专利名称：由葡萄糖和乙醇酸进行3-羟基酸的微生物生产的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过重组基因表达来生产3-羟基酸，例如3，4- 二羟基丁酸和3-羟基丁内酯。
背景技术：
3，4_ 二羟基丁酸(DHBA)和3_羟基丁内酯(3-HBL)是非常有用的手性中间体，可用于合成他汀类药物(如CRESTOR 和LIMTOR )、肉碱和其它精细化学品。在 2003年和2004年，他汀类药物每年的市场估计是100-150亿美元，而肉碱(用作维生素补充剂)的年需求量估计为几百吨。DHBA和3-HBL还可容易地衍生为有价值的化合物例如肉碱，每克肉碱的成本为约5美元，其用作维生素和营养补充剂。目前尚无市售的DHBA，而3-HBL的成本为每克30-100美元。这些化合物的高成本和低可得性提高了他汀类药物的成本。现有的DHBA和3-HBL合成方法依赖于原始的苛刻的化学合成方法，例如苹果酸的苛性还原或者用酸分解各种己糖。这些化学合成方法产生几种副产物，需要对DHBA或3-HBL产物进行复杂纯化。这些缺点使DHBA和3-HBL的化学合成相对缺乏吸引力且不经济。
发明内容
本文描述了在细胞(例如大肠杆菌(E. coli)细胞)中制备3-羟基酸(例如3， 4-二羟基丁酸(DHBA)和3-羟基丁内酯(3-HBL))的高效的生物学方法。所述方法色括利用重组表达(l)pct基因、(2)phaA、thil、atoB或bktB基因中至少之一和(3)phaB、Sl或 hbd基因中至少之一并且任选地重组表达tesB基因和/或编码乙醇酸还原酶之基因的细胞作为合成DHBA和3-HBL的高效和有成本效益的工具。本发明的方面涉及重组表达(l)pct基因、(2)phaA、thil、at0B或WitB基因中至少之一和C3)phaB或Wxl基因中至少之一的细胞。在某些实施方案中，所述细胞还重组表达tesB基因和/或编码乙醇酸还原酶的基因。所述细胞可以是细菌细胞、真菌细胞(包括酵母细胞)、植物细胞、昆虫细胞或动物细胞。在一些实施方案中，所述细胞是细菌细胞，例如大肠杆菌(Escherichia coli)细胞。或者，应当理解的是，并非所有的基因都需要在与本发明方法相关的细胞中重组表达。在其中一个或更多个与本发明相关之基因在细胞中内源性表达的实施方案中，则细胞不必需要重组表达在所述细胞中内源性表达的一个或更多个基因。在这些实施方案中， 所述细胞可另外重组表达所述通路中未在所述细胞中内源性表达的任意基因。在一些实施方案中，所述pet、phaA、thil、atoB、bktB、phaB、hbd、tesB 和乙醇酸还原酶基因中的一种或更多种由一种或更多种质粒表达。在一些实施方案中，所述pet、 phaA、thil、atoB、bktB、phaB、hbd、tesB和乙醇酸还原酶基因中的一种或更多种被整合到所述细胞的基因组中。在某些实施方案中，所述phaA、bktB和/或phaB基因是真养雷氏菌 (Ralstonia eutropha)基因，例如真养雷氏菌H16基因。在某些实施方案中，所述pet基因是埃氏巨球形菌(Megasphaera elsdenii)基因例如埃氏巨球形菌BE2-2083基因。在某些实施方案中，所述tesB基因是大肠杆菌(Escherichia Coli)基因，例如大肠杆菌K12基因。在一些实施方案中，所述编码乙醇酸还原酶的基因是假单胞菌属O^eudomonas)基因或酵母属(Saccharomyces)基因。本发明的某些方面涉及生产DHBA和/或3-HBL的方法，所述方法包括培养与本发明相关的细胞来生产DHBA和/或3-HBL，并任选地从所述细胞回收DHBA和/或3-HBL。在一些实施方案中，所述细胞是在葡萄糖和/或乙醇酸和/或丙酸的存在下培养的。本发明的一些方面涉及制备具有提高的DHBA和/或3-HBL生产的细胞的方法，包括在所述细胞中重组表达(l)pct基因、0)phaA、thil、at0B或WitB基因中至少之一以及 (3) phaB或hbd基因中至少之一。在一些实施方案中，所述细胞还重组表达tesB基因和/ 或编码乙醇酸还原酶的基因。在一些实施方案中，为所述细胞提供葡萄糖和/或乙醇酸和/ 或丙酸。所述细胞可以是细菌细胞、真菌细胞(包括酵母细胞)、植物细胞、昆虫细胞或动物细胞。在一些实施方案中，所述细胞是细菌细胞，例如大肠杆菌细胞。在一些实施方案中， 所述细胞表达recA和/或endA。在某些实施方案中，所述细胞是大肠杆菌MG1655 (DE3)细胞。在一些实施方案中，所述pet、phaA、thil,atoB、bktB、phaB、hbd、tesB 和乙醇酸还原酶基因中的一种或更多种由一种或更多种质粒表达。在一些实施方案中，所述pct、phaA、 thi 1、atoB、bktB、phaB、hbd、tesB和乙醇酸还原酶基因中的一种或更多种被整合到所述细胞的基因组中。在某些实施方案中，所述phaA、bktB和/或phaB基因是真养雷氏菌基因， 例如真养雷氏菌H16基因。在某些实施方案中，所述pet基因是埃氏巨球形菌基因，例如埃氏巨球形菌BE2-2083基因。在某些实施方案中，所述tesB基因是大肠杆菌基因，例如大肠杆菌K12基因。在一些实施方案中，所述编码乙醇酸还原酶的基因是假单胞菌属基因或酵母属基因。本发明的一些方面涉及由细胞培养物产生的DHBA，其中所述细胞培养物中的细胞已被基因修饰以重组表达(l)pct基因、(2)phaA、thil、atoB或I^ktB基因中至少之一和(3) PhaB或hbd基因中至少之一。在一些实施方案中，所述细胞还重组表达tesB基因和/或乙醇酸还原酶。在一些实施方案中，为所述细胞提供葡萄糖和/或乙醇酸。所述细胞可以是细菌细胞、真菌细胞(包括酵母细胞)、植物细胞、昆虫细胞或动物细胞。在一些实施方案中，所述细胞是细菌细胞，例如大肠杆菌细胞。在一些实施方案中，所述pct、phaA、thil、atoB、bktB、phaB、hbd、tesB 和乙醇酸还原酶基因中的一种或更多种由一种或更多种质粒表达。在一些实施方案中，所述pct、phaA、 thi 1、atoB、bktB、phaB、hbd、tesB和乙醇酸还原酶基因中的一种或更多种被整合到所述细胞的基因组中。在某些实施方案中，所述phaA、bktB和/或phaB基因是真养雷氏菌基因， 例如真养雷氏菌H16基因。在某些实施方案中，所述pet基因是埃氏巨球形菌基因，例如埃氏巨球形菌BE2-2083基因。在某些实施方案中，所述tesB基因是大肠杆菌基因，例如大肠杆菌K12基因。在一些实施方案中，所述编码乙醇酸还原酶的基因是假单胞菌属基因或酵母属基因。本发明的一些方面涉及由细胞培养物产生的3-HBL，其中所述细胞培养物中的细胞已被基因修饰以重组表达(l)pct基因、(2)phaA、thil、atoB或WitB基因中至少之一和 (3)phaB或hbd基因中至少之一。在一些实施方案中，所述细胞还重组表达tesB基因和/ 或乙醇酸还原酶。在一些实施方案中，为所述细胞提供葡萄糖和/或乙醇酸。所述细胞可以是细菌细胞、真菌细胞(包括酵母细胞)、植物细胞、昆虫细胞或动物细胞。在一些实施方案中，所述细胞是细菌细胞，例如大肠杆菌细胞。在一些实施方案中，所述pct、phaA、thil、atoB、bktB、phaB、hbd、tesB 和乙醇酸还原酶基因中的一种或更多种由一种或更多种质粒表达。在一些实施方案中，所述pct、phaA、 thi 1、atoB、bktB、phaB、hbd、tesB和乙醇酸还原酶基因中的一种或更多种被整合到所述细胞的基因组中。