专利名称：利用BGIos135基因促进植物根的生长的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于促进植物根的生长的方法。特别地，本发明利用BGIOS135基因促 进植物根的生长。
背景技术：
水稻是我国重要的经济作物，其栽种面积为4. 5亿亩左右。世界上约有60%的人 口以稻米作为日常主食。通过水稻的分子育种来提高产量，给全球的粮食生产带来了巨大 收益。矮秆基因的利用和多分蘖水稻的育成，使我国的水稻产量取得了巨大飞跃。但在相 当长的一段时间里，我国的水稻单产出现了徘徊不前的局面。由此，许多育种工作者从育种 理论和方法上提出了新的思路和设想，希望使水稻单产取得新的突破。在水稻的高产育种 理论上，国际水稻研究所于20世纪90年代初就提出了基于新株型的超级稻理论，然而，到 目前为止，在水稻的育种科研与实践中对水稻地下部分的形态和生理性状的改良却未能在 水稻的分子育种中得以具体体现。目前我国水稻的水肥利用率低，这不仅造成大量人力、物力和财力的浪费，而且大 量的化学肥料和农药通过地表径流以及土壤渗透排入江河湖泊和地下水中，对地表和地下 水造成严重污染。这已经成为环境污染的一个重要方面。另一方面，全世界近一半的水稻 种植面积处在缺水的状态下，严重影响了水稻产量的提高。我国很多地区由于相对缺乏灌 溉用水，致使水稻生产难以发展，这在一定程度上影响了耕地资源的充分利用。因此，提高 水稻本身的水肥利用率，发展节水型水稻，是新时期可持续农业发展的又一基本要求。而对 于提高水稻品种本身的肥料利用率来说，根系的相关形态和生理性状的改良至关重要。随 着环保和农业的进一步发展，在经济发达的地区，解决水稻易发生根倒伏，提高水肥利用率 已成为提高水稻产量和发展的一个关键问题。从根系角度研究水稻抗根倒伏的生物学、力 学机制及其遗传基础，对于从栽培和育种角度减轻水稻根倒伏的危害，具有巨大的现实和 长远意义。水稻根系既是吸收养分和水分的重要器官，也是一些物质合成和运输的器官，它 的形态发育对水稻产量和品质的影响很早就引起人们的注意。育种学家主要关注于环境对 根系生长发育的影响(孙传清等，中国农业科学.1995，28(1) 42-48)以及根系与产量等因 素之间的相互关系(凌启鸿等，中国农业科学.1984，(4) :3-11)，然而，关于根系的分子育 种研究却很少报道。与根系性状表达相关的分子标记的开发表明，控制水稻根系发育的是 数量性状(Yadav 等人，Theor Appl Genet. 1997，94 :619_632 ；徐吉臣等，遗传学报· 2002， 29(3) :245-249)，但这并未引起足够的重视。石庆华等(中国农业科学.1997，30 (4) 61-67)研究了根系发育与地上部分的相关关系，并指出，在栽培上培育有利于塑造理想株 型的根型是水稻高产栽培的新要求，深根系更有利于高产。但是，育种工作者至今未能就什 么是理想的水稻根型提出具体明确的指标。目前，如何从思路和技术上提出一种崭新的方法来定位水稻根系发育的基因已成 为水稻育种的关键。相关研究表明，检测自然选择信号可能是一条崭新的、高通量的鉴定有 用基因的道路。由于人工选择的时间短，遗传重组事件少，受选择的基因与其邻近区域会紧密连锁，因此，如果观察到一个基因组区域的多态性分布很特别，具有统计学显著性，那么 该区域含有的基因和突变位点即有可能与选择的性状相关。研究表明，水稻全基因组大约 6%的区域为SNP高变区，这些区域可能富集了与亚种分化和重要复杂农艺性状相关的基 因(Tang等人，PLoS Genet. 2006,2 :el99)。Gao L Z等(BMC Evolutionary Biology. 2008， 8 11)通过对栽培稻和普通野生稻进行对比分析，建立了理论群体遗传学数学模型，检测 了 60个微卫星位点所受的人工选择，发现了一些留有显著选择痕迹的位点以及其近邻的 可能的功能基因。但这些研究离从全基因组水平全面分析人工选择的基因依然遥远，这 主要是因为数据量远远不够，模型和方法也有待提高。