTGGCGGTCTCGCCGTGGCCCTCCT CTGCGCAGTAGTAAAGCACTCGCAACAGGAGCCCGGCGCGGTCCACTGCCGTAAAAC CCCCCAACTTTTTATA
为了将本菌株用于害虫防治，本发明还提供了上述绿僵菌MBJQH2-2菌株的大 量培养方法，其步骤包括
1)液体种子培养配制液体培养基，其中含蔗糖3%，酵母浸出粉1%。将菌种 孢子接种到装有培养基的摇瓶中，接种量为2-3X IO5孢子/mL，于25士 1°C、2OOrpm摇 床上培养48h。
幻液体放大培养配制液体培养基，其中含蔗糖2%，玉米粉1%，酵母1%， 磷酸氢二钾0.1%，硫酸镁0.05%，硫酸铜0.001%。将液体种子接种发酵罐中，按体积 比接种量为2-5%，控制温度25 士 1°C、转速50-280rpm，16h后开始通气，通气量0.7 1，发酵培养48-60h。
3)固体发酵培养配制固体培养基，其中含谷壳或碎麦秸35-55%，麦麸或谷 糠40-50，粳米粉5-25%。所用容器可以是筛筐、透气袋子或罐头瓶等。将液体培养 物接种到灭菌的固体培养基中，接种量为体积重量比0.8-1，基料适宜厚度5-8cm，于 25士 1°C培养室中培养10-14天，干燥后用振筛法或旋风法分离收集孢子粉，即得到发酵产品 ο
本发明还提供了上述绿僵菌MBJQH2-2菌株的应用，本发明的绿僵菌MBJQH2-2孢子可以制成粉剂、颗粒剂的形式投撒到虫害发生区。优选，在使用前将 上述绿僵菌MBJQH2-2孢子粉用泥土或工业无机填充料如硅藻土、高岭土等进行稀释分 散，制成含孢量每克10-20亿孢子的粉剂，然后投撒到地下害虫发生的区域。或者，在 使用前将孢子粉按照可湿性粉剂加工方法，制成含孢量每克20-100亿孢子的可湿性粉 剂，兑水后喷洒或浇淋到地下害虫发生的区域。或者，在使用前将孢子粉按照颗粒剂的 加工方法，制成含孢量每克2-10亿孢子的颗粒剂，然后投撒到地下害虫发生的区域。其 中，在播种时和作物生长期间均可使用本发明的绿僵菌MBJQH2-2菌株制剂，由于金龟 类地下害虫生活期长，从初春到深秋的作物生长期内均可能造成危害。因此，根据本发 明的金龟子类地下害虫的生物杀虫剂，其包括上述绿僵菌菌株MBJQH2-2的孢子粉。
绿僵菌是一类昆虫病原真菌，通过附着于昆虫表皮、产生芽管穿透虫体表皮侵 入，消耗虫体营养，自身快速繁殖，产生毒素，造成虫体组织损害和病变死亡。高湿度 利于绿僵菌孢子的萌发和侵入，把握傍晚和雨前时机用菌可提高防治效果。同时绿僵菌 在土壤中有较长的存活能力，可在植物被明显危害期之前使用，使用后数月和翌年可保 持一定的防效。
本发明的绿僵菌菌株源于自然归于自然、与环境友好兼容、无污染无残留，对 金龟类地下害虫有独特的高效控制作用，可作为无公害新型农药，用于农作物、果树、 林木、草坪等地下害虫的无害化生产过程。通过田间防治试验证明具有良好的防治效 果，对几种重要种类金龟幼虫防效达到60-70%。
图1为M.anisopliae MBJQH2-2菌株的分生孢子形态。
图2为M.anisopliae MBJQH2-2菌株的基因组DNA的电泳图。
图 3 为 M.anisopliae MBJQH2-2 菌株的 ITS1-5.8S-ITS2 rDNA 片段。
图4为被绿僵菌MBJQH2-2侵染致病的金龟子幼虫，左健康虫；右罹病 虫。
绿僵菌菌株MBJQH2_2 (Metarhizium anisopliae)于 2OlO 年 10 月 27 日保存于中国普通微生物菌种保藏中心(保藏中心地址北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微 生物研究所，邮编100101)，其保藏编号是CGMCC No.4275。
具体实施方式
结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1绿僵菌MBJQH2-2菌株的分离、纯化
分别从河北、山东、江苏、北京、贵州等地的农田或林地采集到土壤和感染绿 僵菌病症的蛴螬虫尸，在实验室内进行微生物分离、纯化。