在某些实施方案中，所述phaA、bktB和/或phaB基因是真养雷氏菌基因， 例如真养雷氏菌H16基因。在某些实施方案中，所述pet基因是埃氏巨球形菌基因，例如埃氏巨球形菌BE2-2083基因。在某些实施方案中，所述tesB基因是大肠杆菌基因，例如大肠杆菌K12基因。在一些实施方案中，所述编码乙醇酸还原酶的基因是假单胞菌属基因或酵母属基因。在一些实施方案中，表达本文所述重组途径的细胞还表达recA和/或endA。在某些实施方案中，所述细胞是大肠杆菌MG1655(DE3)细胞。在一些实施方案中，对本文所述重组细胞的细胞培养物的上清液进行内酯化。本发明的一些方面涉及通过培养与发明相关的任意细胞而产生的细胞培养物。在一些实施方案中，所述细胞培养物包含至少200mg I^DHBA。在某些实施方案中，所述细胞培养物包含至少IgL4DHBA。在一些实施方案中，所述细胞培养物包含至少IOmg Ll-HBL。 在某些实施方案中，所述细胞培养物包含至少IOOmg L—1或至少500mg L—j-HBL。本发明的一些方面涉及通过培养与发明相关的任意细胞而产生的细胞培养物的上清液。在一些实施方案中，所述上清液包含至少ZOOmgl^DHBA。在某些实施方案中，所述上清液包含至少Ig I^DHBA。在一些实施方案中，所述上清液包含至少IOmg Ll-HBL。在某些实施方案中，所述上清液包含至少IOOmg L—1或至少500mg L—j-HBL。在一些实施方案中，对所述上清液进行内酯化。在某些实施方案中，内酯化是通过酸化以降低所述上清液的 PH来实现的。在一些实施方案中，内酯化是通过DHBA-CoA的自身内酯化来实现的。
附图不是旨在按比例绘制的。在附图中，各个图中示例的每个相同或几乎相同的要素以相似的数字表示。为清楚起见，并非每一个要素都可标记在每一附图中。在附图中图1是描述3-羟基链烷酸途径的示意图。pet的存在产生与乙酰CoA缩合反应中使用的酰基CoA分子。图2是描述对本文所用的3-羟基链烷酸途径进行改动以用于合成DHBA的示意图。图3是描述通过表达tesB、pet,3种乙酰乙酰-CoA硫解酶(thil、bktB或phaA) 之一以及两种3-羟基丁酰基-CoA还原酶(phaB或IAd)之一的重组大肠杆菌来生产3HV 的图。图4描述3HV甲酯的HPLC谱。图4A代表含有两种立体异构体(洗脱时间为6. 9 和9. 2分钟)的外消旋3HV标准品；图4B是来自表达ptb-buk、phaB和I^ktB的大肠杆菌的培养基，出峰时间为6. 9分钟；图4C是来自表达ptb-buk、tibd、bktB和tesB的大肠杆菌的培养基，出峰时间为9. 2分钟。与pet相似，所述ptb-buk操纵子编码丙酮丁醇梭菌 (Clostridium acetobutylicum)的 舞酸丁酉先转移Bl (phosphotransbutyrase,ptb)禾口丁酉先激酶(butyrokinase，buk)，其作用是由丙酸产生高水平的丙酰CoA。所有样品在HPLC分析之前在酸性甲醇中煮沸以形成3HV甲酯。使用与该手性HPLC分析方案相同的方案进行的手性3HB实验强烈表明6. 9分钟和9. 2分钟的峰分别代表(R)_3HV和(S)_3HV。图5描述表达不同3-羟基链烷酸途径基因的重组大肠杆菌MG1655(DE3) endA_recA_*DHBA(左栏)和3-HBL(右栏)的产量。每个途径中所用的具体基因以X轴表不。图6是显示证明重组大肠杆菌所产生的DHBA产量的液相色谱一质谱(LC/MS)谱图的图。“A”线表示DHBA标准品，而“B”线是表达phaA、phaB、pCt和tesB的重组大肠杆菌所产生的DHBA。“C”线是阴性对照。MS信号是m/z = 138的离子曲线，其表示质子化DHBA 的铵加合物。图7是显示证明重组大肠杆菌所产生的3-HBL产量的液相色谱一质谱(LC/MS)谱图的图。“A”线表示3-HBL+DHBA标准品，而“B”线是在乙醇酸和葡萄糖存在下表达phaA、 phaB、pet和tesB的重组大肠杆菌培养物所产生的3-HBL。“C”线是阴性对照。MS信号是 m/z = 120的离子曲线。图8描述在存在或不存在tesB的情形下表达不同3_羟基链烷酸途径基因的重组大肠杆菌MG1655 (DE3) endA>ecA"中DHBA (左栏)和3-HBL (右栏)的产量。每个途径中所用的具体基因显示在X轴上。图9描述在tesB和pet存在下表达不同3_羟基链烷酸途径基因的重组大肠杆菌 MG1655 (DE3) endA—recA—中DHBA (左栏)和3-HBL (右栏)的产量。右侧三个样品表示当用酸处理左侧三个样品时所达到的产物滴度。每个途径中所用的具体的乙酰乙酰CoA硫解酶和3-羟基丁酰CoA还原酶显示在X轴上。图10描述96小时后表达bktB、phaB、pet和tesB的重组大肠杆菌MG1655 (DE3) 中3-羟基链烷酸途径的产量谱。显示了 11种独立培养物所消耗的葡萄糖和乙醇酸的平均水平以及醋酸、3HB、DHBA和3-HBL的平均水平，误差线表示标准差。图11描述96小时后表达bktB、phaB、pet和tesB的重组大肠杆菌MG1655 (DE3) 的最高产培养物中DHBA(左栏)和3-HBL(右栏)的产量。对该培养物进行过夜酸处理以催化内酯化，所得DHBA和3-HBL水平显示在该图右侧。图12描述由葡萄糖和乙醇酸生产DHBA和3-HBL的3_羟基链烷酸途径方案，标出了 DHBA-CoA的分支点。随着重组tesB的表达，该途径产生的DHBA比3-HBL多(图8)，然而，在无tesB的情形下，产生更多的3-HBL，几乎不产生DHBA，这表明DHBA-CoA可在体内自
8身内酯化为3-HBL。在此，所述途径以I^ktB和phaB表示乙酰乙酰CoA硫解酶和3-羟基丁酰基CoA还原酶，因为显示这对基因产生的DHBA和3-HBL水平最高(图5)。图13描述含有pet (右栏，pct-tesB)和没有pet (左栏，tesB)的大肠杆菌 MG1655(DE3)recA-endA-中3-羟基链烷酸途径48小时后的醋酸产量。无pet的实验是一式三份进行的，而那些含有Pct的实验代表单次试验。
具体实施例方式之前用于合成DHBA和3-HBL的方法依赖于原始的苛性的化学合成方法，而生物生产DHBA和3-HBL尚未被认为是一种选择。事实上，尽管能源部的最近报告已将3-HBL列入来自生物质的十大增值化学品中(Werpy和Petersen，2004)，但是这份报告还声称用于 3-HBL合成的生物途径是“不太可行”的，而提倡开发更好的3-HBL化学合成方法。本文描述了可以通过涉及细胞中重组基因表达的生物学方法来产生DHBA和3-HBL这一出乎意料的发现。本发明的方法和组合物涉及在重组表达一种或多种基因(包括pct、phaA、thil、 atoB、bktB、phaB、Sl、hbc^ntesB)的细胞中生产DHBA和3-HBL。该系统代表了生产具有广泛应用的DHBA和3-HBL分子的一种高效的新方法。本发明的应用不限于其在下文说明书所述或附图所举例说明的对要素的组织和安排的细节上。本发明能够用于其它实施方案并且可以多种方式实施或进行。此外，本文所用的短语和术语是用于描述的目的，而不应被视为限定。本文所用的“包括”、“包含”或 “具有”、“含有”、“涉及”及其变化形式旨在包括下文列举的项目及其等同物以及其它项目。3-羟基链烷酸途径本文所述的方法和组合物应用3-羟基链烷酸途径从糖及糖衍生底物合成3-羟基酸(例如3-羟基丁内酯(3-HBL)和/或其水解形式3，4_ 二羟基丁酸(DHBA))。本文所用的“羟基酸”指同时含有羧基和羟基部分的化合物。