迄今为止识别出的水稻性状基因 如 qSHl、Re、sh4、hdl (Kovach 等人，Trends in Genetics. 2007,23(11) :578_587)，以及 PROGl (Jin 等人，Nature Genetics. 2008,40(11) 1365-1369)和 GIFl (Wang 等人，Nature Genetics. 2008,40(11) 1370-1374)仍然是通过传统的图位克隆手段获得的。新一代测序技术(如Solexa、Solid测序仪)的出现，为廉价高效地获得水稻根系 发育基因和基因家族提供了前所未有的机会。利用野生稻与栽培稻的基因组重测序数据和 技术，能够比较各栽培种及野生种的基因组结构的异同，这使运用进化基因组学的理论和 方法来获得根系发育相关的基因或基因组功能元件成为可能。长期以来，对水稻根系发育形态、生理性状的遗传改良一直未能在水稻的分子育 种中得以体现。虽然杂交水稻的根系比常规品种在形态和生理上占有优势，使育种家看到 了根系改良的重要性和实际效果，但是迄今为止未能提出一套具体的改良指标。因此，需要 进一步研究和开发水稻根系发育相关基因，以进一步提高根系对营养的吸收和对水肥的利 用率，减少农药的施用，增加地上部分的分蘖和收获等。随着水稻分子育种理论与技术的不断成熟和完善，以及遗传转化体系的建立和优 化，利用新型测序技术结合基因组学方法来鉴定受人工选择的基因资源，使得利用基因组 重测序技术发掘根系发育相关基因和遗传转化成为可能。水稻地下部分发育的改良将进一 步提高水稻的产量、品质和抗性等。水稻根系发育相关基因的开发和遗传转化对于提高水 稻地上部分的产量、降低农业投入、缓解环境污染、实现农业可持续发展具有重要的意义， 其有利于增强我国农业在国际上的竞争力。
发明内容
本发明通过实验证实，基因BGIosl35(其序列可以是SEQ ID NO 7)具有促进植物 根系生长的功能。因此，在一个方面，本发明提供了含有基因BGIOS135的载体。在一个实施方案中， 所述载体优选是表达载体，更优选是在植物中高效表达基因BGIosl35的载体，例如包含基 因BGIosl35的重组载体p6，如本发明的重组载体p6+BGIosl35。在另一个方面，本发明提供了含有基因BGIosl35或根据本发明的载体的宿主细 胞。在一个实施方案中，所述宿主细胞优选是根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens), 例如根癌农杆菌EHA105-p6+BGIosl35。在另一个方面，本发明提供了基因BGIosl35和/或根据本发明的载体和/或宿主 细胞用于促进植物根系生长或用于制备转基因植物或用于植物育种的用途。在一个实施方 案中，所述转基因植物与未进行转基因的植物相比，展示更优良的植物根系生长。
在另一个方面，本发明提供了促进植物根系生长的方法，其包括将基因BGIosl35 和/或根据本发明的载体转化入植物，或用根据本发明的宿主细胞感染植物。在一个实施方案中，通过本领域公知的方法，例如根癌农杆菌转化法来将基因 BGIosl35或根据本发明的载体转化入植物。在一个实施方案中，基因BGIosl35可操作地连接至在植物中有效的表达调控元 件，例如启动子和/或终止子，优选玉米泛素启动子和/或NOS终止子。在另一个方面，本发明提供了产生转基因植物的方法，所述方法包括以下步骤1)将基因BGIosl35和/或根据本发明的载体转化入植物愈伤组织，或用根据本发 明的宿主细胞感染植物愈伤组织；2)从所述愈伤组织再生转基因植物。在一个实施方案中，通过上述方法产生的转基因植物与未进行转基因的植物相 比，展示更优良的植物根系生长，例如转基因植物的根系更深且更发达。在一个实施方案中，通过本领域公知的方法，例如根癌农杆菌转化法来将基因 BGIosl35和/或根据本发明的载体转化入植物愈伤组织。在一个实施方案中，基因BGIosl35可操作地连接至在植物中有效的表达调控元 件，例如启动子和/或终止子，优选玉米泛素启动子和/或NOS终止子。