对生物学样品中的物质进行检测的方法

专利名称：对生物学样品中的物质进行检测的方法
技术领域：
本发明涉及对生物学样品中的物质定性和/或定量地进行检测的方法。通过本发明的方法，针对尤其是在生物学样品中微量存在、通常难以检测的物质也能够进行检测。
背景技术：
禾丨_过献齢、共<介齢_齢辟腦_雜鼎齢载体的物质检测方法为了对生物学样品中的物质进行检测，以往广泛使用利用针对该物质(被检测物质)特异性结合的物质的方法。作为与被检测物质特异地结合的物质，多数情况下使用抗体、其它蛋白质等。上述这些物质可以固定化在微孔板、微珠、或传感器芯片等担载体上。作为固定化的通常的方法，已知有疏水结合、共价结合等。“疏水结合”是利用担载体的疏水性表面，和与待检测物质特异性结合的蛋白质 (以下，有时也称为“特异的蛋白质”)的疏水性部分之间的相互作用，使担载体与特异的蛋白质结合，不需要特别的试剂、简便。但是，通常结合力较弱，在用于ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay)等时，通过结合后的清洗操作等，蛋白质从担载体上脱离的情况较多。此外，通过疏水结合使特异的蛋白质与担载体结合时，有时多数蛋白质会完全丧失其功能或部分地丧失其功能。“共价结合”是利用特异的蛋白质中的官能团(例如氨基)与设置在担载体表面的官能团(例如羧基)之间的相互作用，结合力较强。但是，通过共价结合使特异的蛋白质与担载体结合时，与疏水结合的情况同样，在多数的蛋白质中，其功能完全或部分丧失。除了疏水结合和共价结合之外，还已知有如下方法使多个组氨酸融合在蛋白质的末端，具有该组氨酸标签的融合蛋白与表面设置有镍的例如蛋白质芯片等基板等进行结合的方法。但是，组氨酸标签与镍离子之间的相互作用不太强，此外，还已知镍离子与各种各样的生物体分子之间存在非特异性结合。通常来说，在特异性结合分析体系中，降低作为背景信号的原因的非特异性结合是重要的课题，上述分析体系使用如上这样通过疏水结合或共价结合而结合有与被检测物质特异性结合的蛋白质的固相。作为解决该课题的方法，提出了如下方法例如，使细菌成分提取液包含在检测用试剂中的方法(日本特开昭59-99257)；将下述宿主细胞的培养成分添加到样品中的方法，其中，该宿主细胞是导入有与用于生产与被检测物质特异性结合的重组蛋白质的载体(vector)同种的、且不含编码该蛋白质的基因的载体的宿主细胞(日本特开平8-4339 ；对来自和生产与被检测物质特异性结合的重组蛋白质的细胞相同种、 且不含该蛋白质的细胞的水提取液进行加热处理后，将其水溶性级分添加到样品中的方法 (日本特开2004-301646)等。通过这些方法，可以观察到对抑制非特异性结合具有的一定效果。糊·-浦泖碰抗生物素蛋白是来源于蛋清的糖蛋白，与生物素(维生素H)的结合非常强。抗生物素蛋白与生物素的相互作用是最强的非共价结合中的一种(Green(1975)Adv Protein Chem四85-13 。另一方面，链霉抗生物素是来源于放线菌的类抗生物素蛋白的蛋白质， 与生物素的结合也较强。到目前为止，就(链霉)抗生物素蛋白-生物素的相互作用而言， 由于其作用力的强度，因此被广泛用于例如抗原和抗体的检测等分子生物学、生物化学领域(Green(1990)Methods Enzymol 184:51-67)。有人提出了利用该抗生物素蛋白、链霉抗生物素的生物素结合性，使蛋白质与担载体结合的方法。即通过共价结合、疏水结合，将(链霉)抗生物素蛋白与微孔板等这样的基板结合，并进一步与经生物素化的蛋白质结合从而固定化的方法。此外，日本特开平4-236353中还报告了如下技术首先通过抗生物素蛋白-生物素结合，在结合有生物素的基板上结合抗生物素蛋白蛋白质，然后在此结合经生物素化的期望的蛋白质，其通过与抗生物素蛋白的另外的生物素口袋(biotin pocket)结合，从而得到按照基板-生物素-抗生物素蛋白-生物素-期望的蛋白质这样的顺序进行固定。使用通过这样的方法固定化的板，可以对被检测物质进行检测。但是，即使是利用了抗生物素蛋白-生物素结合的分析，与使用通过疏水结合、共价结合等结合有被检测物质特异的蛋白质的固相的方法相同，也存在需要处理背景信号这样较重要的问题。针对上述问题，除了上述的非特异抑制方法之外，提出了如下方法使结合有去活化的(链霉)抗生物素蛋白的固相与样品接触，然后，与结合有活性(链霉)抗生物素蛋白的固相接触的方法(日本特开平8-114590)；使抗生物素蛋白结合固相与生物素化物质结合后，与聚乙二醇与生物素之间的结合体接触的方法(日本特开平11-211727)； 与含生物素的溶液接触的方法(日本特开2002-48794)等。但是，还不能说获得了充分的实用上的效果。到目前为止，以作为蛋白质的标记、诊断标记物、细胞特异的标靶化因子使用为目的，制作了使用抗生物素蛋白或链霉抗生物素的融合蛋白(Airerme等人(1999)Bi0m0l Eng 16:87-92)。在这些融合蛋白中，尤其是抗生物素蛋白或链霉抗生物素与scFv、Fab片段、IgG这样的抗体之间的融合蛋白，应用于针对癌细胞等的药剂的特异标靶的研究日益发展。此外，记载了使用链霉抗生物素与scFv的融合蛋白，通过抗生物素蛋白-生物素结合固定化 scFv 的色谱柱的设想(Kiprivanov 等人(1995) Hum Antib Hybrid 6 :93_101、Dubel 等人(1995) J Immunol Methods 178:201-209)。但是，还尚未了解有利用通过生物素结合性蛋白质的固定化，对生体样品中的被检测物质进行检测的实例。虽然有报道将链霉抗生物素融合蛋白固定在已生物素化的板上，使用以已融合的蛋白质作为抗原的抗体，进行ELISA 的实例(W02002/046395)，但是该报道仅仅是展现了具有可以在不丧失活性的条件下将链霉抗生物素融合蛋白在担载体上进行固定化的可能性。现有技术文献
专利文献
专利文献1日本特开昭59-99257
专利文献2日本特开平8-43392
专利文献3日本特开2004-301646
专利文献4日本特开平8-114590
专利文献5日本特开平11-211727
专利文献6 日本特开2002-48794专利文献7 :W02002/046395专利文献8 :W002/072817非专利文献非专利文献1 =Green (1975) Adv Protein Chem 29 :85-133非专利文献2 :Green (1990)Methods Enzymol 184:51-67非专利文献3 :Airenne 等人(1999) Biomol Eng 16:87-92非专利文献4 :Kiprivanov 等人(1995) Hum Antib Hybrid 6 :93-101非专利文献5 :Dubel 等人(1995) J Immunol Methods 178:201-209非专利文献6 Takakura 等人(2009) FEBS J 276 :1383-139
发明内容
发明要解决的问题本发明以提供一种定性和/或定量地对生物学样品中的物质进行检测的方法为目的。本发明尤其是以提供一种在抑制背景信号的同时定性和/或定量地对生物学样品中微量存在的物质进行检测/测定的方法为目的。解决问题的方法本发明人等经过努力地深入研究的结果，开发了如下体系该体系利用生物素-生物素结合性蛋白质之间的结合，并将与被检测物质特异性结合的蛋白质和生物素结合性蛋白质的融合蛋白固定于担载体。这样一来，在该体系中，尤其是为了对在生物学样品中微量存在的物质进行检测，发现处理背景信号成为较大的问题，由此为了降低该背景信号进行钻研，从而想出了本发明。具体来说，在向生物学样品中添加细胞破碎提取液及生物素结合性蛋白质的情况下，减少非特异性结合的效果显著。或者，添加由通过基因工程技术结合有生物素结合性蛋白质的细胞制备的细胞破碎提取液，来代替添加生物素结合性蛋白质，也可以获得同样的效果。此外，本发明人等发现在将与检测物质特异性结合的蛋白质和生物素结合性蛋白质的融合蛋白固定于担载体的体系中，在添加生物学样品之前，通过使生物素结合性蛋白质与该担载体接触(封闭(blocking))，可以在抑制背景信号的同时稳定地对更低浓度的物质进行测定。本发明是基于以上的认识，提供如下的检测方法在将通过抗生物素蛋白-生物素结合而对被检测物质进行特异检测的物质固定于担载体的体系中，减少非特异性结合、 灵敏度更高的检测方法。本发明包括以下的实施方式，但不局限于此。[实施方式1]一种对生物学样品中的物质进行检测的方法，其包括1)准备融合蛋白以及结合有生物素的担载体，所述融合蛋白是与待检测物质特异性结合的蛋白质和生物素结合性蛋白质的融合蛋白；2)通过生物素-生物素结合性蛋白质之间的结合，使工序1)准备的担载体与融合蛋白结合，从而制作结合有融合蛋白的担载体；3)将(a)生物学样品、以及(b-i)细胞破碎提取液和生物素结合性蛋白质，该细胞破碎提取液是由与用于表达工序1)的融合蛋白的宿主细胞相同种的细胞制备的细胞破碎提取液，或者(b-ii)由下述细胞制备的细胞破碎提取液，所述细胞是在与用于表达工序1)的融合蛋白的宿主细胞相同种的细胞中通过基因工程技术表达了生物素结合性蛋白质的细胞；混合后添加至工序2)制作的结合有融合蛋白的担载体中；然后，4)对与蛋白质结合的被检测物质进行检测，所述蛋白质是与融合蛋白中的待检测物质特异性结合的蛋白质。[实施方式2]一种对生物学样品中的物质进行检测的方法，其包括1)准备融合蛋白以及结合有生物素的担载体，所述融合蛋白是与待检测物质特异性结合的蛋白质和生物素结合性蛋白质的融合蛋白；2)通过生物素-生物素结合性蛋白质之间的结合，使工序1)准备的担载体与融合蛋白结合，从而制作结合有融合蛋白的担载体；3)使工序2)制作的结合有融合蛋白的担载体与生物素结合性蛋白质接触，从而进行担载体的封闭；4)在工序幻的封闭工序后，向结合有融合蛋白的担载体添加生物学样品，然后，5)对与蛋白质结合的被检测物质进行检测，所述蛋白质是与融合蛋白中的待检测物质特异性结合的蛋白质。[实施方式3]一种对生物学样品中的物质进行检测的方法，其包括1)准备融合蛋白以及结合有生物素的担载体，所述融合蛋白是与待检测物质特异性结合的蛋白质和生物素结合性蛋白质的融合蛋白；2)通过生物素-生物素结合性蛋白质之间的结合，使工序1)准备的担载体与融合蛋白结合，从而制作结合有融合蛋白的担载体；3)使工序2)制作的结合有融合蛋白的担载体与生物素结合性蛋白质接触，从而进行担载体的封闭；4)在工序3)的封闭工序后，将(a)生物学样品，以及 (b-i)细胞破碎提取液和生物素结合性蛋白质，该细胞破碎提取液是由与用于表达工序1)的融合蛋白的宿主细胞相同种的细胞制备的细胞破碎提取液，或者(b-ii)由下述细胞制备的细胞破碎提取液，所述细胞是在与用于表达工序1)的融合蛋白的宿主细胞相同种的细胞中通过基因工程技术表达了生物素结合性蛋白质的细胞；混合后添加至结合有融合蛋白的担载体中；然后，5)对与蛋白质结合的被检测物质进行检测，所述蛋白质是与融合蛋白中的待检测物质特异性结合的蛋白质。[实施方式4]