图1代表3-羟基链烷酸途径的示意图。在与本发明相关的方法和组合物中，使用一种或更多种乙酰乙酰CoA硫解酶(例如thil、bktB、phaA或atoB)来进行缩合反应，以得到3-酮脂酰CoA中间体，其随后通过phaB或hbd进行还原而得到3-羟基酰基CoA化合物。任选地，可以通过tesB将CoA部分从3-羟基酰基CoA化合物上水解下来，释放出游离的3-羟基酸。可用作该途径底物的短链酰基CoA化合物是大肠杆菌中不易获得的代谢物。为了回避这一点，使用具有广泛底物特异性的酶即丙酰CoA转移酶(pet)来在短链有机酸之间替换CoA部分。在本文所述的方法和组合物中，使用pet来将CoA从酰基CoA上转移至到提供给所述细胞的底物(例如酸)上，形成该途径所用的酰基CoA。在一些实施方案中，使用磷酸丁酰转移酶(Ptb)基因和丁酰激酶(buk)基因而不是pet来制备丙酰CoA。在一些实施方案中，所述底物是丙酸，并且所述途径产生的产物是3-羟基戊酸 (3HV)。在另一些实施方案中，所述底物是乙醇酸并且所述途径产生的产物是3-HBL和/或 DHBA。应该理解，其它底物也可以与本发明的一些方面相容，对于本领域普通技术人员而言显而易见的是，可以同时使用一种以上的底物。在一些实施方案中，还提供了葡萄糖。在一些实施方案中，在表达bktB-phaB、phaA-phaB、bktB-hbd或thil-phaB的培养物中产生3HV 禾口 / 或 DHBA 禾口 / 或 3—HBL。
本发明的一些方面涉及编码所述3-羟基链烷酸途径中一种或更多种酶的一种或多种基因的重组表达。与此途径相关的酶包括硫解酶(由thil、bktB、phaA或atoB编码) 和还原酶(phaB、hbd或Si)。本发明的一些方面还涉及丙酰CoA转移酶(由pet编码)和硫酯酶B(由tesB编码)的重组表达。在一些实施方案中，与本发明相关的细胞还重组表达编码乙醇酸还原酶的基因。根据本发明的一些方面，提供了重组表达与本发明相关的一种或更多种基因的细胞以及所述细胞在生产DHBA和3-HBL中的用途。应当理解，与本发明相关的基因可以从多种来源获得。在一些实施方案中，所述phaA、phaB和WctB基因是从真氧雷氏菌菌株(例如真氧雷氏菌H16)获得的，所述tesB基因是从大肠杆菌菌株(例如大肠杆菌KU)获得的， 所述pet基因是从埃氏巨球形菌菌株(例如埃氏巨球形菌BE2-208;3)获得的，所述atoB基因是从恶臭假单胞菌(P.putida)菌株(例如恶臭假单胞菌KTM40)获得的，所述hbd和 thil基因是从丙酮丁醇梭菌菌株(例如丙酮丁醇梭菌824)获得的，以及所述Sl基因是从木兰假丝酵母(C. magnolia)菌株获得的。在其中表达ptb和buk而不是pet的一些实施方案中，所述Ptb和buk基因在一个操纵子中共表达。在一些实施方案中，所述ptb-buk操纵子是从丙酮丁醇梭菌获得的。在一些实施方案中，所述PhaA基因的序列以GenBank登录号P14611表示(Peoples and Sinskey，1989)，所述phaB基因的序列以GenBank登录号 P14697表示(Peoples and Sinskey，1989)，所述tesB基因的序列以GenBank登录号P23911 或ABC97996表示(Naggert等，1991)，以及所述pet基因的序列以SEQ ID NO 9所述的序列表示(Taguchi等，2008)。在一些实施方案中，所述ptb基因的序列以GenBank登录号 AAK81016表示。在一些实施方案中，所述buk基因的序列以GenBank登录号AAK81015表示。应当理解的是，可对本文所述的任意核酸和/或多肽进行密码子优化，并且以密码子优化的形式重组表达。本领域普通技术人员会了解，这些酶的同源基因可从其它物种获得并可通过同源性检索来识别，例如，通过蛋白质BLAST检索，可在国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI) 5 ^^ (ncbi. nlm. nih. gov) ±· |。 可由来自包含给定基因的任何DNA来源的DNA对与发明相关的基因进行PCR扩增。在一些实施方案中，与本发明相关的基因是合成的。获得编码与本发明相关的酶的基因的任何方法均与本发明相容。因此，本发明涉及编码上文所述酶的基因的重组表达、前述功能修饰和变体，以及与之相关的用途。与本发明相关的核酸的同源性和等位基因可通过常规技术鉴定。本发明还包括在严格条件下与本文所述核酸杂交的核酸。本文所用的术语“严格条件”指本领域熟悉的参数。核酸杂交参数可见于汇编这些方法的参考书，例如Molecular Cloning ALaboratory Manual, J. Sambrook 等编，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989),或者 Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel等编，John Wiley & Sons，Inc. , New York。更具体而言，本文所用的严格条件指例如在65 °C于杂交缓冲液(3. 5XSSC、0. 02 % FicolUO. 02 %聚乙烯吡咯烷酮、 0. 02% 牛血清白蛋白、2. 5mM NaH2PO4(pH7)、0. 5 % SDS、2mM EDTA)中杂交。SSC 是 0. 15M 氯化钠/0.015M柠檬酸钠(PH7) ；SDS是十二烷基硫酸钠，EDTA是乙二胺四乙酸。杂交后， 清洗转移DNA所用的膜，例如在室温下在2 X SSC中清洗，然后在高至68°C的温度下清洗0. 1-0. 5XSSC/0. IXSDSo可使用达到相似程度严格性的其它条件、试剂等。本领域技术人员熟悉这样的条件，因此没有在此给出这些条件。然而，应该理解的是，本领域技术人员将能够以允许明确鉴定本发明核酸的同源性和等位基因(例如通过使用较不严格的条件)的方式操纵所述条件。技术人员也熟悉筛选用于表达这些分子的细胞和文库的方法，随后将所述分子进行常规分离，然后分离出相关的核酸分子并测序。一般而言，同源性和等位基因通常与核酸和多肽序列分别具有至少75%核苷酸同一性和/或至少90%氨基酸同一性，在一些情形下，将具有至少90%核苷酸同一性和/或至少95%氨基酸同一性，在另一些实施方案中，将具有至少95%核苷酸同一性和/或至少 99%氨基酸同一性。同源性可利用NCBI (Bethesda，Maryland)开发的多种公众可获得的软件工具(其可从NCBI互联网网站上获得)来计算。示例性的工具包括BLAST软件，其也可从 NCBI 互联网网站(www.ncbi.nlm.nih.gov)获得。成对(pairwise)比对和 ClustalW 比对(BL0SUM30矩阵设置)以及Kyte-Doolittle假设分析可利用MacVector序列分析软件 (Oxford Molecular Group)获得。前述核酸的Watson-Crick互补序列也包括在本发明内。本发明还包括简并核酸，其包括存在于天然物质中的那些密码子的替代密码子。 例如，丝氨酸残基由密码子TCA、AGT、TCC、TCG、TCT和AGC所编码。就编码丝氨酸残基的目的而言，所述六个密码子中每一个都是等同的。因此，对于本领域普通技术人员而言显而易见的是，任何编码丝氨酸的核苷酸三联体均可用于在体外或体内指导蛋白质合成体系将丝氨酸残基引入到正在延长的多肽中。