在另一个方面，本发明提供了通过上述方法产生的转基因植物。在另一个方面，本发明提供了被导入了基因BGIosl35或本发明的载体或被本发 明的宿主细胞感染的植物愈伤组织。在另一个方面，本发明提供了上文所述的植物愈伤组织用于制备转基因植物或用 于植物育种的用途。在另一个方面，本发明提供了一种转基因植物，其被导入了基因BGIosl35和/或 根据本发明的载体和/或根据本发明的宿主细胞。在一个实施方案中，所述转基因植物，与未导入基因BGIosl35或根据本发明的载 体或根据本发明的宿主细胞的对照植物相比，展示更优良的植物根系生长，例如转基因植 物的根系更深且更发达。在一个实施方案中，基因BGIosl35可操作地连接至在植物中有效的表达调控元 件，所述表达调控元件例如启动子和/或终止子，优选玉米泛素启动子和/或NOS终止子。在本发明中，重组载体p6是指，包含玉米泛素启动子和NOS终止子的 pCAMB IA-1301 载体。在本发明中，植物优选是单子叶植物，更优选为水稻、谷子(Setariaitalica)、 小麦、高粱、玉米，特别优选为水稻，例如日本晴(Oryza sativa L. japonica. cv. Nipponbare)。发明的有益效果本发明通过实验证实，基因BGIosl35具有促进植物根系生长的功能。从而，与现 有技术相比，本发明的技术方案将进一步提高根系对营养的吸收和对水肥的利用率，减少 农药的施用，增加地上部分的分蘖和收获，进一步提高水稻的产量、品质和抗性。这对于降 低农业投入、缓解环境污染、实现农业可持续发展和增强我国农业在国际上的竞争力具有 重要的意义。
关于牛物材料保藏的说明本发明涉及以下生物材料1.普通野生稻元江种子，其于2010年9月6日保藏于湖北省武汉市武昌珞珈山武 汉大学保藏中心，即中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO :P201011 ；2.根癌农杆菌EHA105，其于2009年12月24日保藏于湖北省武汉市武昌珞珈山武 汉大学保藏中心，即中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO =M 209315 ；3.水稻日本晴种子，其于2009年12月18日保藏于湖北省武汉市武昌珞珈山武汉 大学保藏中心，即中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO :P200910。下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人 员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图 和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说 将变得显然。附图概述
图1是显示愈伤组织GUS染色的检测结果的照片。左边的愈伤组织为未转化 BGIosl35基因的对照愈伤组织，右边的愈伤组织为转化了 BGIosl35基因的转基因愈伤组
幺口
/Ν ο图2是显示水稻幼苗⑶S染色的检测结果的照片。其中，上图显示根的⑶S染色 的检测结果，下图显示叶的GUS染色的检测结果。在图2中，左边的根和叶均来自未转化 BGIosl35基因的对照水稻幼苗，右边的根和叶均来自转化了 BGIosl35基因的转基因水稻 幼苗。图3是显示水稻苗的根系性状观察结果的照片。其中，试管1-2为转化了 BGIosl35 基因的转基因水稻苗，试管3-4为未转化BGIosl35基因的对照水稻苗。