根据实施方式1或3所述的方法，其中，在实施方式1的工序3 (b-i)或实施方式3 的工序4(b_i)中，添加由含任意载体的细胞提取的细胞破碎提取液作为细胞破碎提取液。[实施方式5]根据实施方式1 4中的任一项所述的方法，其中，生物素结合性蛋白质是 tamavidin或其突变体。[实施方式6]根据实施方式1 5中任一项所述的方法，其中，生物学样品选自血液、血清、脑脊髓液、唾液、汗、尿、泪、淋巴液以及母乳。[实施方式7]—种用于检测生物学样品中的物质的担载体，其通过生物素-生物素结合性蛋白质之间的结合与融合蛋白结合，所述融合蛋白是与待检测物质特异性结合的蛋白质和生物素结合性蛋白质的融合蛋白，所述用于检测生物学样品中的物质的担载体通过下述方法制备1)准备融合蛋白以及结合有生物素的担载体，所述融合蛋白是与待检测物质特异性结合的蛋白质和生物素结合性蛋白质的融合蛋白；2)通过生物素-生物素结合性蛋白质之间的结合，使工序1)准备的担载体与融合蛋白结合，从而制作结合有融合蛋白的担载体；3)使工序2)制作的结合有融合蛋白的担载体与生物素结合性蛋白质接触，从而进行担载体的封闭。[实施方式8]一种用于对生物学样品中的物质进行检测的试剂盒，其包含A)通过生物素-生物素结合性蛋白质之间结合而与融合蛋白结合的担载体，所述融合蛋白是与待检测物质特异性结合的蛋白质和生物素结合性蛋白质的融合蛋白，以及用于稀释生物学样品的包含下述B-i)或者B-ii)的试剂；B-i)细胞破碎提取液和生物素结合性蛋白质，所述细胞破碎提取液是由与用于表达A)的融合蛋白的宿主细胞相同种的细胞制备的细胞破碎提取液，或者B-ii)由在与用于表达Α)的融合蛋白的宿主细胞相同种的细胞中通过基因工程技术表达了生物素结合性蛋白质的细胞制备的细胞破碎提取液；和/或C)含生物素结合性蛋白质的封闭剂。发明的效果通过本发明的方法，在生物学样品中的被检测物质的检测中，可以抑制背景信号， 稳定地进行灵敏度更高的检测。通过本发明的方法，尤其是对于在生物学样品中微量存在， 通常难以检测的物质也而可以进行检测。


[图1]图1是通过生物素结合性蛋白质进行封闭的模式图。白色圆圈表示生物素，黑色椭圆表示生物素结合性蛋白质，白色椭圆表示与被检测物质特异性结合的蛋白质。 图IA 未通过生物素结合性蛋白质进行封闭、有融合蛋白的固定化；图IB 未通过生物素结合性蛋白质进行封闭、无融合蛋白的固定化；图IC 通过生物素结合性蛋白质进行封闭、有融合蛋白的固定化；图ID 通过生物素结合性蛋白质进行封闭、无融合蛋白的固定化。[图2]图2是通过免疫印迹法(Westernblotting)，对利用大肠杆菌表达的 SITH-I和TM2的融合蛋白进行检测的结果。作为对照，使用了仅导入了载体的大肠杆菌[图3]图3是示出向血清中添加大肠杆菌破碎提取液对非特异的结合带来的效果，以及通过tamavidin 2进行封闭的效果。图3_1示出(仅)通过BSA进行封闭时的结果。即，示出31^-11112融合蛋白固定化板(0.5%854封闭)的测定值减去未进行任何固定化的生物素化板(0. 5% BSA封闭)的测定值得到的结果。图3-2示出了利用BSA和TM2 进行封闭时的结果。即，示出SITH-1-TM2融合蛋白固定化板(50μ g/ml TM2/0. 5% BSA封闭)的测定值减去未进行任何固定化的生物素化板(50μ g/ml TM2/0. 5% BSA封闭)的测定值所得到的结果。[图4]图4的列2是通过免疫印迹法对利用大肠杆菌表达的Harpin和TM2的融合蛋白进行检测得到的结果。作为对照，使用了仅导入有载体的大肠杆菌(列1)。
具体实施例方式I.本发明的检测方法(实施方式1)本发明的检测方法(实施方式1)是对生物学样品中的物质进行检测的方法，其包括1)准备融合蛋白以及结合有生物素的担载体，所述融合蛋白是与待检测物质特异性结合的蛋白质和生物素结合性蛋白质的融合蛋白；2)通过生物素-生物素结合性蛋白质之间的结合，使工序1)准备的担载体与融合蛋白结合，从而制作结合有融合蛋白的担载体；3)将(a)生物学样品、以及(b-i)细胞破碎提取液和生物素结合性蛋白质，该细胞破碎提取液是由与用于表达工序1)的融合蛋白的宿主细胞相同种的细胞制备的细胞破碎提取液，或者(b-ii)由下述细胞制备的细胞破碎提取液，所述细胞是在与用于表达工序1)的融合蛋白的宿主细胞相同种的细胞中通过基因工程技术表达了生物素结合性蛋白质的细胞；混合后添加至工序2)制作的结合有融合蛋白的担载体中；然后，4)对与蛋白质结合的被检测物质进行检测，所述蛋白质是与融合蛋白中的待检测物质特异性结合的蛋白质。生物学样品中的检测物质本发明涉及对生物学样品中的物质进行检测的方法。作为本发明中的生物学样品，只要是可能含有作为检测对象的物质即可，没有特别的限定。可以是含有由生物采集的细胞、组织或其破片等的样品，例如体液，更优选血液、 血清、脑脊髓液、唾液、汗、尿、泪、淋巴液以及母乳等。这样的体液，根据需要稀释使用。稀释率通常为2倍 10000倍左右，优选100 倍 1000倍左右，但并不限定于此。用于稀释的溶液可以使用任意的缓冲液，也可以含有适当的封闭剂。作为封闭剂，抑制非特异的结合效果高的物质较好，可以使用本领域技术人员公知的封闭剂如BSA或酪蛋白等。需要说明的是，本发明的实施方式2使用生物素结合性蛋白质作为封闭剂。针对这种情况将在下文中描述。作为本发明的被检测物质，只要是期望进行生物学样品中的检测或测定的物质即可，没有特别地限制，但可以优选使用抗体、抗原等蛋白质及其片段、肽、核酸、糖类、糖脂寸。

本发明也使得对生物学样品中、浓度低的通过以往的方法难以检测或正确定量的物质的测定成为可能。例如，当被检测物质是例如血清中的抗体，且进一步当抗体效价较低时(例如，将血清稀释1000倍时难以检测，但将血清稀释100倍时方才能够检测的低抗体效价的情况)，需要抑制血清的稀释率，其结果还会导致来源于血清中成分的非特异性结合增加，利用现有的方法，对于该抗体的检测和定量较为困难，通过本发明的方法，可以容易地检测，或可以更正确地进行定量。作为本发明的被检测物质，虽不局限于此，例如有由HHV-6的潜伏感染中间阶段转录物编码的小蛋白质(Small protein encoded by the Intermediate Transcript of HHV-6) (SITH-I)的抗体。作为其它，还可以举出疱疹病毒的上述之外的抗原的抗体、来源于巨细胞病毒、肝炎病毒、HIV病毒、HTLV病毒、麻疹病毒、流感病毒等的病毒关联抗原的抗体；或来源于幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)等的细菌关联的抗原的抗体；或真菌关联的抗原的抗体等。基于PCT/.TP2008/67300及美国临时申请No. 61/102441所记载的内容的SITH-I(I)SITH-I 蛋白质、核酸SITH-I蛋白质、核酸的结构及功能如PCT/JP2008/67300所公开的，将其全部内容引入本说明书中。SITH-I是与疱疹病毒的潜伏感染相关的因子，更详细来说，是在疱疹病毒的潜伏感染时进行特异表达的蛋白质。在此，“在疱疹病毒的潜伏感染时进行特异性表达”是指在感染了疱疹病毒的宿主中，疱疹病毒潜伏感染(未增殖感染)时，特异性地对疱疹病毒来源的基因或基因产物进行表达。作为SITH-I的蛋白质及核酸，可以列举例如(a)由SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列构成的蛋白质、以及编码该蛋白质的核酸。由SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列构成的SITH-I蛋白质，如下述参考例所示，是作为人疱疹病毒-6(HHV-6)的潜伏感染时特异表达的蛋白质，而被分离/鉴定的蛋白质。 SITH-I蛋白质是具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列、由159个氨基酸构成、分子量约 17. 5kDa的蛋白质。SITH-I蛋白质由SITH-I基因的核酸编码。该SITH-1基因的cDNA如SEQ ID N0: 3所示，具有1795个碱基对(约1. 79kbp)的大小，第954 第956位的碱基序列为起始密码子(Kozak ATG)，第1431 第1433位的碱基序列为终止密码子(TAA)。因此，在如SEQ ID NO 3所示的碱基序列中，上述SITH-I核酸具有从第954 1430位的碱基序列作为开放阅读框(ORF)，该ORF具有477个碱基对(约0. 48kbp)的大小。在SITH-I的cDNA中，表示ORF区域的碱基序列如SEQ ID NO 2所示。需要说明的是，所记载的SEQ ID NO 2所示的碱基序列含有终止密码子的3个碱基。SITH-I核酸通常均在HHV-6潜伏感染的细胞的细胞质中表达，另一方面，在增殖感染细胞中未发现有表达。编码SITH-I蛋白质的核酸，由下述DNA编码，该DNA与到目前为止报告的HHV-6潜伏感染特异的基因(H6LT)成互补链的关系，其表达在HHV-6的潜伏感染的中间阶段增强。从这些事实可以认为=SITH-I蛋白质是在HHV-6的潜伏感染时进行特异表达的蛋白质。SITH-I蛋白质与宿主蛋白质即CAML(钙离子调节亲环素配体 (calcium-modulating cyclophilin ligand)，Accesion# ;U18242)结合,使神经胶质细胞内的钙浓度升高。已知CAML在宿主生物体内多存在于脑和淋巴细胞中，是使细胞内的钙浓度升高的蛋白质。此外，可以认为由SITH-I蛋白质的表达导致的细胞内钙浓度升高，使得 潜伏感染细胞内的全部信号传导活化，有助于对HHV-6的高效再活化。已知HHV-6在脑内的神经胶质细胞中潜伏感染，可以认为在潜伏感染时、或在作为活性高的潜伏感染状态的中间阶段，HHV-6使SITH-I表达时，神经胶质细胞内的钙浓度升高。认为脑细胞中的细胞内钙浓度的升高与情绪障碍等精神障碍有较大关系(日本理研年报2003)。SITH-I蛋白质具有与宿主的蛋白质即CAML结合并保持活性、使细胞内钙浓度升高的功能。此外，通过在脑内的神经胶质细胞表达该蛋白质，该神经胶质细胞被认为是表达 SITH-I蛋白质最强的细胞，可以诱导精神障碍。由此认为=SITH-I蛋白质在疱疹病毒的潜伏感染时或再活化初期表达，具有使宿主产生精神障碍的功能。(2)抗 SITH-I 的抗体以SITH-I蛋白质或其突变体、或它们的部分肽作为抗原，通过公知的方法，作为多克隆抗体或单克隆抗体得到抗SITH-I的抗体。作为公知的方法，可以举出例如文献 (Harlow 等人的"Antibodies :A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988))”、岩崎等人的“单克隆抗体杂交瘤和ELISA、讲谈社(1991)”)中所述的方法。这样得到的抗体可以用于SITH-I蛋白质的检测/测定等。用语的“抗体”表示免疫球蛋白(IgA, IgD, IgE, IgG, IgM及它们的Fab片段、 F(ab' )2片段、Fc片段)，作为实例，可以列举多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体、抗独特型抗体及人源化抗体，但不限于这些抗体。用语“识别SITH-I蛋白质的抗体”是指包括能够与SITH-I蛋白质特异性结合的完整的分子及抗体片段(例如，Fab及F(ab’)2片段)。可以使用依据本说明书中公开的方法，或公知的方法而获得Fab和F(ab’ )2以及SITH-I抗体的其它片段。这样的片段，代表性的，使用以木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab’)2片段)这样的酶，通过蛋白质分解的切断而产生。认为情绪障碍患者或可能患有情绪障碍的个体，SITH-I蛋白质的表达量增加，其结果SITH-I抗体效价也升高。就本发明而言，在一种实施方式中，通过对生物学样品中的 SITH-I抗体进行检测，可以鉴定情绪障碍患者或可能患有情绪障碍的个体。结合有ij待检测勿质牛寺异+牛结合的g白Jli禾口勿素结合+牛g白Jli的g屯合g白白勺担载体(实施方式1的工序1)及2))本发明的检测方法利用如下担载体，该担载体通过生物素_生物素结合性蛋白质之间的结合与如下融合蛋白结合，该融合蛋白是与待检测物质特异性结合的蛋白质和生物素结合性蛋白质的融合蛋白。本发明的担载体，可以通过包括下述工序的方法制备