同样，编码其它氨基酸残基的核苷酸序列三联体包括但不仅限于CCA、CCC、CCG和CCT (脯氨酸密码子)；CGA、CGC、CGG、CGT、AGA和AGG (精氨酸密码子)；ACA、ACC、ACG和ACT (苏氨酸密码子)；AAC和AAT (天冬酰胺密码子)；以及ΑΤΑ、 ATC和ATT(异亮氨酸密码子)。其它氨基酸残基可同样由多个核苷酸序列编码。因此，本发明包括其密码子序列由于遗传密码的简并性而与生物分离的核酸不同的简并核酸。本发明还包括密码子优化，以适应宿主细胞的最佳密码子使用。本发明还提供了经修饰的核酸分子，其包括添加、替换和缺失一个或更多个核苷酸。在一些优选的实施方案中，这些经修饰的核酸分子和/或它们编码的多肽保留了未修饰核酸分子和/或多肽的至少一种活性或功能，例如酶活性。在某些实施方案中，经修饰的核酸分子编码经修饰的多肽，优选具有如本文其它地方所述保守氨基酸替换的多肽。经修饰的核酸分子的结构与未经修饰的核酸分子相关，并且在一些优选的实施方案中，其与未经修饰核酸分子的结构相关性足以使所述经修饰和未经修饰的核酸分子在本领域技术人员已知的严格条件下杂交。例如，可制备编码具有单个氨基酸改变的多肽的经修饰核酸分子。这些核酸分子中的每一个均可具有一个、两个或三个核苷酸替换，但它们不是对应于本文所述的遗传密码简并性的核苷酸改变。同样，可制备编码具有两个氨基酸改变(具有例如2-6个核苷酸改变)的多肽的经修饰核酸分子。本领域技术人员将容易想到多种经修饰的核酸分子(例如这些核酸分子)，包括例如编码2位和3位、2位和4位、2位和5位、2位和6位等的密码子中的核苷酸替换。在前文所述的实例中，每种两氨基酸组合均色括在经修饰核酸分子的组中以及编码氨基酸替换的所有核苷酸替换中。还可制备编码具有其它替换(即3各或更多个)、添加或缺失(例如通过引入终止密码或剪接位点)的多肽的其它核酸分子，并且其包括在本发明中，因为本领域普通技术人员容易想到。可通过常规实验测试前述任何核酸或多肽对与本文所述核酸和/或多肽的结构关系或活性的保留。本发明包括多肽的变体。本文所用的多肽“变体”是包含对所述多肽原始氨基酸序列进行的一个或更多个修饰的多肽。可对多肽进行产生变体的修饰，以1)降低或消除多肽的活性；幻增强多肽的特性；3)为多肽提供新的活性或特性，例如添加抗原表位或添加可检测部分；或者4)提供相等或更好的分子(例如酶底物)间结合。对多肽的修饰通常是对编码所述多肽的核酸进行的，并且可包括缺失、点突变、截短，氨基酸替换和添加氨基酸或非氨基酸部分。或者，修饰可直接对多肽进行，例如通过切割、添加连接分子、添加可检测部分(如生物素)、添加脂肪酸等来进行。修饰还包括包含全部或部分氨基酸序列的融合蛋白。本领域技术人员将熟悉用于预测蛋白质序列变化对蛋白质构象的影响的方法，并因此可根据已知方法“设计”多肽变体。Dahiyat和Mayo在kience 278 =82-87,1997中描述了这种方法的一个实例，从而可从头进行蛋白质设计。所述方法可应用于已知的蛋白质，以改变多肽序列的仅仅一部分。通过应用Dahiyat和Mayo的计算方法，可提出多肽的特定变体并进行测试，以确定所述变体是否保留了所期望的构象。通常，变体包括这样的多肽，其被特定修饰以改变与其所期望生理活性无关的多肽特征。例如，半胱氨酸残基可被替换或缺失，以防止不想要的二硫键连接。同样，可通过消除表达系统中蛋白酶引起的蛋白质水解来改变某些氨基酸以增强多肽表达(例如存在 KEX2蛋白酶活性的酵母表达系统中的二碱基的氨基酸残基)。编码多肽的核酸的突变优选保留所述编码序列的氨基酸读码框，并且优选不在核酸中产生可能杂交形成二级结构的区域，例如可影响变体多肽表达的发夹或环。可通过选择氨基酸替换或者通过在编码多肽的核酸位点上进行随机诱变来进行突变。然后表达变体多肽并测定一种或更多种活性，以确定哪个突变为变体多肽提供所期望的特性。可对变体(或非变体多肽)进行进一步的突变，其对多肽的氨基酸序列是沉默的，但是为在特定宿主中的翻译提供优选的密码子。用于例如在大肠杆菌中翻译核酸的优选密码子是本领域普通技术人员众所周知的。还可对基因或cDNA克隆的非编码序列进行其它突变，以增强多肽的表达。可通过以下步骤测定变体多肽的活性将编码变体多肽的基因克隆到细菌或哺乳动物表达载体中，将所述载体引入合适的宿主细胞中，表达所述变体多肽，以及检测本文所公开多肽的功能。技术人员还将认识到，可在多肽中进行保守氨基酸替换来提供上述多肽的功能等同变体，即保留了所述多肽功能的变体。本文所用的“保守氨基酸替换”指不改变其中进行了氨基酸替换的蛋白质的相对电荷或大小特征的氨基酸替换。可根据本领域普通技术人员已知的用于改变多肽序列的方法来制备变体，例如见于汇编这些方法的参考书中的方法，例如 Molecular Cloning :A Laboratory Manual, J. Sambrook 等编，第二版，Cold Spring Harbor Lab oratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989),或者 Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel 等编，John Wiley & Sons, Inc. , New York。多肽的示例性功能等同变体包括本文所公开蛋白质的氨基酸序列中的保守氨基酸替换。氨基酸的保守替换包括在下述组内的氨基酸间进行的替换(a)M、I、L、V ； (b)F、Y、W ； (c) K、R、H ； (d) A、G ； (e) S、T ； (f) Q、N ；以及(g) E、D。通常，当制备变体多肽时，优选少于所有的氨基酸发生改变。当已知特定氨基酸残基能赋予功能时，这样的氨基酸将不被替换，或者，这样的氨基酸将被保守氨基酸替换所替代。优选地，当制备变体多肽时，可改变1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20个残基。进行最少数量的替换通常是优选的。因此，产生变体多肽的一种方法是用特定的单个氨基酸替换所有其它氨基酸，然后分析变体的活性，然后用一种或更多种具有所述最佳活性的多肽重复所述过程。为了产生功能等同的多肽变体，通常通过改变编码所述多肽的核酸来对多肽的氨基酸序列进行保守氨基酸替换。这样的替换可通过本领域普通技术人员已知的多种方法来进行。例如，氨基酸替换可根据Kunkel的方法通过PCR定向突变、定点诱变(Kunkel，ProC. Nat. Acad. Sci. U. S. Α. 82 =488-492,1985)或者通过化学合成编码多肽的基因来进行。本发明包括重组表达与发明相关的基因的任何类型细胞，包括原核和真核细胞。 在一些实施方案中，所述细胞是细菌细胞，例如埃希氏菌属(Escherichia spp.)、链霉菌属 (Streptomyces spp·)、发酵单胞菌属(Zymonas spp·)、醋酸杆菌属(Acetobacter spp·)、 枸橼酸杆菌属(Citrobacter spp·)、集胞蓝细菌属(Synechocystis spp·)、根瘤菌属 (Rhizobium spp.)、梭状芽抱杆菌属(Clostridium spp·)、棒状杆菌属(Corynebacterium spp·)、链球菌属(Streptococcus spp·)、黄单胞菌属(Xanthomonas spp·)、乳酸杆菌属 (Lactobacillus spp·)、乳球菌属(Lactococcus spp·)、芽抱杆菌属(Bacillus spp.)、产碱菌属(Alcaligenes spp·)、假单胞菌属(Pseudomonas spp·)、气单孢菌属(Aeromonas spp·)、固氮菌属(Azotobacter spp·)、丛毛单胞菌属(Comamonas spp·)、分枝杆菌属 (Mycobacterium spp.)