分离、纯化步骤为小心挑取虫尸上的菌体，接种到选择性培养基上，在25°C 温度下培养7天，分辨菌落并转移到新的选择性培养基平皿上，在25°C温度下培养14天 以上，待菌落完全产孢后，转移到菌种培养基试管中，在25°C温度下培养14天后，于 4°C冰箱冷藏保存。
保存纯化的绿僵菌菌种在PDAY试管培养基中，共得到12个菌株。将纯化的5菌种接种在PDAY平板培养基上，于25士 1°C培养箱中培养10-12天，收集分生孢子粉， 进行生物测定。测定方法是将孢子粉定量加入到土壤中，混拌均勻，形成每克土壤含 2X IO7孢子的混合菌土，从田间采集蛴螬并放入上述菌土中，每菌株处理20只蛴螬，3 次重复，于23-26°C培养20天，根据蛴螬最终死亡率筛选得到3个具有较高毒力作用的菌 株。将这3个菌株反复接种蛴螬虫体并从病虫上再分离纯化，得到复壮菌株。先后从不 同田间环境采集到不同种类的蛴螬，分别是花生田暗黑鳃金龟、大黑鳃金龟和铜绿丽金 龟，2种草坪金龟，1种果树金龟，1种高原灌木金龟，用上述相同方法进行生物测定， 比较复壮菌株与原来初始菌株的杀虫活性，最终筛选出高效菌株Metarhizium anisopliae MBJQH2-2。绿僵菌菌株 MBJQH2-2 (Metarhizium anisopliae)于 2010 年 10 月 27 日保存 于中国普通微生物菌种保藏中心(保藏中心地址北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学 院微生物研究所，邮编100101)，其保藏编号是CGMCC No.4275。
实施例2菌株的形态学和生物学特征
配制PDAY培养基，其组分和配制方法为将新鲜土豆200g加水约IOOOmL煮开 15min,用纱布过滤后留液体，加葡萄糖20g、酵母浸出粉相、琼脂15g，加热使琼脂完 全融化，定量至IOOOmL,分装到三角瓶中，置于高压蒸气灭菌器中121°C保持20η ι， 待凉至约60°C时倒入培养皿中，制成平板待用。
在PDAY平板培养基上接种分生孢子，25°C培养2d，肉眼观察可见菌落，菌落 菌丝呈白色绒毛状，继续培养3-4d，可见菌落扩大生长，表面有绿色孢子产生，颜色由 浅绿色逐渐变为深橄榄绿色。
在凹型载玻片的小室内滴一滴灭菌的PDAY培养基，接种分生孢子，25°C培养 3-4d，于显微镜下观察，可见分生孢子梗单生，瓶梗柱状单生。分生孢子短柱形中部略 窄但不明显，两端钝圆或略尖，大小5-8Χ2-3μιη，在瓶梗上首尾相连着生成长链，如 图1所示。
实施例3菌株的核糖体ITS区核苷酸序列特征
配制LM培养基，其组分和配制方法为称取蔗糖20g、蛋白胨5g，加水至 IOOOmL,分装至三角瓶，置于高压蒸气灭菌器中121°C保持20η ι，放凉至室温备用。
接种分生孢子至上述培养基中，接种量为2-3Χ105孢子/mL，于25士 1°C、 200rpm摇床上培养48h，用滤纸过滤后留菌丝，挤干水分备用。
用CTAB法提取基因组DNA。按常规DNA提取操作进行，得到基因组DNA， 如图2所示。
以 ITS1-5.8S-ITS2 rDNA 区域引物 1 5 ‘-GTTTCCGTAGGTGAACCTGC 和引 物2 5 ‘-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT进行PCR扩增，得到扩增的DNA片段，如图3，将片段进行核苷酸序列检测，得到菌株ITSlUS-ITMrDNA区域的核苷酸序列，如 SEQI D No. 1 所示。
实施例4菌株的发酵培养
按以下步骤进行
1)液体种子培养配制液体培养基，其组分和配制方法为称取蔗糖30g、酵母 浸出粉10g，加水至lOOOmL，分装至三角瓶，置于高压蒸气灭菌器中121°c保持20η ι， 放凉至室温备用。将菌种孢子接种到装有培养基的摇瓶中，接种量为3X IO5孢子/mL，于25 士 1 °C、200rpm摇床上培养48h。