1)准备融合蛋白以及结合有生物素的担载体，所述融合蛋白是与待检测物质特异性结合的蛋白质和生物素结合性蛋白质的融合蛋白2)通过生物素-生物素结合性蛋白质之间的结合，使工序1)准备的担载体与融合蛋白结合，从而制作结合有融合蛋白的担载体。结合有牛物素的担载体“生物素”是指D_[ (+)-顺-六氢-2-氧代-IH-噻吩并_(3，4)-咪唑_4_戊酸] 的一般名称。是分类于维生素B族的水溶性维生素的一种，也称为VitaminB7 (维生素B7)， 或者有时也被称为维生素H、辅酶R。生物素与蛋清中所包含的糖蛋白质中的一种，与抗生物素蛋白的结合非常强，从而使其吸收受阻。为此，存在由于大量摄取生蛋清而导致的生物素缺乏症。本说明书中的“生物素”除上述生物素之外，还包括亚氨基生物素(iminobiotin) (Hofmann 等人(1980) Proc Natl Acad Sci USA 77:4666-4668)、脱硫生物素 (desthiobiotin)(Hirsch 等人(2002)Anal Biochem 308:343-357)、或生物胞素 (biocytin)、生物素亚砜(Biotin sufoxide)等生物素类似体。使用了生物素_抗生物素蛋白(生物素结合性蛋白质)复合体的系统广泛用于组织免疫学、DNA分析、临床检查等领域。将本发明的蛋白质与担载体结合的方法如下所述 利用生物素-抗生物素蛋白结合，使在生物素结合性蛋白质上结合有所期望的蛋白质而形成的融合蛋白与担载体相结合。与以往利用了生物素_抗生物素蛋白结合的结合相比，本发明的方法不会损坏蛋白质的功能，能够非常有效地进行作用。构成固体担载体的材料包括纤维素、特氟隆(teflon)(注册商标)、硝酸纤维素、 琼脂糖、葡聚糖、壳聚糖、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚酯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚丙烯、尼龙、聚偏二氟乙烯、胶乳、二氧化硅、玻璃、玻璃纤维、金、钼、银、铜、铁、不锈钢、铁氧体(ferrite)、 硅晶片、聚乙烯、聚乙烯亚胺、聚乳酸、树脂、多糖类、蛋白质(白蛋白等)、碳或它们的组合等，但不限于上述这些。此外，优选具有一定强度，组成稳定，并且非特异性结合少的材料。固体担载体的形状包括珠子、磁珠、薄膜、微管、滤膜、板、微孔板、碳纳米管、传感器芯片等，但并不限于上述这些。如本技术领域中所知的，可以在薄膜、板等平坦固体担载体上设置凹坑、沟槽、滤膜底部等。在发明的一个实施方式中，珠子可以具有约25nm 约Imm范围的球体直径。在优选的实施方式中，珠子具有约50nm 约ΙΟμπι范围的直径。珠子的大小可以根据特定的用途来选择。由于一些细菌孢子具有约1 μ m量级的大小，因此优选用于捕捉所涉及的孢子的珠子具有大于Iym的直径。虽不局限于此，例如，在期望具有高检测灵敏度的情况下，从待检测物质和与其特异性结合的物质之间的接触频繁程度、清洗操作的容易性这样的观点来看，可以优选使用上述这样的珠子作为固体担载体。作为使生物素与担载体结合的方法，可以列举使用例如生物素化试剂的方法。作为生物素化试剂，可以利用例如=PIERCE公司制造的(括号内按照顺序为接头长度、反应基团)EZ-Link(注册商标)磺基-NHS-生物素(13.5A、伯胺)、EZ-Link(注册商标)磺基-NHS-LC-生物素(22.4A、伯胺)、EZ-Link(注册商标)磺基-NHS-LCLC-生物素(30.5A、 伯胺)、EZ-Link(注册商标)PFP-生物素(9.6 A、胺)、EZ-Link(注册商标)马来酰亚胺-PEO2-生物素(29.1A、巯基)、EZ-Link (注册商标)生物素-PEO2胺(20.4A、羧基)、 EZ-Link (注册商标)生物素-PEO3-LC胺(22.9A、羧基)、EZ-Link (注册商标)生物素-酰胼(15.7A、酸基)、EZ-Link (注册商标)生物素-LC-酰胼(24.7A、酸基)、EZ_Link (注册商标)NHS-亚胺基生物素(13.5A、伯胺)等，但并不限于上述物质利用上述生物素化试剂，使用公知的方法，可以使生物素结合在微孔板、微珠、或传感器芯片等期望的担载体上。例如有使用具有氨基、羧基、巯基、甲苯磺酰基、环氧基、 马来酰亚胺基、活性酯等各种官能团的担载体(例如磁珠、S印harose珠子、琼脂糖珠子 (agarose beads)、胶乳珠子、微滴度板等)的方法。此时例如，在使用含NHS酯的生物素化试剂的情况下，可以利用如DMSO (demethlysulfoxide, 二亚基亚砜)这样的有机溶剂或pH7 至9的磷酸缓冲液溶解含NHS酯的生物素化试剂，并通过添加到具有氨基的固定化担载体中从而使生物素结合。此外例如，在使用含氨基的生物素化试剂的情况下，还可以使用如 EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(l-ethyl-3-(3-dimethylaminoprop yDcarbodiimide hydrochloride))这样的碳二亚胺，使固定化担载体的羧基变成活性酯， 然后，添加在PH5附近的缓冲液中溶解的生物素化试剂，从而使生物素结合。需要说明的是，就经生物素化的固定化担载体而言，优选对未反应的官能团进行去活化后，利用BSA等进行封闭。此外，可以利用经生物素化的市售担载体。作为经生物素化的微孔板，可以利用例如Aeacti-Bind 生物素包被的聚苯乙烯板(PIERCE公司制造)，但不限定于此。作为经生物素化的微珠，例如，作为磁珠，可以利用BioMag生物素(Polysciences公司制造)，或作为纳米磁珠，可以利用Corefront公司制造的nanomag(注册商标)-D生物素、nanomag(注册商标)-二氧化硅生物素，或作为聚苯乙烯制的微珠，可以使用Beadlyte (注册商标)生物素珠子(Upstate公司制造)，或作为琼脂糖可以使用Sigma公司制造的生物素琼脂糖、 2-亚氨基生物素-琼脂糖，或作为高交联琼脂糖，可以使用生物素-S印harosdBiosearch Technologies公司制造)，但并不限定于上述这些。就连接担载体与生物素的接头的长度而言，优选至少长于5 A,更优选为13.5 A以上，进一步优选为22.4 A以上，更进一步优选为30.5 A以上。与待检测物质特异件结合的蛋白质对于与被检测物质特异性结合的蛋白质(以下，有时也称为“特异的蛋白质”)没有特别限定。作为该发明的一个实施方式，例如在抗原与抗体、激素等配体与受体、凝集素与糖、核酸的互补结合等中，可以利用其中的一方，与另一方的特异复合体的形成能力，从被检测样品中选择性地进行分析，但并不局限于上述这些物质。更为详细来说，作为例如蛋白质，可以举出抗体、抗原蛋白质、凝集素、肽、或蛋白 A、蛋白G、蛋白L、受体、酶蛋白质等。作为抗体，可以列举IgG，除此之外还有ScFV、Fab等包含抗原结合部位的抗体片段，作为抗原蛋白质，可以列举甲型/丙型肝炎病毒、HIV、流感、 疱疹病毒等病毒来源的蛋白质、幽门螺杆菌等细菌来源的蛋白质、或CEA、PSA等肿瘤标记物、性激素等。凝集素是糖结合性蛋白质，可以列举甘露糖特异性凝集素、GalNAc特异性凝集素、GlcNAc特异性凝集素、岩藻糖特异性凝集素、唾液酸特异性凝集素等单糖特异性凝集素、寡糖特异性凝集素等。此外，还可以列举DNA/RNA结合蛋白质等。另外作为肽，作为实例可以列举由2 100个氨基酸构成的肽，优选由4 50个氨基酸构成的肽，更优选由6 30个氨基酸构成的肽，但并不限定于上述这些。此外，虽不局限于此，本发明中作为与被检测物质特异性结合的蛋白质的实例，可以列举SITH-I蛋白质。牛物素结合件蛋白质本发明包括利用生物素- 生物素结合性蛋白质之间的结合，使与被检测物质特异性结合的蛋白质固定于担载体。在本发明中，“生物素-生物素结合性蛋白质之间的结合” 有时也称为“抗生物素蛋白_生物素结合”。作为生物素结合性蛋白质，只要是能够与抗生物素蛋白、链霉抗生物素、中性链亲和素(neutravidin)、AVR 蛋白质(Biochem. J.，(2002)，363 :609_617)、Bradavidin (J. Biol. Chem. ， (2005),280 13250-13255)、 Rhizavidin(Biochem. J. ， (2007),405 397-405)、tamavidin(W002/072817)、它们的突变体等与生物素强结合的蛋白质，其中的任何均可以优选使用。优选至少与生物素的解离常数(KD)为10_6以下、更优选为10_8以下， 进而更优选为10,以下。需要注意的是，就添加到被检测样品中的生物素结合性蛋白质、 以及用于封闭担载体的生物素结合性蛋白质而言，如下文所述。作为生物素结合性蛋白质，尤其是可以优选使用在大肠杆菌中高表达的 tamavidin和其突变体。Tamavidin是从作为食用蘑菇的担子菌白黄侧耳(Pleurotus conucopiae)中发现的生物素结合性蛋白质(W002/072817、Takakura等人(2009)FEBS J 276 1383-1397)。作为tamavidin的突变体，可以列举例如高结合能力/低非特异性结合 tamavidin(PCT/JP2009/64302)等。本发明的“tamavidin”是指tamavidin Utamavidin 2、或它们的突变体。具体来说，典型地，本发明的tamavidin可以是包含SEQ ID NO 5或SEQ IDNO 7的氨基酸序列的蛋白质，或也可以是由包含SEQ ID NO 4或SEQ IDNO 6的碱基序列的核酸编码的蛋白质。 或者，本发明的tamavidin可以是包含SEQ ID NO :5或SEQ ID NO :7的氨基酸序列的蛋白质的突变体，或也可以是作为由包含SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 6的碱基序列的核酸编码的蛋白质的突变体，与tamavidin 1或2具有同样的生物素结合活性的蛋白质、或具有高结合能力/低非特异性结合活性的蛋白质。