、红球菌属(Rhodococcus spp.)、葡萄杆菌属(Gluconobacter spp.) /T^MMMM (Ralstonia spp.) WMf\-MM (Acidithiobacillus spp.)、/]、 月菌属(Microlunatus spp.)、地杆菌属(Geobacter spp·)、地芽孢杆菌属(Geobacillus spp·)、节杆菌属(Arthrobacter spp·)、黄杆菌属(Flavobacterium spp.)、沙雷菌属 (Serratia spp. ) > H^ife lifM (Saccharopolyspora spp. ) > lifM (Thermus spp·)、 寡养单胞菌属(Stenotrophomonas spp.)、色杆菌属(Chromobacterium spp.)、中华 t艮瘤菌属(Sinorhizobium spp. )、H 多 包菌属(Saccharopolyspora spp. ) > /fe If lif M (Agrobacterium spp.)和泛菌属(Pantoea spp)。所述细菌细胞可以是革兰氏阴性细胞，例如大肠埃希氏菌(大肠杆菌)细胞，或者是革兰氏阳性细胞，例如芽孢杆菌属菌株的细胞。 在其它实施方案中，所述细胞是真菌细胞，例如酵母细胞，例如酵母菌属(Saccharomyces spp.)、裂殖酵母菌属(Schizosaccharomyces spp.)、毕赤酵母属(Pichia spp.)、法夫酵母属(Paffia spp.)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces spp.)、念珠菌属(Candida spp·)、 蓝状菌属(Talaromyces spp.)、酒香酵母菌属(Brettanomyces spp.)、管囊酵母菌属 (Pachysolen spp.)、德巴利氏酵母菌属(Debaryomyces spp.)、耳口氏酵母菌属(Yarrowia spp.)和工业多倍体酵母菌株。优选地，所述酵母菌株是酿酒酵母(S. cerevisiae)菌株。 真菌的其它实例包括曲霉属(Aspergillus spp.)、青霉属(Pennicilium spp.)、镰刀菌属(Fusarium spp·)、根霉属(Rhizopus spp·)、顶抱霉属(Acremonium spp·)、脉抱菌属 (Neurospora spp.)、类壳属(Sordaria spp.)、巨座壳属(Magnaporthe spp.)、异水霉属 (Allomyces spp·)、黑粉菌属(Ustilago spp·)、灰霉病菌属(Botrytis spp.)禾口木霉属 (Trichoderma spp.)。在另一些实施方案中，所述细胞是藻类细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。应当理解，与本发明相容的一些细胞可表达与本发明相关的一个或更多个基因的内源性拷贝以及重组拷贝。在一些实施方案中，如果细胞具有与本发明相关的一个或更多个基因的内源性拷贝时，那么所述方法将不必需要添加内源性表达的所述基因的重组拷贝。在一些实施方案中，所述细胞可内源性表达来自本文所述途径的一种或更多种酶，并且可重组表达来自本文所述途径的一种或更多种其它酶，用于高效生产DHBA和/或3-HBL。
在一些实施方案中，与发明相关的一种或多种基因在重组表达载体中表达。本文所用的“载体”可以是多种核酸中的任何一种可通过限制性处理和连接向其中插入所期望的一个或更多个序列，用于在不同遗传环境中传送或用于在宿主细胞中表达。载体通常由 DNA组成，尽管也可以使用RNA载体。载体包括但不限于质粒、粘粒、噬菌粒、病毒基因组和人工染色体。 克隆载体是能够自主复制或被整合到宿主细胞基因组中的载体，并且其特征还在于一个或更多个内切核酸酶限制性位点，所述载体可在此处以确定的方式切割并且可将所期望的DNA序列连接到其中，从而新的重组载体保留其在宿主细胞中复制的能力。在质粒的情形下，在宿主通过有丝分裂进行复制之前，随着质粒拷贝数的增加，所期望的序列可在宿主细胞(例如宿主细菌)中进行多次复制，或者在每个宿主中在宿主通过有丝分裂增殖之前仅复制一次。在噬菌体的情形下，可在溶胞期间进行主动复制，或者在溶源期间进行被动复制。表达载体是这样的载体，可通过限制性处理和连接向其中插入所期望的DNA序列，使得其可操作地与调控序列相连并且可表达为RNA转录产物。载体可还包含一个或更多个标记序列，所述标记序列适于鉴定已被或未被所述载体转化或转染的细胞。标记包括例如编码增强或降低对抗生素或其它化合物的抗性或敏感性的蛋白质的基因、编码其活性可通过本领域中已知的标准方法进行检测的酶(例如半乳糖苷酶、萤光素酶或碱性磷酸酶)的基因以及以可见方式影响所转化或转染细胞、宿主、集落或噬菌斑的表型的基因 (例如绿色荧光蛋白)。优选的载体是能自主复制和表达与其可操作地连接的DNA片段中的结构基因产物的那些载体。当本文所用的编码序列与调控序列以在所述调控序列的影响或控制下进行所述编码序列的表达或转录的方式通过共价键相连时，它们被认为是“可操作地”相连。如果期望将所述编码序列翻译成为功能蛋白，并且如果诱导所述5’调控序列中的启动子导致所述编码序列的转录，并且如果所述两个DNA序列间连接的性质⑴不导致引入移码突变，(2) 不干扰所述启动子区指导所述编码序列进行转录的能力，并且C3)不干扰相应RNA转录产物被翻译成蛋白质的能力，则两个DNA序列被认为是可操作地相连。因此，如果启动子区能实现所述DNA序列的转录而使所得转录产物可被翻译成所期望的蛋白质或多肽时，则所述启动子区域将可操作地与编码序列相连。当编码要求保护的本发明的任何酶的核酸分子在细胞中表达时，多种转录调控序列(例如启动子/增强子序列)可用于指导其表达。所述启动子可以是天然启动子，即内源性环境中基因的启动子，其提供正常的基因表达调控。在一些实施方案中，所述启动子可以是组成型的，即所述启动子是不受调控的，从而允许其相关基因持续转录。也可使用多种条件型启动子，例如通过存在或不存在分子来控制的启动子。基因表达所需的调控序列的精确性质可因种属或细胞类型而不同，但是必要时通常应包括分别涉及转录和翻译的起始的5’非转录和5’非翻译序列，例如TATA框、加帽序