幻液体放大培养配制液体培养基，其组分和配制方法为按以下比例称取蔗 糖20g、玉米粉10g、酵母10g、磷酸氢二钾lg、硫酸镁0.5g、硫酸铜O.Olg，加水至 lOOOmL。于发酵罐中通高压蒸气至121°C保持20η ι，放凉至室温备用。将1)培养的 液体种子接种发酵罐中，按体积比2%接种，控制温度25士 1°C，转速150-200rpm，16h 后开始通气，通气量0.7 1，发酵培养54h。
3)固体发酵培养配制固体培养基，其组分和配制方法为按以下比例称取谷壳 350g、麦麸550g、粳米粉100，混合均勻后分装到罐头瓶中，装量高度6cm，以透气膜封 盖，置于高压蒸气灭菌器中121°C保持20η ι，放凉至室温备用。将幻的液体培养物接 种到灭菌的固体培养基中，接种量为体积重量比0.8，于25士 1°C培养室中培养14天。
4)干燥后用振筛法或旋风法分离收集孢子粉，即得到发酵产品。
实施例5菌株对金龟子卵孵化的抑制作用效果
6月下旬，分别从田间采集到铜绿丽金龟和大黑鳃金龟成虫，在实验室内饲 养，待其产卵，取3-5日龄的卵进行生物测定。测定方法为将发酵培养得到的孢子粉用 0.05%的TW80水溶液配制成5 X IO7孢子/mL的孢子悬浮液，将虫卵浸没在孢子悬浮液 中20sec，取出后立即置于滤纸吸去多余水分，埋于含水量17%的灭菌土壤中。每处理 30只虫卵，3次重复，以TW80水溶液为空白对照。于23-26°C室温孵化12天，根据孵 化的幼虫数比较确定菌株对虫卵的抑制作用。结果见表1，证明菌株能抑制一定比例的虫 卵孵化。
表1绿僵菌MBJQH2-2对两种金龟子卵孵化的抑制作用
权利要求
1.一种高效杀虫真菌绿僵菌菌株MBJQH2-2，Metarhizium anisopliae,其保藏编号 为CGMCC No.4275。
2.根据权利要求1所述的绿僵菌菌株MBJQH2-2，其特征在于，所述菌株的 ITS1-5.8S-ITS2 rDNA区域的核苷酸序列如SEQ ID No.l所示。
3.权利要求1所述绿僵菌菌株MBJQH2-2的培养方法，其特征在于，所述方法包括 以下步骤1)液体种子培养配制液体培养基，其中含蔗糖3%，酵母浸出粉1%，将菌种孢子 接种到装有培养基的摇瓶中，接种量为2-3X IO5孢子/mL，于25士 1°C、200rpm摇床上 培养48h ；2)液体放大培养配制液体培养基，其中含蔗糖2%，玉米粉1%，酵母1%，磷酸 氢二钾0.1%，硫酸镁0.05%，硫酸铜0.001%，将液体种子接种发酵罐中，按体积比接种 量为2-5%，控制温度25士 1°C、转速50-280rpm，16h后开始通气，通气量0.7 1，发 酵培养48-60h ；3)固体发酵培养配制固体培养基，其中含谷壳或碎麦秸35-55%，麦麸或谷糠 40-50%,粳米粉5-25%，将液体培养物接种到灭菌的固体培养基中，接种量为体积重 量比0.8-1，基料适宜厚度5-8cm，于25士 1°C培养室中培养10-14天，干燥后用振筛法或 旋风法分离收集孢子粉，即得到发酵产品。
4.权利要求1所述绿僵菌菌株MBJQH2-2对金龟子类地下害虫的杀虫作用。
5.—种金龟子类地下害虫的生物杀虫剂，其特征在于，包括权利要求1所述的绿僵菌 菌株MBJQH2-2的孢子粉。
6.根据权利要求5所述的生物杀虫剂，其特征在于，所述杀虫剂为粉剂或颗粒剂。
全文摘要
本发明涉及生物防治领域，具体地涉及一种高效杀虫真菌及其用途。本发明提供一种能够有效防治金龟类地下害虫、与环境友好兼容的高效杀虫真菌绿僵菌菌株MBJQH2-2，其保藏编号为CGMCC No.4275。本发明的绿僵菌菌株源于自然归于自然、与环境友好兼容、无污染无残留，对金龟类地下害虫有独特的高效控制作用，可作为无公害新型农药，用于农作物、果树、林木、草坪等地下害虫的无害化生产过程。通过田间防治试验证明具有良好的防治效果，对几种重要种类金龟幼虫防效达到60-70％。
文档编号C12N1/14GK102021122SQ201010538328
公开日2011年4月20日 申请日期2010年11月5日 优先权日2010年11月5日
发明者农向群, 刘春琴, 张泽华, 王广君 申请人:中国农业科学院植物保护研究所