在本说明书中，有时将tamavidin U tamavidin 2以及它们的突变体统称，简称为“tamavidin”。Tamavidin 1或2的突变体可以是包含如下氨基酸序列，与tamavidin 1或2具有同样生物素结合活性的蛋白质，所述氨基酸序列是在SEQ ID NO :5或7的氨基酸序列中，有 1个或多个氨基酸的缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列。取代可以是保守性取代，保守性取代是指特定的氨基酸残基被具有类似物理化学特征的残基所取代。保守性取代的非限定实例包括Ile、Val, Leu或Ala的相互取代这样的含脂肪族基团的氨基酸残基之间的取代、Lys与Arg、Glu与Asp、Gln与Asn的相互取代这样的极性残基之间的取代等。通过氨基酸的缺失、取代、插入和/或添加而得到的突变体，可以通过如下方法来制作在编码野生型蛋白质的DNA中，通过例如作为公知技术的定点诱变(例如，参考 Nucleic Acid Research, Vol. 10，No. 20，p. 6487-6500，1982，通过引用将其全部内容引入本说明书)来实现。在本说明书中，“1个或多个氨基酸”优选是能够通过定点诱变法而缺失、取代、插入和/或添加的程度的氨基酸。此外，在本说明书中“1个或多个氨基酸”，根据情况可以为1个或几个氨基酸。虽不局限于此，“1个或多个氨基酸”是指50个以内，优选40个以内、30个以内、20个以内、10个以内、8个以内、5个以内、3个以内的氨基酸。 tamavidin 1或2的突变体还可以是包含与SEQ IDNO :5或7的氨基酸序列具有至少60% 以上、优选65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96% 以上、97%以上、98%以上或99%以上、更优选99. 3%以上氨基酸同一性的氨基酸序列，且与tamavidin 1或2具有相同生物素结合活性的蛋白质，或具有高结合能力/低非特异性结合活性的蛋白质。两个氨基酸序列的同一性％可通过目测检查和数学计算来确定。或者，两个蛋白质序列的同一性百分比可以通过使用以Needleman，S. B.及Wunsch，C. D. (J. Mol. Bol. ,48 443-453,1970)的算法为基础、从威斯康星州大学遗传学计算机组(UWGCG)获得的GAP计算机程序进行序列信息比较来确定。GAP程序优选的默认参数包括= (I)Henikoff, S.以及 Henikoff, J. G. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA,89 10915-10919,1992)中所记载的计分矩阵 ( scoring matrix)、blosum62 ； (2) 12分的空位罚分；(3)4分的空位长度罚分；以及(4)末端空位不罚分。也可使用该领域技术人员使用的进行序列比较的其它程序。关于同一性百分比，例如可以使用 Altschul 等(Nuc 1. Acids. Res.，25，p. 3389-3402，1997)中记载的 BLAST程序来对序列信息进行比较和确定。该程序可于网络上在Nantional Center for Biotechnology Information (NCBI) ^DNA Data Bank of Japan (DDBJ)网立占i^ffi。i亥网立占对利用BLAST程序进行同一性检索的各种条件(参数)进行了详细记载，可对部分设定进行适当变更，但检索通常使用默认值来进行。此外，两个氨基酸序列的同一性％也可用遗传信息处理软件GENETYX Ver. 7 (GENETYX制)等程序或FASTA算法等来确定。此时，也可用默认值检索。 两个核酸序列的同一性％可通过目测检查和数学计算来确定，此外，该比较更优选使用计算机程序对序列信息进行比较。具有代表性的优选计算机程序为遗传学计算机组(GCG ；威斯康星州Madison)的威斯康星软件包、10. O版“GAP”程序(Devereux等，1984， Nucl. Acids Res. ,12 :387)。使用该“GAP”程序，不仅可对两个核酸序列进行比较，还可比较两个氨基酸序列，并可进行对核酸序列和氨基酸序列的比较。需要说明的是，构成与担载体结合的融合蛋白的“生物素结合性蛋白质”用于通过生物素-生物素结合性蛋白质之间的结合，使融合蛋白与担载体结合，从而制作结合有融合蛋白的担载体。由此，虽不局限于此，上述利用tamavidin 1或tamavidin 2的突变体形成的融合蛋白，与利用它们的野生型形成的融合蛋白的情况相比，优选生物素结合活性无明显减少。由此，非限定地，tamavidin 1的突变体优选如下序列SEQ ID NO 5的氨基酸序列中N14、S18、Y34、S36、S78、W82、W98、W110、D118未被修饰。需要说明的是，该表述例如 Y34是表示SEQ ID NO 5的氨基酸序列34位的酪氨酸残基。或者，在对这些氨基酸进行修饰的情况下，优选被修饰为性质或结构类似的氨基酸，优选分别进行如下修饰，例如当为天冬酰胺(附4)时，可以修饰为谷氨酰胺(Q)、天冬氨酸(D)，优选修饰为天冬氨酸；当为丝氨酸(S18、S36、S78)时，可以修饰为苏氨酸(T)或酪氨酸(Y)，优选修饰为苏氨酸；当为酪氨酸(Y34)时，可以修饰为丝氨酸(S)、苏氨酸(T)或苯丙氨酸(F)，优选修饰为苯丙氨酸；当为色氨酸(W82、W98、W110)时，可以修饰为苯丙氨酸(F)；当为天冬氨酸(Dl 18)时，可以修饰为谷氨酸(Ε)、天冬酰胺(N)，优选修饰为天冬酰胺。此外，tamavidin 2的突变体优选如下序列SEQ ID NO 7的氨基酸序列中的四个色氨酸残基(W69、W80、W96、W108)未被修饰。或者，在对这些氨基酸进行修饰的情况下，优选被修饰为性质或结构类似的氨基酸，例如苯丙氨酸(F)。此外，期望被认为与生物素直接进行相互作用的氨基酸残基(N14、S18、Y34、S36、S76、T78、D116)也未被修饰。或者，在对这些氨基酸进行修饰的情况下，优选修饰为性质或结构类似的氨基酸从而可以保持与生物素的结合，优选分别进行如下修饰，例如为天冬酰胺(附4)时，可以修饰为谷氨酰胺(Q)、天冬氨酸(D)，优选修饰为天冬氨酸；当为天冬氨酸(D40)时，可以修饰为天冬酰胺(N)；当为丝氨酸(S18、S36、S76)时，可以修饰为苏氨酸(T)或酪氨酸(Y)，优选修饰为苏氨酸；当为酪氨酸(Y34)时，可以修饰为丝氨酸(S)、苏氨酸(T)或苯丙氨酸(F)，优选修饰为苯丙氨酸； 当为苏氨酸(T78)时，可以修饰为丝氨酸(S)、酪氨酸(Y)，优选修饰为丝氨酸；当为天冬氨酸(D116)时，可以修饰为谷氨酸(E)、天 冬酰胺(N)，优选修饰为天冬酰胺。在本发明中，优选的tamavidin修饰体包含以下物质(PCT/JP2009/64302)。在包含SEQ ID NO 7所述的氨基酸序列、或者在该序列中具有1个 多个氨基酸突变的氨基酸序列、或者与该序列具有80%以上同一性的氨基酸序列，且显示生物素结合活性的蛋白质中，选自下组中的1个或多个残基被取代成酸性氨基酸残基或中性氨基酸残基而得到的修饰型生物素结合蛋白质DSEQ ID NO 7的104位的精氨酸残基；2) SEQ ID NO 7的141位的赖氨酸残基；3) SEQ ID NO 7的26位的赖氨酸残基；以及4) SEQ ID NO 7的73位的赖氨酸残基。更优选选自下组中的修饰型生物素结合蛋白质在SEQ ID NO 7中，104位的精氨酸残基被取代成谷氨酸残基、且141位的赖氨酸残基被取代成谷氨酸残基而得到的修饰型生物素结合蛋白质(R104E-K141E)；在SEQ ID NO :7中，40位的天冬氨酸残基被取代成天冬酰胺残基、且104位的精氨酸残基被取代成谷氨酸残基而得到的修饰型生物素结合蛋白质(D40N-R104E)；在SEQ ID NO :7中，40位的天冬氨酸残基被取代成天冬酰胺残基、且141位的赖氨酸残基被取代成谷氨酸残基而得到的修饰型生物素结合蛋白质(D40N-K141E)；以及在SEQ ID NO :7中，40位的天冬氨酸残基被取代成天冬酰胺残基、且104位的精氨酸残基被取代成谷氨酸残基、且141位的赖氨酸残基被取代成谷氨酸残基而得到的修饰型生物素结合蛋白质(D40N-R104E-K141E)。与辛皮检测丨4勿质牛寺异+牛结合的g白Jli禾口勿素结合+牛g白Jli的g屯合g白本发明将与被检测物质特异性结合的蛋白质和生物素结合性蛋白质的融合蛋白 (以下，有时也称为“生物素结合性蛋白质融合蛋白”、或“融合蛋白”)固定在担载体上。对于生物素结合性蛋白质融合蛋白的准备方法没有特别限定，例如可以使用公知的基因工程的手法使其表达。例如、通过使用大肠杆菌等表达体系，表达编码生物素结合性蛋白质和所期望的蛋白质的融合蛋白基因，从而可以获得融合蛋白。需要说明的是，为了在大肠杆菌中高表达，优选利用tamavidin、其突变体。在生物素结合性蛋白质融合蛋白中，生物素结合性蛋白质可以直接与所期望的蛋白质结合，或者也可以通过接头结合，优选通过氨基酸接头结合。该接头的长度可以至少为1个氨基酸以上，优选为5个氨基酸以上，更优选为6个氨基酸以上。此外，为了进一步提高与担载体结合的生物素和tamavidin之间的结合力，优选10个氨基酸以上、更优选12 个氨基酸以上、15个氨基酸以上、18个氨基酸以上，进一步优选25个氨基酸以上。此外，推测这样的接头还可以提高tamavidin融合蛋白的活性。对于构成该接头的氨基酸没有特别限定，优选，由甘氨酸、丝氨酸、或丙氨酸这样中性的氨基酸重复构成。例如，可以举出但不限于下述GGGGS, GGSGG, GASAG, GSGAA, GSGSA, GGGGSG, GGGSGGS、GGSGGGGS、AAAAGSGAA、 GGGGSGGGGSGGGGS, GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG GGGS(SEQ IDNO 8-18)等此外，生物素结合性蛋白质可以与所期望的蛋白质的N末端侧、或C末端侧中的任何一端结合。此外，表达所期望的蛋白质时，在例如与大肠杆菌的细胞质相比，更适合在周质空间进行表达的情况下，可以使用用于靶向周质空间的前导序列。作为这样的前导序列， 有但不限于下述 PelB (Lei 等人(1987) J Bacteriol 169 :4379_4383)、OmpA(Gentry-Weeks 等人(1992) J Bacterioll74 7729-7742)等。当生物素结合性蛋白质融合蛋白从可溶级分得到时，可以不纯化粗蛋白质提取液，与生物素化担载体接触，由此使融合蛋白与生物素化担载体结合而结合后，对其进行充分地清洗，可以一次实现融合蛋白的纯化和在担载体上的固定化。或者，也使用结合有亚氨基生物素等(Hofmann 等人(1980) ProcNatl Acad Sci USA 77 4666-4668)生物素类似体的柱，进行纯化，然后与生物素化担载体结合。或者此外，可以在生物素结合性蛋白质融合蛋白的N末端或C末端进一步添加纯化用标签。