14列、CAAT序列等。特别地，这样的5’非转录调控序列将包括启动子区，其包括用于所述可操作连接的基因的转录调控的启动子序列。必要时，调控序列还可包括增强子序列或上游激活子序列。本发明的载体可任选地包括5’前导序列或信号序列。对合适载体的选择和设计在本领域普通技术人员的能力和判断力的范围内。包含所有表达必需要素的表达载体可商购得到并且是本领域技术人员公知的。 参见例如 Sambrook 等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 通过将异源DNA (RNA)引入到细胞中而对所述细胞进行基因工程操作。该异源DNA(RNA)被置于转录元件的可操作控制下，以允许所述异源DNA在宿主细胞中表达。为了生产DHBA和3-HBL，在实施例部分中利用大肠杆菌证明了与本发明相关的基因的异源表达。用于生产DHBA和3-HBL的新方法也可在其它细菌细胞、古细菌细胞、真菌(包括酵母细胞)、哺乳动物细胞、植物细胞等中表达。可利用本领域中标准的方法和技术将编码要求保护的本发明之酶的核酸分子引入到一种或更多种细胞中。例如，可通过标准方案例如转化(包括化学转化)和电穿孔、转导、粒子轰击等引入核酸分子。也可通过将所述核酸分子整合到基因组中来表达编码要求保护的本发明之酶的核酸分子。在一些实施方案中，与本发明相关的一个或更多个基因在细菌细胞中重组表达。 可以在任何类型(丰富或基本)和任何组成的培养基中培养本发明的细菌细胞。本领域普通技术人员会理解，常规优化将允许使用多种类型的培养基。所选培养基可以补充有多种其它组分。补充成分的一些非限制性实例包括葡萄糖、抗生素、用于基因诱导的IPTG、ATCC 微量矿物质补充剂、葡萄糖、乙醇酸和丙酸。同样，可通过常规实验对本发明细胞的培养基和生长条件的其他方面进行优化。例如，PH和温度是可被优化的因素的非限制性实例。在一些实施方案中，因素例如培养基、培养基补充剂和温度的选择可影响3-羟基酸(例如DHBA 和/或3-HBL)的生产水平。在一些实施方案中，可优化补充组分的浓度和量。在一些实施方案中，对在收获DHBA和/或3-HBL之前按何种频率给培养基补充一种或更多种补充组分以及培养基的培养时间进行了优化。在一些实施方案中，与发明相关的用于生产DHBA和3-HBL的方法可通过引入乙醇酸还原酶基因来修饰，以便仅仅利用葡萄糖而不是葡萄糖和乙醇酸。该基因(存在于多种生物体例如假单孢菌O3Seudomonas)和酵母菌(Saccharomyces)中)还原乙醇酸，乙醇酸可通过柠檬酸循环将葡萄糖变为乙醇酸来产生，用于合成DHBA和3-HBL。根据本发明的一些方面，高滴度的3HV、DHBA和/或3-HBL是通过在细胞中重组表达与发明相关的基因而产生的。本文所用的“高滴度”指毫克/升(mg Γ1)级别的滴度。 给定产物所产生的滴度将受到多个因素(包括对培养基的选择)的影响。在一些实施方案中，3HV的滴度为至少IOOmg L—1。例如，所述滴度可以为至少约 100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850mg L—1 或 850mg Γ1以上。如实施例部分所证明的，在一些实施方案中，在表达WitB-phaB的培养物中，3HV 滴度为约537mg L—1，在表达phaA-phaB的培养物中，3HV的滴度为约H^iig L—1，以及在表达 bktB-hbd的培养物中，3HV的滴度为约δ〗^^!/1。不希望被任何理论约束，含有I^ktB的途径产生高3HV滴度这一观察结果与I^ktB对C3底物与C2缩合形成C5产物具有高活性的报告一致(Slater等，1998)。在一些实施方案中，表达phaB的3-羟基链烷酸途径产生的3HV的立体异构体与表达hbd的途径不同。在一些实施方案中，所述phaB途径产生(R)_3HV，所述hbd途径产生(S)_3HV。在一些实施方案中，基本培养基中DHBA的滴度为至少25mg L—1。例如，所述滴度可以为至少约 25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300mg Γ1 或300mg Γ1 以上。 在一些实施方案中，丰富培养基中产生的DHBA滴度为至少200mg L—1。例如，所述滴度可以为至少约 200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、 625,650,675,700,750,775,800mgr1 或 900mg L-1 或者 1,1. 5、2、2· 5、3、3· 5、4、4. 5、5g L-1 或5g Γ1以上。在一些实施方案中，基本培养基中产生的3-HBL滴度为至少lmgL—1。例如， 所述滴度可以为至少约 l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50mg 厂1 或 50mg Γ1以上。在一些实施方案中，丰富培养基产生的3-HBL滴度为至少IOmg L—1。例如，所述滴度可以为至少约 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、 190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、350、400、450、500、550、600、650、 700、750、800、850 或 900mg Γ1，或者 1、1. 5、2、2. 5、3、3. 5、4、4. 5、5g Γ1 或 5g Γ1 以上。如实施例部分所证明的，表达l^ktB-phaB的培养物所产生的DHBA和3-HBL的滴度分别为约573士30mg Γ1和178±%ig Γ1，表达phaA-phaB的培养物所产生的DHBA和3-HBL 的滴度分别为约492士 19mg L—1和107士;3mg L—1，以及表达thil-phaB的培养物所产生的 DHBA和3-HBL的滴度分别为约247士57mg L—1和96士 14mg L—1。在一些实施方案中，表达 hbd的培养物只产生DHBA。在某些实施方案中，在表达l^ktB-hbd的培养物中，DHBA滴度为约 47士lOmgL4。可通过存在或不存在硫酯酶TesB来调节所述3_羟基链烷酸途径以产生更多的 DHBA或3-HBL。如实施例部分所证明的，tesB的重组表达导致产生的DHBA (对于l^ktB-phaB 途径组合而言，为约57;3mg Γ1)比3-HBL(约178mg Γ1)显著更多。在一些实施方案中，没有tesB表达时，产生的3-HBL (对于bktB-phaB而言，为约270mg Γ1)比DHBA (约21mg Γ1) 多。在某些实施方案中，WctB-phaB-pct的表达产生的3-HBL滴度为约270士;3mg L—1。不希望被任何理论约束，在不存在重组tesB的情形下形成的少量的DHBA可能是由于基因组 tesB的表达造成的，因为该基因是大肠杆菌本身具有的(Huisman等，1991)。内酯化可用于提高3-HBL的滴度。本文所用的内酯化指通过羟基对活化羰基的分子内进攻而形成内酯。来自产生DHBA比3-HBL多的培养物的上清液可被酸化(例如通过加入盐酸)来降低PH值。孵育这些上清液(例如在37°C过夜)使得可进行酸催化内酯化，导致3-HBL滴度提高。图12描述用于生产DHBA和3-HBL的3-羟基链烷酸途径方案， 在DHBA-CoA处标出分支点。在不存在tesB的情形下产生更多的3-HBL而几乎不产生DHBA 这一观察结果表明DHBA-CoA可在体内自身内酯化为3-HBL。在一些实施方案中，酸处理后培养物上清液的3-HBL滴度提高10%以上。在另一些实施方案中，酸处理后培养物上清液的3-HBL滴度提高100%以上。例如，3-HBL滴度可提高约 10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、100 %、110 %、120 %、130 %、 140 %,150 %,160 %,170 %,180 %,190 %,200 %,210 %,220 %,230 %,240 %,250 % 或 250%以上，包括任何中间值。在一些实施方案中，酸处理后的培养物上清液导致DHBA滴度降低 10% 以上。例如，DHBA 滴度可降低约 10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%, 85%、90%、95%或95%以上，包括任何中间值。