具体实施例方式实施例1 :BGIosl35基因的PCR扩增和pMD18_T+BGIosl35重组载体的构建LPCR 扩增使用植物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN新型植物基因组DNA提取试剂盒，目 录号DP320-02)提取普通野生稻元江(Oryza. rifupongon Yuanjiang)(其由中国科学院 昆明动物研究所董杨提供)的基因组DNA(gDNA)。根据BGIosl35基因的碱基序列，设计一 对PCR特异性扩增引物上游引物Fl (SEQ ID NO :1)包含限制性酶切位点KpnI，下游引物 Rl (SEQ ID NO :2)包含限制性酶切位点Xba I。以上述提取的元江gDNA为模板，利用上游 引物F1、下游引物Rl和高保真Ex Taq (TaKaRa,DRR100B)聚合酶进行PCR扩增。PCR扩增 体系如表1所示。表1 :BGIos 135基因的PCR扩增体系
权利要求
含有基因BGIos135的载体，所述载体优选是表达载体，更优选是在植物中高效表达基因BGIos135的载体，例如包含基因BGIos135的重组载体p6。
2.含有基因BGIosl35或权利要求1的载体的宿主细胞，所述宿主细胞优选是根癌农杆 菌,例如根癌农杆菌EHA105-p6+BGIosl35。
3.基因BGIosl35和/或权利要求1的载体和/或权利要求2的宿主细胞用于促进植 物根系生长或用于制备转基因植物或用于植物育种的用途。
4.权利要求3的用途，其中，所述植物优选是单子叶植物，更优选是水稻、谷子、小麦、高粱、玉米，特别优选是水稻；优选，所述转基因植物与未进行转基因的植物相比，展示更优良的植物根系生长。
5.一种促进植物根系生长的方法，所述方法包括将基因BGIosl35和/或权利要求1的 载体转化入植物，或用权利要求2的宿主细胞感染植物，其中，优选，通过根癌农杆菌转化法来将所述基因和/或所述载体转化入植物； 优选，所述基因可操作地连接至在植物中有效的表达调控元件，所述表达调控元件例 如启动子和/或终止子，优选玉米泛素启动子和/或NOS终止子；所述植物优选是单子叶植物，更优选是水稻、谷子、小麦、高粱、玉米，特别优选是水稻。
6.一种产生转基因植物的方法，所述方法包括以下步骤1)将基因BGIosl35和/或权利要求1的载体转化入植物愈伤组织，或用权利要求2的 宿主细胞感染植物愈伤组织；2)从所述愈伤组织再生转基因植物；其中，所述植物优选是单子叶植物，更优选为水稻、谷子、小麦、高粱、玉米，特别优选为 水稻；优选，通过根癌农杆菌转化法来将所述基因和/或所述载体转化入植物愈伤组织； 优选，所述基因可操作地连接至在植物中有效的表达调控元件，所述表达调控元件例 如启动子和/或终止子，优选玉米泛素启动子和/或NOS终止子；优选，所产生的转基因植物与未进行转基因的植物相比，展示更优良的植物根系生长。
7.通过权利要求6的方法产生的转基因植物，所述植物优选是单子叶植物，更优选为 水稻、谷子、小麦、高粱、玉米，特别优选为水稻。
8.导入了基因BGIosl35或权利要求1的载体或被权利要求2的宿主细胞感染的植物 愈伤组织，其中，所述植物优选是单子叶植物，更优选是水稻、谷子、小麦、高粱、玉米，特别 优选是水稻。
9.权利要求8的植物愈伤组织用于制备转基因植物或用于植物育种的用途。
10.一种转基因植物，其被导入了基因BGIosl35和/或权利要求1的载体和/或权利 要求2的宿主细胞，其中所述植物优选是单子叶植物，更优选为水稻、谷子、小麦、高粱、玉米，特别优选为水稻；优选，所述基因可操作地连接至在植物中有效的表达调控元件，所述表达调控元件例 如启动子和/或终止子，优选玉米泛素启动子和/或NOS终止子；优选，所述转基因植物与未导入基因BGIosl35或权利要求1的载体或权利要求2的宿主细胞的植物相比，展示更优良的植物根系生长。
全文摘要
本发明提供了促进植物根的生长的方法。特别地，本发明提供了利用BGIos135基因促进植物根的生长的方法。本发明还提供了BGIos135基因用于促进植物根的生长的用途。本发明还提供了具有导入的BGIos135基因的转基因植物，以及产生此类转基因植物的方法。
文档编号C12N15/82GK101979600SQ20101053826
公开日2011年2月23日 申请日期2010年11月10日 优先权日2010年11月10日
发明者倪雪梅, 孙红正, 李宁, 杨爽 申请人:深圳华大基因科技有限公司