作为这样的标签，认为有但不限于下述例如c-myc表位标签(Mimro和 Pelham(1986)Cell 46 :291_300)、组氨酸标签(Hochuli 等人(1988)Bio/Techno 1 6 1321-1325、Smith等人(1988) J Biol Chem 263:7211-7215)、他10标签仏08和100(1(2007) Methods Mol Biol 356 195—208)、Flag 标签(Einhauer 禾口 Jungbauer (2001) J Biochem Biophys Methods 49:455-465)等，或它们的组合。当融合蛋白从不溶级分得到时，可以使用公知的方法使用例如尿素、盐酸胍这样的离液盐(chaotropic salt)，使蛋白质溶解，在溶解后使用透析等，边缓慢除去离液盐， 边促进蛋白质的折叠(refolding) (Sano 和 Cantor (1991)Bio/Technology 9 :1378_1381、 Sano 等人(1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:1534-1538)。或者此外，所期望的蛋白质在大肠杆菌内表达为不溶级分时，可以采用例如与麦芽糖结合蛋白(Bach等人(2001) J Mol Biol 312 :79_93)、硫氧还蛋白(Jurado等人(2006) J Mol Biol 357 :49-61)、谷胱甘肽 S 转移酶(Tudyka 和 Skerra(1997)Protein Sci 6 2180-2187)、或 Ideno 等人(2004)Appl Microbiol Biotechnol 64 :99_105 所述的伴侣 (chaperon)类共表达，或者在融合蛋白上进一步融合伴侣制作3重融合蛋白。需要说明的是，麦芽糖结合蛋白、硫氧还蛋白、谷胱甘肽S转移酶可以作为纯化用标签来使用。作为融合蛋白的表达体系，利用昆虫细胞、植物细胞、哺乳类细胞、酵母细胞、枯草菌细胞、无细胞表达体系等其它公知的表达体系表达也可以。尤其是利用植物细胞表达融合对象蛋白质(例如植物凝集素等)时，还优选使用植物细胞的表达体系来表达该融合蛋白。本领域技术人员可以考虑融合对象蛋白质的性质来选择适当的表达体系。融合蛋白与担载体的结合
在本发明中，可以准备结合有生物素的担载体、生物素结合性蛋白质融合蛋白，并通过使两者接触，通过抗生物素蛋白_生物素结合使该蛋白质与担载体结合。虽不局限于此，按照总蛋白质浓度为0. lmg/ml 5mg/ml、优选为0. 2mg/ml 2mg/ml，准备包含生物素结合性蛋白质融合蛋白的细胞破碎粗提取液。使该提取液在 10°C 40°C、优选在20°C 30°C，与结合有生物素的担载体接触5分钟 2小时，优选接触 30分钟 1小时。或者此外，使纯化为0. 1 μ g/ml 5 μ g/ml浓度的生物素结合性蛋白质融合蛋白与结合有生物素的担载体接触。_■倾力口物雜口口口 (1阶工# 3)本发明的实施方式1的方法，在准备结合有 融合蛋白的担载体之后，作为工序3)， 包括将(a)生物学样品、以及(b-i)细胞破碎提取液和生物素结合性蛋白质，该细胞破碎提取液是由与用于表达工序1)的融合蛋白的宿主细胞相同种的细胞制备的细胞破碎提取液，或者(b-ii)由下述细胞制备的细胞破碎提取液，所述细胞是在与用于表达工序1)的融合蛋白的宿主细胞相同种的细胞中通过基因工程技术表达了生物素结合性蛋白质的细胞。混合后添加至工序2)制作的结合有融合蛋白的担载体中。通常地，在利用了担载体的检测方法中，已知有如下方法用于降低作为背景信号的原因的非特异性结合使细菌成分提取液包含在检测用试剂中的方法(日本特开昭 59-99257)；将下述宿主细胞的培养成分添加到样品中的方法，其中，该宿主细胞是导入有与用于生产与被检测物质特异性结合的重组蛋白质的载体同种的、且不含编码该蛋白质的基因的载体的宿主细胞(日本特开平8-43392)；对来自和生产与被检测物质特异性结合的重组蛋白质的细胞相同种、且不含该蛋白质的细胞的水提取液进行加热处理后，将其水溶性级分添加到样品中的方法(日本特开2004-301646)等。本发明人等，尝试将上述的方法用于融合蛋白体系，但未能获得充分的效果。然而，通过深入的研究，结果想出了可获得更显著效果的方法。具体来说，发现在使被检测样品与担载体接触时，优选使细胞破碎提取液、以及生物素结合性蛋白质这两者同时存在。在一个实施方式中，向生物学样品中混合添加由与用于表达融合蛋白的宿主细胞相同种的细胞制备的细胞破碎提取液、以及生物素结合性蛋白质。向被检测样品中添加生物素结合性蛋白质和细胞的破碎提取液时，可以先添加任何一种，或者可以同时添加。或者，将生物素结合性蛋白质和细胞的破碎提取液混合，然后添加到被检测样品中。在另一实施方式中，可以向被检测样品中添加细胞破碎提取液，该细胞破碎提取液是由下述细胞制备的细胞破碎提取液，所述细胞是在与用于表达融合蛋白的宿主细胞相同种的细胞中通过基因工程技术表达了生物素结合性蛋白质的细胞。具体来说可以使用 将生物素结合性蛋白质重组到表达载体中，并在细胞中表达重组蛋白质的该细胞的破碎提取液。在被检测样品为血清等的情况下，通常利用细胞破碎提取液将血清稀释10倍 10000倍，优选稀释100倍 1000倍，更优选稀释100倍 500倍。细胞破碎提取液来源的细胞，可以是大肠杆菌细胞、酵母细胞、哺乳类细胞、昆虫细胞、植物细胞等，没有特别地限制，优选与用于表达融合蛋白的宿主细胞相同种的细胞。 例如，在融合细胞是利用大肠杆菌制备的情况下，优选细胞破碎提取液也通过大肠杆菌来制备。此外，在通过无细胞系表达融合蛋白时，使用的细胞破碎提取液可以直接使用，或者可以将细胞破碎提取液悬浮在所期望的缓冲液中来使用。
更优选，细胞是优选与生物学样品来源的生物不同种的生物来源的细胞。例如，生物学样品是来源于人的样品时，优选，细胞破碎提取液通过人以外的生物来源的细胞来制备。但是，例如利用哺乳动物细胞来表达融合蛋白时，通常使用由特定的癌细胞等制备的培养细胞株。此时，由于人培养细胞株与生物学样品来源的(例如)生物体中的人细胞的内含物质在实质上有很大的不同，因此即使在使用人来源的培养细胞株的细胞破碎提取液的情况下，也能够获得本发明的效果。此外，用于制备细胞破碎提取液的细胞可以含有任意载体，优选含有空载体。空载体可以是，与用于表达被检测物质特异性结合的蛋白质或其融合蛋白时使用的载体相同种类、并且不含编码上述这些蛋白质的基因的载体，或者，例如可以是使这些空载体进一步含有任意核酸的任意的载体。此外，用于表达被检测物质特异性结合的蛋白质或其融合蛋白时使用的载体可以是无关联的公知的任意载体。作为细胞的破碎提取液，只要是细胞来源的成分即可，没有特别地限制，例如，可以使用其蛋白质成分、糖类成分、脂质成分或它们的混合成分。优选，可以使用细胞的可溶性提取物。对于作为细胞的破碎提取液的制备方法，没有特别地限制，可以使用各种方法。通常，可以如下制备利用适当的培养基培养的细胞，通过使用超声波等物理方法，或者利用了表面活性剂等的化学方法，或者酶处理等进行破碎或可溶化，以及离心分离或过滤等操作，从而得到可溶性成分。此外，为了延长保存寿命，优选向通过离心分离或过滤等澄清的液体中添加例如蛋白酶抑制剂，或实施高压灭菌处理等加热处理，对来源于细胞的各种酶等进行抑制或使其失活。细胞的破碎提取液的添加浓度，可以根据产生的非特异反应的强度来改变，可以适当地设定吸收该非特异反应的充分的浓度。作为制备细胞破碎提取液的具体方法的实例，虽不局限于此，例如在大肠杆菌细胞的情况下，可以将大肠杆菌(可以含有载体，而且载体可以含有编码生物素结合性蛋白质的基因)，接种到含抗生素的LB培养基中，在25°C 37°C振荡培养使0D600的吸光度达到0. 25 1，优选达到0. 4 0. 6，然后，添加0. ImM 5mM、优选0. 5mM ImM的IPTG，进一步，在25°C 37°C，进行2小时 24小时、优选进行4小时 16小时的振荡培养。对培养液进行离心回收菌体，将菌体悬浮到所期望的缓冲液中，然后破碎，离心破碎液，回收其上清作为大肠杆菌粗提取液。可以利用任意方法向担载体中添加生物学样品、以及细胞破碎提取液。但是，生物学样品与担载体接触之前，生物学样品必须与细胞破碎提取液接触。即，只要使生物学样品和细胞破碎提取液充分接触即可，不是必须最终将细胞破碎提取液来源的成分和生物学样品一起添加到担载体中。例如，可以制作结合有细胞破碎提取液成分的担载体，并在其中使用经处理的生物学样品。具体来说，可以举出使生物学样品通过细胞破碎提取液成分柱等的实施方式。在向生物学样品中混合细胞破碎粗提取液的情况下，虽不局限于此，使样品与通过所期望的缓冲液(可以含有BSA或酪蛋白、市售的封闭剂等)制备的总蛋白质浓度为 0. 05mg/ml 5mg/ml、优选为0. 5mg/ml 5mg/ml的细胞破碎粗提取液在10°C 30°C、优选在20°C 30°C反应30分钟 4小时、优选反应1小时 2小时。需要说明的是，当生物学样品为血清时，虽不局限于此，可以利用上述细胞破碎粗提取液稀释100倍 1000倍。向被检测样品添加牛物素结合件蛋白质作为本发明的特征之一，向生物学样品中混合由与用于表达融合蛋白的宿主细胞相同种的细胞制备的细胞破碎提取液、以及生物素结合性蛋白质，然后将混合物添加到担载体中(工序b_i)，或者 ，向被检测样品中混合细胞破碎提取液，然后将混合物添加到担载体中，所述细胞破碎提取液是由下述细胞制备的细胞破碎提取液，所述细胞是在与用于表达融合蛋白的宿主细胞相同种的细胞中通过基因工程技术表达了生物素结合性蛋白质的细胞(工序b-ii)。在本发明的方法中，通过向被检测样品中添加生物素结合性蛋白质，最终可以抑制背景信号。这样的生物素结合性蛋白质可以是与构成融合蛋白的生物素结合性蛋白质相同或不同的蛋白质。此外，可以是野生型也可以是突变体，与野生型相比，生物素结合能力可以是相同的，也可以更高，或可以更低。此外，作为添加的实施方式，可以直接添加生物素结合性蛋白质(可以是天然来源的，也可以是通过基因工程表达的蛋白质)的粉末，也可以溶解在适当的液体中然后添力口。此外，也可以为如下实施方式例如，不将生物素结合性蛋白质直接添加到样品中，通过固定有生物素结合性蛋白质的担载体，来处理样品和细胞破碎提取液的混合物(例如通过柱子)。(工序b_i)。在将生物素结合性蛋白质添加到细胞破碎粗提取液的情况下，虽不局限于此，添加生物素结合性蛋白质的浓度，以最终浓度计，为lyg/ml 500yg/ml、优选为IOyg/ ml 100μ g/ml。在通过基因工程在该细胞中表达生物素结合性蛋白质的情况下，关于生物素结合性蛋白质的浓度，也可以为同样的浓度，但虽不局限于此。或者，可以使用将编码生物素结合性蛋白质的基因导入宿主细胞中使其表达，并破碎该宿主细胞得到的包含生物素结合性蛋白质的细胞提取液(工序b-ii)。此时，生物素结合性蛋白质，在所期望的宿主中，可以通过本领域技术人员所公知的方法来表达，但通过基因工程表达与被检测物质特异性结合的蛋白质和生物素结合性蛋白质的融合蛋白时，优选与其宿主是相同种的。宿主为大肠杆菌时，将编码生物素结合性蛋白质的基因重组到表达载体中，并将该表达载体导入大肠杆菌，边诱导蛋白质表达，边进行大肠杆菌的培养。表达载体、宿主大肠杆菌株、培养基成分、IPTG浓度、培养温度等诱导条件可以适当选择。