用于培养与本发明有关的细胞的液体培养基可盛放在本领域中已知和使用的任何培养容器中。在一些实施方案中，可使用在曝气反应器(例如搅拌罐反应器)中的大规模生产来产生大量的DHBA和/或3-HBL。本发明的一些方面包括优化细胞DHBA和/或3-HBL产生的策略。优化DHBA和/ 或3-HBL产生指进行优化策略之后DHBA和/或3-HBL的量比不实施此策略的高。优化策略之一是通过选择合适的启动子和核糖体结合位点来提高与发明相关的一个或更多个基因的表达水平。在一些实施方案中，这可包括对高拷贝数质粒或者低或中拷贝数质粒进行选择。在一些实施方案中，所述质粒是中拷贝数质粒，例如pETDuet。转录终止步骤也可通过引进或消除例如茎环的结构来进行靶向，以调控基因表达。在一些实施方案中，使用已优化DHBA和/或3-HBL生产的细胞可能是有利的。在一些实施方案中，对导致DHBA和/或3-HBL产量提高的突变的筛选可通过随机诱变筛选或通过已知筛选突变来进行。在某些实施方案中，基因组片段的鸟枪法克隆可用于鉴定导致 DHBA和/或3-HBL产量提高的基因组区域，所述鉴定通过对具有导致DHBA和/或3-HBL产量提高的这些片段的细胞或生物体进行筛选来进行。在某些情形下，一个或更多个突变可组合在同一细胞或有机体中。对生产DHBA和/或3-HBL的优化可包括优化对用于本文所述重组途径之表达的菌株的选择。在一些实施方案中，使用与野生型接近的菌株(意思是基本上未进行基因修饰的菌株)可导致DHBA和/或3-HBL的滴度提高。例如，在一些实施方案中，使用表达recA 和/或endA基因的菌株(例如大肠杆菌株MG1655 (DE3))导致DHBA和/或3-HBL的滴度提高(图10)。如实施例部分所证明的，在一些实施方案中，使用大肠杆菌MG1655(DE3)可导致 DHBA和 3-HBL 的滴度分别为 1. 99士0. 36g Γ1 和 0. 16士0. 04g Γ1，代表着相对MG1655 (DE3) recA^end A_而言DHBA的产量提高约3倍。在某些实施方案中，约3. 20g I^1DHBA和约0. 23g Γ1 3-HBL的滴度可利用大肠杆菌MG1655(DE3)获得。酸催化内酯化之后，DHBA的滴度可降低至约0. 42g L-1，而3-HBL的滴度可提高至约2. 17g L-1。通过本文所述重组途径产生的分子的立体化学可通过对3-羟基丁酰CoA还原酶进行选择来控制。在某些实施方案中，使用WiaB得到(R)-3-羟基酸，而使用Hbd则得到 (S)-立体异构体。在一些实施方案中，产生⑶-DHBA和/或(S)-3-HBL，而在另一些实施方案中，产生00-0冊4和/或0 )-3-! !^本发明所述的方法和组合物也可用于筛选这样的酶其与hbd相似、具有相似立体化学偏好但是用于生产(R)-DHBA和(R)-3-HBL的底物范围增加。在一些实施方案中，对蛋白质表达进行优化可能还需要在引入到细胞中之前对编码酶的基因进行修饰，例如通过对在细菌细胞中的表达进行密码子优化。不同生物体的密码子使用可见于密码子使用数据库(Codon Usage Database) (kazusa. or. jp/codon/)。在一些实施方案中，蛋白质工程可用于优化与本发明相关的一种或更多种酶的表达或活性。在某些实施方案中，蛋白质工程方法可包括确定酶的3D结构或者基于相关蛋白质的结构构建所述酶的3D同源模型。基于3D模型，可构建酶中的突变并将其引入到细胞或生物体中，然后可筛选产量提高的DHBA和/或3-HBL。在一些实施方案中，可通过操纵以与本发明相关酶相同途径起作用的酶来提高细胞中DHBA和/或3-HBL的产量。例如，在一些实施方案中，增加酶或作用于靶酶(例如与本发明相关的酶)上游的其它因子的表达可
17能是有利的。这可利用任何标准方法通过过表达上游因子来实现。本文所述的用于由糖及糖衍生底物生产3-羟基酸(例如3-HBL和DHBA)的方法和组合物具有广泛的应用。例如，3-HBL在制药工业中用来作为以下药物的构建块降胆固醇的他汀类，例如CRESTOM 和UWTOR ;抗生素，例如ZYBOX ;抗高血脂药物 EZETIMIBE (Lee 等，2008 ；Lee 和 Park，2009) ；HIV 抑制剂(Kim 等，1995)和营养补充剂肉碱(Wang 和 Hollingsworth，1999b)。实施例实施例1 在大肠杆菌中牛产羟基酸本文中，使用所述3HB途径来生产复杂的3-羟基酸，尤其是3HV、DHBA和3-HBL。 此外，详细研究了 DHBA向3-HBL的内酯化转化。这些产物是通过将非天然底物丙酸(用于生产3HV)或乙醇酸(用于生产DHBA和3-HBL)提供给所述3HB途径而制得的。这些非天然底物被丙酰CoA转移酶(pet)硫醇化而形成CoA硫酯，该CoA硫酯能够与乙酰CoA缩合而最终形成新的羟基酸产物。对于生产3HV而言，实现了 537mg L—1的(R)-3HB和52ang L—1 的(S) -3HV的滴度。对于生产DHBA而言，生产了 3. 2g L-1的DHBA以及230mg L-1的3-HBL。 所述DHBA/3-HBL产物谱可以通过下述两个途径之一向3-HBL偏移通过除去所述tesB基因并使DHBA-CoA自身内酯化，或者通过用酸处理富集DHBA的培养物上清液而使DHBA化学性地内酯化为3-HBL。除去所述tesB基因使3-HBL的产量平均提高52%。后一种方法即用酸使培养物上清液化学性地内酯化的方法产生420mg Γ1的DHBA和2. 17g Γ1的3-HBL， 将3-HBL的滴度提高了 9倍。羟基酸是多用途的手性化合物，其同时含有羧基和羟基部分，这允许它们容易地被修饰成几种有用的衍生物(Lee等，2002 ；Chen和■，200 ，并使其适用于合成抗生素 (Chiba 和 Nakai，1985)，β-和 Y-氨基酸和多肽(Park 等，2001 feebach 等，2001)的应用中，以及用作手性合成构建块(Lee等，2002)。已成功地证实了用羟基酸单体直接生物生产 3HB，并且已报道摇瓶和分批补料规模的滴度为3g L—1和12g !^(Gao等，2002)。在这些报道中，3HB是通过利用乙酰CoA乙酰转移酶(ptibA)、3_羟基丁酰CoA脱氢酶(ρΙΛΒ)、磷酸丁酰转移酶(Ptb)和丁酰激酶(buk)由乙酰CoA制得的(Liu* MeinbUchel，2000a ;Liu和 Steinbuchel, 2000b ；Gao等，200 。选用这些酶中的最后两种酶以除去3-羟基丁酰CoA的 CoA部分，得到游离3HB，所述两种酶来自丙酮丁醇梭菌，它们在该菌中参与由丁酰CoA生产丁酸(Liu和MeinbUchel，2000b)。最近，将来自大肠杆菌K12的硫酯酶II (tesB) (Naggert 等，1991)成功地用于直接水解3HB-CoA的酰基-硫酯(Liu等，2007 ；Tseng等，2009)。由两个乙酰CoA部分缩合而直接生产3HB的成功打开了通过将该途径推广用于利用酰基CoA分子与乙酰CoA缩合来生产结构更多样的羟基酸的可能性(图1)。在广义的 3HB途径(称为3-羟基链烷酸途径)中，三种乙酰乙酰CoA硫解酶(thilJktB或phaA)之一用于进行缩合反应得到3-酮脂酰CoA中间体，其随后被phaB或hbd还原得到3-羟基酰基CoA化合物。最后，使用tesB来将CoA部分从3-羟基酰基CoA上水解下来，释放出游离 3-羟基酸。这些步骤与本文所述的用于3HB生物合成的那些步骤相同。3-羟基链烷酸途径中另一个难点在于，与乙酰CoA不同，可用作该途径候选底物的短链酰基CoA是大肠杆菌中不易获得的代谢物。为避开这一点，使用了来自埃氏巨球形菌的广泛底物特异性酶(即丙酰CoA转移酶(pet)) Gctiweiger和Buckel，1984 Jaguchi等，2008)，其在短链有机酸间交换CoA部分。在所述3-羟基链烷酸途径中，使用pet将CoA由乙酰CoA转移到向提供给所述细胞的酸(例如丙酸)上，形成该途径所需的酰基CoA。表1总结了图1所示的3-羟基链烷酸途径中使用的每种酶的特征和来源。表1 图1所示3-羟基链烷酸途径中所用酶的一般特征和来源