MM^JlT^^lllTffe ( ^MTf^ 1 的工序 4)本发明的检测方法、对与蛋白质结合的被检测物质进行检测，所述蛋白质是与融合蛋白中的待检测物质特异性结合的蛋白质。对被检测物质进行检测的方法，基于所期望的蛋白质的性质，本领域技术人员而可以适当地选择。作为优选的方法，可以列举酶结合免疫吸附测定法(包括ELISA、 Sandwich ELISA法)、放射免疫分析法(RIA)等免疫测定法、核酸杂交测定法、表面等离子共振法等这样的分析法。使通过抗生物素蛋白-生物素结合固相化、与被检测物质特异地结合/相互作用的物质，与被检测样品反应，然后对该被检测物质进行检测。 在免疫测定中，例如待测定物质为抗体时，将抗原固相化、使存在于被检测样品中的抗体与抗原反应，利用本领域技术人员公知的方法进行检测。例如被检测样品为来源于人的物质时，使用抗人抗体来对与抗原结合的人抗体进行检测。此时，该抗人抗体，通过预先用荧光、酶、或放射性同位素进行标记，可以通过测定最终的荧光量、酶活性、或放射性量，来间接地对于抗体的量进行测定、定量。此外，待测定的物质为抗原时，将针对于该抗原的某一部分(表位)的抗体固相化，然后使其与存在于被检测样品中的抗原发生反应。然后，进一步使其与针对该抗原的其它表位的抗体发生反应。将该针对于其它表位的二次抗体如上述所示预先进行标记后，可以间接地测定出抗原的量。或者此外，在核酸杂交测定中，使用抗生物素蛋白-生物素结合，将具有与待测定的核酸互补的序列区域的数十 数百、或数千碱基的核酸固相化。在此与含有预先经过荧光、放射性同位素标记的核酸的被检测样品反应，测定荧光量、放射性量。上述标记只要是通过本领域技术人员所公知的方法进行即可，此外可以使用市售的、由荧光、酶标记的抗人抗体等。作为荧光标记，还可以考虑例如通过荧光素及罗丹明等标记、GFP等荧光蛋白进行标记。作为酶标记，可以利用过氧化物酶、碱性磷酸酶或荧光素酶、葡萄糖氧化酶等，但并不限于上述这些酶。用于通过这些酶测定的基质是市售的，例如为过氧化物酶时，可以使用TBA、化学发光法用的基质。此外，作为放射性同位素，可以举出例如碘(1251、1211)、碳(14C)、硫(35S)、以及氣(3H),为核酸时，可以举出磷(32P)等。生物学样品(sample)中存在的抗原、抗体的量，可以使用例如直线回归计算机算法，通过与标准的制备物(例如为临床样本时，健康人的标准样品或者典型患者的标准样品)中存在的量进行比较可以简单地算出。用于检测抗原、抗体的这样的测定法，例如，关于 ELISAjn Iacobelli 等人，Breast Cancer Research and Treatment 11 :19—30 (1988) 中所记载。或者，例如，当生物学样品中的待检测物质，例如抗体较少时(抗体效价较低时)、 或者当血清等生物学样品其本身非特异结合较多时，由于非特异性结合导致的背景信号的影响增大。为此，通过从测定值中适当地减去背景信号，可以更为正确地对想要检测的物质进行测定。本领域技术人员能够根据实验体系适当地判断所减去的背景。例如，作为这样的实施方式的例子，有对抗血清中存在的胶原的抗体进行检测的 “人/猴抗I型及II型胶原IgG抗体测定试剂盒”(Chondrex公司制造)。就该试剂盒而言，从样品测定值中减去背景值(不添加血清，仅由二次抗体得到的测定值)来计算。此外，如血清，生物学样品本身中非特异的结合较多的情况下，为了减去由这样的非特异反应产生的背景，如实施例2所述，从固定化有SITH-I抗原(与待检测物质特异性结合的蛋白质)和tamavidin的融合蛋白的担载体(板)的测定值中，减去未固定化SITH-I 抗原的区域(但是与固定化有SITH-I抗原的区域同样，进行利用BSA等的封闭操作，并且添加包含抗SITH-I抗体(生物学样品中想要检测的物质)的血清(生物学样品)的区域)的测定值的实施方式也是有效的。或者，如实施例2或实施例3所述，可以从固定化有SITH-I抗原和tamavidin的融合蛋白的担载体(板或磁珠)的测定值中，减去仅固定化 (结合)有tamavidin的担载体的测定值来进行计算。
作为用于从样品中减去固有的非特异反应的实施方式的进一步的实例，如上述的 “人/猴抗I型及II型胶原IgG抗体测定试剂盒”一样，有时也有从使用固定化有胶原的微滴定板的孔的血清中胶原抗体的测定值中，减去未固定化胶原的孔的测定值的情况。另外， 作为采取类似实施方式的试剂盒，有用于血清或血浆中的抗单纯疱疹病毒IgM型抗体的检测的“病毒抗体EIA ‘生研’疱疹IgM” (Denka生研公司制造)。此外，优选如下实施方式通过减去固定化有该样品的来源生物(例如、SITH-I的情况下，来源生物为人)不具有的抗体的任意蛋白质(虽不局限于此，上述生物为哺乳类时，可以举出例如GFP等)区域的测定值，可以更正确地求出。对于作为固相化的方法，没有特别地限制，优选制作与生物素结合性蛋白质的融合蛋白，并通过生物素-抗生物素蛋白结合而固相化在生物素化担载体上。以上这样的计算方法，本领域技术人员可以根据生物学样品的性质、使用的抗体的特征等适当地设计并进行选择。

本发明的检测方法，优选能够特异地对血清中的抗体效价低的抗体进行检测。本发明的实施方式1的效果，例如可以通过如下实施方式来理解对实施例2的图3-1的TM2/pTrc99A/BL21细胞破碎提取液(黑色三角)的结果，与PBS (白色方块)或 pTrc99A/BL21细胞破碎提取液(黑色圆圈)的结果进行比较。另外，可以通过对实施例3 的表3的TM2/pTrc99A导入的BL21粗提取液的S/N比，与PBS或pTrc99A导入的BL21细胞破碎提取液的S/N比进行比较来理解。II.本发明的检测方法(实施方式2)本发明的检测方法(实施方式2)是对生物学样品中的物质进行检测的方法，其包括1)准备融合蛋白以及结合有生物素的担载体，所述融合蛋白是与待检测物质特异性结合的蛋白质和生物素结合性蛋白质的融合蛋白；2)通过生物素-生物素结合性蛋白质之间的结合，使工序1)准备的担载体与融合蛋白结合，从而制作结合有融合蛋白的担载体；3)使工序2)制作的结合有融合蛋白的担载体与生物素结合性蛋白质接触，从而进行担载体的封闭；4)在工序3)的封闭工序后，向结合有融合蛋白的担载体添加生物学样品，然后，5)对与蛋白质结合的被检测物质进行检测，所述蛋白质是与融合蛋白中的待检测物质特异性结合的蛋白质。在本发明的实施方式2的方法中，工序1及2的，结合有融合蛋白的担载体的制备方法与实施方式1同样。此外，最后的对与和融合蛋白中的待检测物质特异性结合的蛋白质结合的被检测物质进行检测的工序(实施方式1的工序4、实施方式2的工序5)也是同样的。实施方式2的方法，以在向担载体添加生物学样品之前，进行担载体的封闭工序 (实施方式2的工序3)为特征。在本发明中，就结合有融合蛋白的担载体而言、在向担载体添加生物学样品之前， 进一步通过使生物素结合性蛋白质与担载体接触，可以更有效地抑制背景信号。并不受理论的约束，可以认为这是因为，在担载体表面上，未与融合蛋白结合的、游离的状态(free)的生物素部分与生物素结合性蛋白质结合(图1)。与结合担载体接触的生物素结合性蛋白质可以与构成融合蛋白的生物素结合性蛋白质可以相同或不同。此外，可以为野生型也而可以为突变体。生物素结合能力与野生型相比，可以同等，也可以更高或更低，优选为同等或为野生型以下。虽不局限于此，可以是例如比野生型蛋白质的生物素结合能力低，并且与生物素的解离常数(KD)小于10_5( M)的蛋白质。为了制作这样的生物素结合蛋白质，有进行化学修饰的方法(US-A-5051356)等， 最优选修饰氨基酸序列的方法(Qureshi等人(2002) J. Biol. Chem.、276、46422_46428)。在本发明中，在生物素结合性蛋白质与结合担载体接触时，对于其方法没有特别限制。即，可以直接添加生物素结合性蛋白质，也可以溶解在适当的液体中并与担载体接触。另外，可以同时使用BSA或酪蛋白等本领域技术人员公知的封闭剂。虽不局限于此，向所期望的缓冲液(例如含有0. 02% 1%、优选0. 1 0. 5%浓度的Tween-20或Triton的TBS或PBS)中添加最终浓度为1 μ g/ml 500 μ g/ml、优选为 10 μ g/ml 100μ g/ml的生物素结合性蛋白质。此外，还可以向其中添加最终浓度1 μ g/ ml 50 μ g/ml、优选为5 μ g/ml 10 μ g/ml的BSA或酪蛋白。该封闭溶液，在10°C 40°C， 优选在20°C 30°C，与下述担载体接触10分钟 2小时、优选接触30分钟 1小时，所述担载体，通过抗生物素蛋白_生物素结合与生物素结合性蛋白质融合蛋白结合。本发明实施方式2的效果通过例如如下实施方式来理解实施例2中，对抗体为0 时的图3-1和图3-2的pTrc99A/BL21细胞破碎提取液(黑色圆圈)的值进行比较。抗体为0时，由于不存在抗体，假设不存在非特异的结合，荧光应该为0。在此，对图3-1和图3-2 的抗体0时的黑色圆圈之间进行比较，在通过TM2进行担载体的封闭时，荧光值下降将近一半，可以认为非特异的结合大幅降低。此外，在通过TM2进行了担载体的封闭的图3-2中， 与图3-1相比，图表整体向下方移动。另外，就实施例2的表2的pTrc99A/BL21细胞破碎提取液的结果而言，也可以通过对“通过BSA的封闭”的值和“通过BSA和TM2封闭”的值进行比较来理解。III.本发明的检测方法(实施方式3)本发明的检测方法(实施方式3)是对生物学样品中的物质进行检测的方法，其包括一种对生物学样品中的物质进行检测的方法，其包括1)准备融合蛋白以及结合有生物素的担载体，所述融合蛋白是与待检测物质特异性结合的蛋白质和生物素结合性蛋白质的融合蛋白；2)通过生物素-生物素结合性蛋白质之间的结合，使工序1)准备的担载体与融合蛋白结合，从而制作结合有融合蛋白的担载体；3)使工序2)制作的结合有融合蛋白的担载体与生物素结合性蛋白质接触，从而进行担载体的封闭；4)在工序3)的封闭工序后，将(a)生物学样品，以及 (b-i)细胞破碎提取液和生物素结合性蛋白质，该细胞破碎提取液是由与用于表达工序1)的融合蛋白的宿主细胞相同种的细胞制备的细胞破碎提取液，或者
(b-ii)由下述细胞制备的细胞破碎提取液，所述细胞是在与用于表达工序1)的融合蛋白的宿主细胞相同种的细胞中通过基因工程技术表达了生物素结合性蛋白质的细胞混合后添加至结合有融合蛋白的担载体中；然后，5)对与蛋白质结合的被检测物质进行检测，所述蛋白质是与融合蛋白中的待检测物质特异性结合的蛋白质。实施方式3是组合了实施方式1和实施方式2的实施方式。具体来说，是进行了实施方式1的细胞破碎提取液及生物素结合性蛋白质的添加，和实施方式2的通过生物素结合性蛋白质进行担载体的封闭这两者的实施方式。本发明实施方式3的效果，可以通过例如以下实施方式来理解对实施例2中的图3-2的TM2/pTrc99A/BL21细胞破碎提取液(黑色三角)的结果，与图3_1、图3_2中的其它结果，例如PBS(白色方块)的结果进行比较。另外，在实施例4中，通过对表5的TM2/ pTrc99A导入的BL21粗提取液的S/N比，与其它结果，即PBS、大肠杆菌(BL21)或pTrc99A 导入的BL21细胞破碎提取液的S/N比进行比较来理解。IV.结合有融合蛋白的担载体此外，本发明提供用于对生物学样品中的物质进行检测的担载体。即本发明的担载体，其特征在于，其通过生物素_生物素结合性蛋白质之间的结合与融合蛋白结合，所述融合蛋白是与待检测物质特异性结合的蛋白质和生物素结合性蛋白质的融合蛋白，所述用于对生物学样品中的物质进行检测的担载体通过下述方法制备1)准备融合蛋白以及结合有生物素的担载体，所述融合蛋白是与待检测物质特异性结合的蛋白质和生物素结合性蛋白质的融合蛋白；2)通过生物素-生物素结合性蛋白质之间的结合，使工序1)准备的担载体与融合蛋白结合，从而制作结合有融合蛋白的担载体；3)使工序2)制作的结合有融合蛋白的担载体与生物素结合性蛋白质接触，从而进行担载体的封闭。这样一来，本发明的担载体，优选通过抗生物素蛋白-生物素结合，与和待检测物质特异性结合的蛋白质和生物素结合性蛋白质的融合蛋白结合，另外，担载体上未反应的生物素，通过抗生物素蛋白-生物素结合，与生物素结合性蛋白质结合。VII.试剂盒此外，本发明提供用于对生物学样品中的物质进行检测的试剂盒。本发明的试剂盒包含A)通过生物素_生物素结合性蛋白质之间的结合而与融合蛋白结合的担载体，所述融合蛋白是与待检测物质特异性结合的蛋白质和生物素结合性蛋白质的融合蛋白，以及用于稀释生物学样品的包含下述Β-i)或者B-ii)和/或的试剂；B-i)细胞破碎提取液和生物素结合性蛋白质，所述细胞破碎提取液是由与用于表达A)的融合蛋白的宿主细胞相同种的细胞制备的细胞破碎提取液，或者B-ii)由在与用于表达Α)的融合蛋白的宿主细胞相同种的细胞中通过基因工程技术表达了生物素结合性蛋白质的细胞制备的细胞破碎提取液；和/或C)含生物素结合性蛋白质的封闭剂。用于稀释生物学样品的试剂，可以是细胞破碎提取液(及生物素结合性蛋白质) 本身，或将细胞破碎提取液与生物学样品一起进一步稀释的试剂，可以包括适当的缓冲液、市售的细胞稀释液或血清稀释液等溶剂。实施例以下，通过实施例对本发明进行具体地说明，但这些实施例不是用于限定本发明的技术范围。本领域技术人员依据本说明书的记载可以容易地对本发明进行修饰/变更， 这些也包含在本发明的技术范围内。

在本实施例1、2中，利用大肠杆菌表达来源于人疱疹病毒6 (HHV-6)的SITH-I蛋白质和tamavidin 2的融合蛋白，使通过超声波破碎得到的大肠杆菌粗提取液直接与生物素化微孔板反应，融合蛋白通过tamavidin-生物素结合被固定化。这样得到的SITH-I板， 与利用大肠杆菌粗提取液稀释的人血清(包含兔子抗SITH-I抗体。在本试验中，作为模拟临床样本，使用了向市售的人血清中加入逐级稀释的兔子的抗SITH-I抗体(抗血清)而得到的血清)反应，对人血清中包含的抗SITH-I抗体量进行了测定。实施例1SITH-1基因和tamavidin 2的融合蛋白表汰用载体的构津在本实施例中，设计了编码在SITH-I的C末侧以接头为中介设置有tamavidin 2(以下，称为TM2)的融合蛋白的基因。1-1.引物的设计为了构建SITH1-TM2融合基因，首先，设计了用于以接头(5x1 inker GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS) (SEQ ID NO 18)为中介将 SITH-1 和 TM2 两个基因融合的引物。S卩，设计了如下引物由编码在5’侧的SITH-I的C末端部位、在中央的接头、在3’ 侧的TM2的N末端部位的DNA序列构成的引物(SITHlC-5xlink-TM2N-F) (SEQ ID N0:19)、 由逆向编码在5’侧的TM2的N末端部位、接头、在3’侧的SITH-I的C末端部位的DNA序列构成的引物(SITHlC-5xlink-TM2N-R) (SEQ ID NO :20)。接下来，设计了包括SITH-I的N末端部位的5’部分和在其上游设置有EcoR I 限制性内切酶切断位点(CCATGG)的引物(SITH15，EcoRI-F(SEQ IDNO :21))，以及由编码 TM2基因的3’部分和在其下流的BamH I限制性内切酶切断位点(GGATCC)序列构成的引物 (TM2CtermBam) (SEQ ID NO 22)。将用于构建SITH-I和TM2的融合基因的引物总结于表1中。[表1]用于构建SITH-I和TM2的融合基因的引物
名称__长度
SITHl 5，EcoRI-FAAAGAATTCGGATATGAAGAAAAAGTGTC 29 mer
SITHlC-5xlink-TM2N-F CCGAAAACTGAAATGAATGTGggtggcggtggcagc 117 mer
ggtggcggtggcagcggtggcggtggcagcggtggcggtggcagcgg tggcggtggcagcTCAGACGTTCAATCTTCACTC SITHlC-5xlink-TM2N-R GAGTGAAGATTGAACGTCTGAgctgccaccgccacc 117 mer
gctgccaccgccaccgctgccaccgccaccgctgccaccgccaccgct gccaccgccaccCACATTCATTTCAGTTTTCGG TM2CtermBamTTTGGATCCTTACTTCAACCTCGGTGCG28 mer限制性内切酶识别位点用下划线表示。接头序列用小写字体表示。1-2. PCR
为了构建SITH1-TM2融合基因，进行了二阶段PCR。
第一阶段的PCR，分别进行如下扩增以重组有SITH-I基因(ORF) (SEQID NO 2)的FLAG表达载体(SIGMA)质粒作为模板，使用引物SITH15，EcoRI-F和 SITHlC-5xlink-TM2N-R，扩增了 SITH-I位点，此外，以重组有TM2基因的载体pTrc99A质粒 (W002/072817)作为模板,使用引物 SITHlC-5xlink-TM2N_F和 TM2CtermBam，进行了 TM2 位点的扩增。PCR反应条件为向20 μ 1的反应液中，添加500ng模板DNA、2 μ 1的IOXExTaq buffer(TaKaRa 公司)、1. 6μ 1 的 2. 5mM dNTP、各 20 皮摩尔的引物、0. 1 μ 1 的 5U/μ 1 Ex Taq,使用 GeneAmp PCR System 9600 (PERKINELMER)，进行 96°C、3 分钟、1 次；95°C、1 分钟， 60°C、1分钟，72°C、2分钟，20次；72°C、6分钟、1次。结果，在SITH-1部分得到579bp的PCR 产物，在TM2部分得到528bp的PCR产物。这些PCR产物，在TAE缓冲液中，使用琼脂糖凝胶电泳进行分级。分别切出各PCR产物的凝胶，使用QIAEX II凝胶提取试剂盒(QIAGEN)， 分别回收这些产物。提取方法按照试剂盒所述的说明书进行。以上述两个PCR产物作为模板，使用引物SITH15，EcoRI-F和TM2CtermBam进行第二阶段的PCR。反应条件为向20 μ 1的反应液中添加各500ng的模板DNA、2 μ 1的 IOXPyrobest buffer (TaKaRa公司)、1. 6 μ 1 的 2. 5mM dNTP、各 20 皮摩尔的引物、0. 1 μ 1 的 5U/ μ IPyrobest DNA 聚合酶，使用 GeneAmp PCR System 9600 (PERKIN ELMER)，进行 96°C、 3分钟、1次；95°C、1分钟，60°C、1分钟，72°C、2分钟，20次；72°C、6分钟、1次。结果得到 990bp的PCR产物。1-3.克隆将通过PCR得到的SITH1-TM2融合基因克隆到载体pCR4Blunt TOPO(Invitrogen 公司制造)中。具体来说，首先，按照载体试剂盒所附的说明书，进行连接反应(ligation)。使用电穿孔法将DNA导入到大肠杆菌TBl中，按照通常方法(Sambrook等人1989，Molecular Cloning, A laboratory manual, 2nd edition)提取质粒DNA。对于确认到插入物存在的质粒，使用 M13 引物(TaKaRa 公司)、ABI PRISM 荧光测序仪(Model 310 Genetic Analyzer, Perkin Elmer公司)，对碱基序列进行测序，并与设计的基因序列进行比较，从而确认了无突变。重组有融合基因的质粒通过EcoRI和BamHI进行双重消化，按照与上述同样的方法进行琼脂糖凝胶电泳和纯化，并回收了 DNA片段。使用连接试剂盒(TaKaRa公司制造)，连接该片段和预先用EcoRI和BamHI消化的大肠杆菌用表达载体pTrc99A(Pharmacia公司制造)。将连接产物转化到大肠杆菌TBl中，提取质粒DNA，并进一步转化到大肠杆菌BL21中。 以得到的大肠杆菌菌落作为模板，使用SITH15，EcoRI-F和TM2CtermBam，通过PCR进行插入基因部位的扩增，以确认插入基因的有无。如上所述，完成了 SITH-I和TM2的融合蛋白表达用载体SITHl_TM2/pTrc99A。编码表达用载体SITHl-TM2/pTrc99A中的SITH1-TM2的碱基序列如SEQ ID NO :23所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID N0:24所示。就SITH1-TM2而言，在5'侧，因为使用EcoRI位点重组至pTrc99A中，在翻译起始的蛋氨酸后添加有两个氨基酸残基(SEQ ID NO 23的碱基编号4_9、SEQ ID NO 24的氨基酸残基编号2-3)。接下来，接续有SITH-I的序列(SEQ ID NO 23的碱基编号10-483、SEQID NO :24 的氨基酸残基编号 4-161)、5xlinker(SEQ ID NO :23 的碱基编号 484_558、SEQ ID NO 24的氨基酸残基编号162-186)、TM2的序列(除去了 Met后的序列)(SEQ ID NO 23的碱基编号559-981、SEQ ID NO 24的氨基酸残基编号187-326)。