权利要求
1.重组表达(l)pct基因、(2)phaA、thil、atoB或bktB基因中至少之一、以及(3)phaB 或hbd基因中至少之一的细胞。
2.权利要求1所述的细胞，其中所述细胞还重组表达tesB基因。
3.权利要求1或2所述的细胞，其中所述细胞还重组表达编码乙醇酸还原酶的基因。
4.权利要求1-3中任一项所述的细胞，其中所述细胞是细菌细胞、真菌细胞(包括酵母细胞)、植物细胞、昆虫细胞或动物细胞。
5.权利要求4所述的细胞，其中所述细胞是细菌细胞。
6.权利要求5所述的细胞，其中所述细菌细胞是大肠杆菌(Escherichiacoli)细胞。
7.权利要求1-6中任一项所述的细胞，其中所述pet、phaA、thil、atoB、bktB、phaB、 hbd, tesB和乙醇酸还原酶基因中的一种或更多种由一种或更多种质粒表达。
8.权利要求1-7中任一项所述的细胞，其中所述pet、phaA、thil、atoB、bktB、phaB、 hbd, tesB和乙醇酸还原酶基因中的一种或更多种被整合到该细胞的基因组中。
9.权利要求1-8中任一项所述的细胞，其中所述phaA、bktB和/或phaB基因是真养雷氏菌(Ralstonia eutropha)基因。
10.权利要求9所述的细胞，其中所述phaA、bktB和/或phaB基因是真养雷氏菌H16 基因。
11.权利要求1-10中任一项所述的细胞，其中所述PCt基因是埃氏巨球形菌 (Megasphaera elsdenii)―因。
12.权利要求11所述的细胞，其中所述pet基因是埃氏巨球形菌BE2-2083基因。
13.权利要求2-12中任一项所述的细胞，其中所述tesB基因是大肠杆菌基因。
14.权利要求13所述的细胞，其中所述tesB基因是大肠杆菌K12基因。
15.权利要求3-14中任一项所述的细胞，其中所述编码乙醇酸还原酶的基因是假单胞菌属(Pseudomonas)基因。
16.权利要求3-14中任一项所述的细胞，其中所述编码乙醇酸还原酶的基因是酵母属 (Saccharomyces)基因。
17.—种生产3，4_ 二羟基丁酸(DHBA)和/或3-羟基丁内酯(3-HBL)的方法，所述方法包括培养权利要求1-16中任一项的细胞来生产DHBA和/或3-HBL。
18.权利要求17所述的方法，还包括从所述细胞的培养物中回收所述DHBA和/或 3-HBL。
19.权利要求17或18所述的方法，其中在葡萄糖存在下培养所述细胞。
20.权利要求17-19中任一项所述的方法，其中所述细胞是在乙醇酸存在下培养的。
21.权利要求17-20中任一项所述的方法，其中在丙酸存在下培养所述细胞。
22.通过培养权利要求1-16中任一项所述细胞而产生的细胞培养物。
23.权利要求22所述的细胞培养物，其中所述细胞培养物色含至少200mgI^DHBA。
24.权利要求23所述的细胞培养物，其中所述细胞培养物包含至少IgI^DHBA。
25.权利要求22-24中任一项所述的细胞培养物，其中所述细胞培养物包含至少IOmg厂 j-HBL。
26.权利要求25所述的细胞培养物，其中所述细胞培养物包含至少IOOmgL—j-HBL。
27.权利要求沈所述的细胞培养物，其中所述细胞培养物包含至少500mgL-1S-HBL0
28.通过培养权利要求1-16中任一项所述细胞而产生的细胞培养物的上清液。
29.权利要求28所述的上清液，其中所述上清液包含至少ZOOmgl^DHBA。
30.权利要求四所述的上清液，其中所述上清液包含至少IgI^DHBA。
31.权利要求观-30中任一项所述的上清液，其中所述上清液包含至少IOmgLl-HBL。
32.权利要求31所述的上清液，其中所述上清液色含至少lOOmgL^-HBL。
33.权利要求32所述的上清液，其中所述上清液包含至少SOOmgL—i-HBL。
34.权利要求四-33中任一项所述的上清液，其中对所述上清液进行内酯化。
35.权利要求34所述的上清液，其中内酯化是通过酸化来降低所述上清液的pH而实现的。
36.权利要求34或35所述的上清液，其中内酯化是通过DHBA-CoA的自身内酯化实现的。
37.权利要求1-16中任一项所述的细胞，其中所述细胞表达recA和/或endA。
38.权利要求37所述的细胞，其中所述细胞是大肠杆菌MG1655(DE3)细胞。
39.用于生产具有提高的3，4-二羟基丁酸(DHBA)和/或3-羟基丁内酯(3-HBL)产生的细胞的方法，包括在所述细胞中重组表达(I)Pct基因、(2)phaAahil,atoB或WctB基因中至少之一和(3)phaB或hbd基因中至少之一。
40.权利要求39所述的方法，其中所述细胞还重组表达tesB基因。
41.权利要求39或40所述的方法，其中所述细胞还重组表达编码乙醇酸还原酶的基因。
42.权利要求39-41中任一项所述的方法，其中为所述细胞提供葡萄糖。
43.权利要求39-42中任一项所述的方法，其中为所述细胞提供乙醇酸。
44.权利要求39-43中任一项所述的方法，其中为所述细胞提供丙酸。
45.权利要求39-44中任一项所述的方法，其中所述细胞是细菌细胞、真菌细胞(包括酵母细胞)、植物细胞、昆虫细胞或动物细胞。
46.权利要求45所述的方法，其中所述细胞是细菌细胞。
47.权利要求46所述的方法，其中所述细菌细胞是大肠杆菌细胞。
48.权利要求46或47所述的方法，其中所述细胞表达recA和/或endA。
49.权利要求48所述的方法，其中所述细胞是大肠杆菌MG1655(DE3)细胞。
50.权利要求39-49中任一项所述的方法，其中所述pct、phaA、thil、atoB、bktB、phaB、 hbd.tesB和乙醇酸还原酶基因中的一种或更多种由一种或更多种质粒表达。
51.权利要求39-50中任一项所述的方法，其中所述pct、phaA、thil、atoB、bktB、phaB、 hbd, tesB和乙醇酸还原酶基因中的一种或更多种被整合到所述细胞的基因组中。
52.权利要求39-51中任一项所述的方法，其中所述phaA、bktB和/或phaB基因是真养雷氏菌基因。
53.权利要求52所述的方法，其中所述phaA、bktB和/或phaB基因是真养雷氏菌H16基因。
54.权利要求39-53中任一项所述的方法，其中所述pet基因是埃氏巨球形菌基因。
55.权利要求M所述的方法，其中所述pet基因是埃氏巨球形菌BE2-2083基因。
56.权利要求39-55中任一项所述的方法，其中所述tesB基因是大肠杆菌基因。
57.权利要求56所述的方法，其中所述tesB基因是大肠杆菌K12基因。
58.权利要求39-57中任一项所述的方法，其中所述编码乙醇酸还原酶的基因是假单胞菌属基因。
59.权利要求39-58中任一项所述的方法，其中所述编码乙醇酸还原酶的基因是酵母属基因。
全文摘要
本发明涉及重组细胞及其在生产3-羟基酸(例如3，4-二羟基丁酸和3-羟基丁内酯)中的用途。
文档编号C12P7/42GK102439133SQ201080019624
公开日2012年5月2日 申请日期2010年3月5日 优先权日2009年3月6日
发明者克丽斯塔拉·拉内特·琼斯·普拉瑟, 科林·洪特尔·马丁 申请人:麻省理工学院