1-4.大肠杆菌表达将导入了 SITHl-TM2/pTrc99A的大肠杆菌BL21接种到含抗生素氨苄青霉素(最终浓度100 μ g/ml)的50ml LB培养基中，在30°C振荡培养直到0D600的吸光度达到0. 5。 然后，添加ImM IPTG，再于30°C进行5小时振荡培养。离心50ml培养液回收菌体。将菌体悬浮在0. lMHEPES/K0H(pH7. 4) 3ml中，进行超声波破碎。将破碎液进行离心(15000rpm)，将该上清作为大肠杆菌粗提取液。为了确认TM2融合SITH-I蛋白质的表达，利用SDS-PAGE 将粗提取液中含有的蛋白质分级，通过免疫印迹法解析。将兔子抗SITH-I抗体(纯化利用大肠杆菌表达的SITH-1，并用来对兔子进行免疫从而制作的抗SITH-I抗体(抗血清))和碱性磷酸酶标记抗兔子IgG抗体(BIO RAD公司制造)分别稀释1000倍用于检测SITH-1。结果如图2所示。由表达ΤΜ2融合SITH-I的大肠杆菌中检测到在35kDa附近的带(band)。该大小与TM2融合SITH-I的分子量34. 8kDa基本一致。此外,关于导入有pTrc99A、TM2/pTrc99A的大肠杆菌BL21 (Takakura等人(2009) FEBS J. 276 1383-1397)，与上述同样，在IPTG的存在下进行培养，然后制备大肠杆菌粗提取液。实施例2诵i寸ELISA对人血清存在下的杭SITH-I杭体讲行检测丨利用0. IM HEPES/K0H(pH7. 4)稀释实施例1得到的表达了 TM2融合SITH-1的大肠杆菌粗提取液，使其成为总可溶性蛋白质2mg/ml，向生物素板(Sumitomo Bakelite公司制造)的每个孔中分别添加100μ1。在室温下静置1小时，通过tamavidin-生物素结合将TM2融合SITH-I蛋白质与生物素板固定化。然后，利用含0. 1% Tween20的TBS缓冲液 (TBST)对板的各孔清洗3次，向各孔中添加250 μ 1的5 μ g/ml BSA/TBST溶液或50 μ g/ml 纯化TM2/5 μ g/ml BSA/TBST溶液，在室温下静置1小时，进行封闭。然后，利用TBST清洗各孔3次。接下来，利用PBS或实施例1-4制备的总可溶性蛋白质5mg/ml的pTrc99A导入的大肠杆菌粗提取液、或总可溶性蛋白质5mg/ml的TM2/pTrc99A导入的大肠杆菌粗提取液将人血清(Human Serum pool, Cosmo-Bio公司制造)稀释100倍得到溶液，向该溶液中添加兔子抗SITH-I抗体(抗血清)，该兔子抗SITH-I抗体(抗血清)是经逐级稀释成体积比为0. 002,0. 001,0. 0005,0. 00025的兔子抗SITH-1抗体(抗血清)，向固定化有TM2融合 SITH-I的板的每个孔中分别添加100 μ 1，在室温下反应1小时。兔子抗SITH-I抗体(抗血清)的血清中抗体效价与典型的抑郁症(情绪障碍)患者的血清中的抗SITH-I抗体效价相比，推定高约50倍左右。因此，按照体积比1/50的量， 向市售(健康人)的人血清中混合兔子抗SITH-I抗体(抗血清)，可考虑将其作为典型的抑郁症患者血清的模拟样本。由此，上述的抗体稀释率，可以认为与将抑郁症患者血清稀释约10倍 80倍的情况为同等水平。作为对照，分别设置了如下两个区域对没有进行任何固定化的生物素板，仅通过上述BSA进行封闭的区域、和通过BSA和ΤΜ2进行的封闭这两种封闭操作的区域。需要说明的是，在利用包含tamavidin溶液进行封闭操作的情况下，由于封闭溶液中的tamavidin的一部分与板上的生物素特异地结合，可以认为与利用了 tamavidin固定化板的体系处于相同的状态。然后，与上述同样地，分别添加100 μ 1向利用PBS溶液、pTrc99A导入的或ΤΜ2/ pTrc99A导入的大肠杆菌粗提取液(总可溶性蛋白质5mg/ml)稀释100倍的人血清中添加逐级稀释的兔子抗SITH-I抗体所得到的混合物，在室温下反应1小时。在人血清存在下， 使兔子抗SITH-I抗体与TM2融合SITH-I反应，然后利用TBST清洗3次。然后，为了分别检测通过tamavidin固定化在板上的SITH-1、反应/结合后的兔子抗SITH-I抗体、以及被认为各孔中非特异地结合的血清中的人IgG，各添加100 μ 1分别利用TBST稀释5000倍的辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG抗体、以及过氧化物酶标记羊抗人IgG抗体的混合溶液，在室温下静置1小时。然后，利用TBST清洗3次，对过氧化物酶活性进行检测。活性通过下述方法测定向各孔分别加入100 μ 1的SuperSignal ELISA Pico Chemiluminescent Substrate (PIERCE)，在室温下静置5分钟，然后通过酶标仪(plate reader) Infinite M200 (TECAN公司制造)对发光量进行测定。

需要说明的是，作为数据，同时进行在兔子抗SITH-I抗体的分别的各浓度区域、 对照区(未固定有TM2融合SITH-1，进行利用BSA或BSA和TM2的封闭操作，并且经含各浓度的抗SITH-I抗体的人血清处理的区域)的各发光量的测定，从固定化有TM2融合SITH-I 的区域的发光量的值中减去该对照区的值。并将其作为血清中所含有的抗SITH-I抗体的检测量。向血清中添加大肠杆菌破碎提取液对非特异性结合所产生的效果、通过TM2进行封闭对非特异性结合所产生的效果的结果如图3所示。在图3中，利用PBS将血清稀释100 倍的区域由白色方块表示，利用仅具有表达载体的大肠杆菌破碎提取液将血清稀释100倍的区域由黑色圆圈表示，利用表达TM2的大肠杆菌破碎提取液将血清稀释100倍的区域由黑色三角表示。各图表的纵轴(荧光量)表示抗SITH-I抗体的检测量，横轴表示逐级稀释的抗SITH-I抗体的稀释比例。图3-1示出在未通过生物素结合性蛋白质(TM2)进行封闭的情况下，人血清用 PBS(白色方块)、pTrc99A导入的大肠杆菌粗提取液(黑色圆圈)、或TM2/pTrc99A导入的大肠杆菌粗提取液(黑色三角)稀释时，血清中抗SITH-I抗体量的检测结果。图3-2示出在通过生物素结合性蛋白质(TM2)进行封闭的情况下，人血清用 PBS(白色方块)、pTrc99A导入的大肠杆菌粗提取液(黑色圆圈)、或TM2/pTrc99A导入的大肠杆菌粗提取液(黑色三角)稀释时，血清中抗SITH-I抗体量的检测结果。另外，为了对封闭的效果、各血清稀释液的效果进行比较，利用下述方法计算出S/ N比。S/N比=在各浓度条件下添加抗SITH-I抗体的区域的抗SITH-I抗体检测量/未添加抗SITH-I抗体的区域的抗SITH-I抗体检测量因此，S/N比越大表示检测灵敏度越高。各区域的S/N比的计算结果如表2所示。[表 2]
权利要求
1.一种对生物学样品中的物质进行检测的方法，其包括1)准备融合蛋白以及结合有生物素的担载体，所述融合蛋白是与待检测物质特异性结合的蛋白质和生物素结合性蛋白质的融合蛋白；2)通过生物素-生物素结合性蛋白质之间的结合，使工序1)准备的担载体与融合蛋白结合，从而制作结合有融合蛋白的担载体；3)将(a)生物学样品、以及(b-i)细胞破碎提取液和生物素结合性蛋白质，该细胞破碎提取液是由与用于表达工序1)的融合蛋白的宿主细胞相同种的细胞制备的细胞破碎提取液，或者(b-ii)由下述细胞制备的细胞破碎提取液，所述细胞是在与用于表达工序1)的融合蛋白的宿主细胞相同种的细胞中通过基因工程技术表达了生物素结合性蛋白质的细胞；混合后添加至由工序2)制作的结合有融合蛋白的担载体中；然后，4)对与蛋白质结合的被检测物质进行检测，所述蛋白质是与融合蛋白中的待检测物质特异性结合的蛋白质。
2.—种对生物学样品中的物质进行检测的方法，其包括1)准备融合蛋白以及结合有生物素的担载体，所述融合蛋白是与待检测物质特异性结合的蛋白质和生物素结合性蛋白质的融合蛋白；2)通过生物素-生物素结合性蛋白质之间的结合，使工序1)准备的担载体与融合蛋白结合，从而制作结合有融合蛋白的担载体；3)使工序2)制作的结合有融合蛋白的担载体与生物素结合性蛋白质接触，从而进行担载体的封闭；4)在工序幻的封闭工序后，向结合有融合蛋白的担载体添加生物学样品，然后，5)对与蛋白质结合的被检测物质进行检测，所述蛋白质是与融合蛋白中的待检测物质特异性结合的蛋白质。
3.—种对生物学样品中的物质进行检测的方法，其包括1)准备融合蛋白以及结合有生物素的担载体，所述融合蛋白是与待检测物质特异性结合的蛋白质和生物素结合性蛋白质的融合蛋白；2)通过生物素-生物素结合性蛋白质之间的结合，使工序1)准备的担载体与融合蛋白结合，从而制作结合有融合蛋白的担载体；3)使工序2)制作的结合有融合蛋白的担载体与生物素结合性蛋白质接触，从而进行担载体的封闭；4)在工序幻的封闭工序后，将(a)生物学样品，以及(b-i)细胞破碎提取液和生物素结合性蛋白质，该细胞破碎提取液是由与用于表达工序1)的融合蛋白的宿主细胞相同种的细胞制备的细胞破碎提取液，或者(b-ii)由下述细胞制备的细胞破碎提取液，所述细胞是在与用于表达工序1)的融合蛋白的宿主细胞相同种的细胞中通过基因工程技术表达了生物素结合性蛋白质的细胞；混合后添加至结合有融合蛋白的担载体中；然后，5)对与蛋白质结合的被检测物质进行检测，所述蛋白质是与融合蛋白中的待检测物质特异性结合的蛋白质。
4.根据权利要求1或3所述的方法，其中，在权利要求1的工序3(b-i)或权利要求3的工序4(b_i)中，添加由含任意载体的细胞提取的细胞破碎提取液作为细胞破碎提取液。
5.根据权利要求1 4中的任一项所述的方法，其中，生物素结合性蛋白质是 tamavidin或其突变体。
6.根据权利要求1 5中任一项所述的方法，其中，生物学样品选自血液、血清、脑脊髓液、唾液、汗、尿、泪、淋巴液以及母乳。
7.一种用于检测生物学样品中的物质的担载体，其通过生物素-生物素结合性蛋白质之间的结合与融合蛋白结合，所述融合蛋白是与待检测物质特异性结合的蛋白质和生物素结合性蛋白质的融合蛋白，所述用于检测生物学样品中的物质的担载体通过下述方法制备1)准备融合蛋白以及结合有生物素的担载体，所述融合蛋白是与待检测物质特异性结合的蛋白质和生物素结合性蛋白质的融合蛋白；2)通过生物素-生物素结合性蛋白质之间的结合，使工序1)准备的担载体与融合蛋白结合，从而制作结合有融合蛋白的担载体；3)使工序2)制作的结合有融合蛋白的担载体与生物素结合性蛋白质接触，从而进行担载体的封闭。
8.一种用于对生物学样品中的物质进行检测的试剂盒，其包含A)通过生物素-生物素结合性蛋白质之间结合而与融合蛋白结合的担载体，所述融合蛋白是与待检测物质特异性结合的蛋白质和生物素结合性蛋白质的融合蛋白，以及用于稀释生物学样品的包含下述B-i)或者B-ii)的试剂；B-i)细胞破碎提取液和生物素结合性蛋白质，所述细胞破碎提取液是由与用于表达 A)的融合蛋白的宿主细胞相同种的细胞制备的细胞破碎提取液，或者B-ii)由在与用于表达Α)的融合蛋白的宿主细胞相同种的细胞中通过基因工程技术表达了生物素结合性蛋白质的细胞制备的细胞破碎提取液；和/或C)含生物素结合性蛋白质的封闭剂。
全文摘要
本发明涉及对生物学样品中的物质进行检测的方法、该方法中使用的担载体以及试剂盒。本发明的方法，在其一个实施方式中，包括1)准备融合蛋白以及结合有生物素的担载体，所述融合蛋白是与待检测物质特异性结合的蛋白质和生物素结合性蛋白质的融合蛋白；2)通过使工序1)准备的担载体与融合蛋白结合，从而制作结合有融合蛋白的担载体；3)向工序2)制作的结合有融合蛋白的担载体混合添加将(a)生物学样品、以及(b-i)细胞破碎提取液和生物素结合性蛋白质，该细胞破碎提取液是由与用于表达工序1)的融合蛋白的宿主细胞相同种的细胞制备的细胞破碎提取液，或者(b-ii)由下述细胞制备的细胞破碎提取液，所述细胞是在与用于表达工序1)的融合蛋白的宿主细胞相同种的细胞中通过基因工程技术表达了生物素结合性蛋白质的细胞；混合后添加至工序2)制作的结合有融合蛋白的担载体中；然后，4)对与蛋白质结合的被检测物质进行检测，所述蛋白质是与融合蛋白中的待检测物质特异性结合的蛋白质。
文档编号C12N15/09GK102439447SQ20108001958
公开日2012年5月2日 申请日期2010年3月2日 优先权日2009年3月2日
发明者冈直美, 近藤一博, 高仓由光 申请人:日本烟草产业株式会社