一种快速检测鉴定沙雷菌属的PCR方法与流程

本发明设计分子生物学检测鉴定领域，具体涉及一种快速检测鉴定沙雷菌属的PCR方法。

背景技术：

沙雷菌在分类上属肠杆菌科( Enterobacteriaceae)、沙雷菌属（Serratia）。沙雷菌属现有包括黏质沙雷菌（S．marcescens）、居泉沙雷菌（S．fonticola）、液化沙雷菌（S．liquefaciens）等14个种，两个亚种。在医学领域，沙雷菌属的各个种主要引起医院院内感染。其中黏质沙雷菌和液化沙雷菌被列入我国卫生部制定的《人间传染的病原微生物名录》(2006)，危害程度属第三类。沙雷菌广泛分布于水、土壤、植物、人类以及动物的肠道和呼吸道中，是空气中的条件致病菌。该菌长期以来被认为对人体无害，但由于其具有侵袭性并对许多常用抗生素有耐药性，已成为一种重要的病原菌，可引起人的肺炎、泌尿道感染、败血症和外科手术感染等。在兽医领域，沙雷菌是引起牛乳房炎和多种动物疾病的病原菌，能引起牛（乳房炎）和马（结膜炎）、山羊（脓毒病）、鸡、猪和家兔等多种动物感染，动物可通过被污染的饮水、垫料、用具及飞沫、尘埃、粪便等多种媒介发生接触传染。另外，近年来饮水和乳制品中沙雷菌的污染与存在状况也越来越受到重视。

我们在对进口动物源性饲料进行沙门菌的日常检测过程中发现，在进行选择性平板分离培养沙门菌时，居泉沙雷菌是主要干扰菌之一。根据沙雷菌的生化特性进行一系列的生化和血清学鉴定的传统方法耗时且工作量大，如果能在选择性平板分离培养后，对疑似沙门菌菌落采用分子生物学方法进行肠道沙门菌和沙雷菌属的快速鉴别诊断，无疑将提高进境饲料原料中沙门菌检测工作效率，大大缩短后续生化和血清学鉴定所需的时间、节省人力和物力。目前，针对沙门菌的分子生物学检测技术研究较为广泛，有多种商品化试剂盒可供选用，但针对沙雷菌属尚无较完善的分子生物学检测手段。本发明提供的一种PCR快速检测鉴定沙雷菌属的方法，将有助于满足医学临床检测工作需要和口岸货物验放快速检测工作需要，具有重要理论意义和实际应用价值。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种PCR快速检测鉴定沙雷菌属的方法，本发明针对沙雷菌传统分离鉴定方法无法满足医学临床检测工作需要和无法满足口岸货物验放快速检测工作需要这些不足开展研究，旨在提供一种快速、灵敏度高、特异性强的检测方法对沙雷菌进行检测鉴定。

本发明公开了一种PCR快速检测鉴定沙雷菌属的方法，以编码DNA促旋酶中B亚单位蛋白的gyrB基因为靶基因，设计引物对沙雷菌属的分子生物学特征进行识别；根据GenBank公布的基因序列设计的引物为：

上游引物为F：5’-GATCCACCCCAACGTGTTCT-3’，

下游引物为R：5’-GGCACTTTCACCGAAACCAC-3’。

本发明的PCR反应体系总体积为25μL，其中2×GoTaq Green Master Mix（美国Promega公司生产） 12.5μL，上下游引物各1μL（终浓度为0.8μM），灭菌ddH₂O 9.5μL，DNA模板 1μL。

本发明的PCR反应循环设置为：95℃，预变性2 min；95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s，30个循环；最后72℃延伸5 min，反应结束。

本发明与传统的分离鉴定的方法相比具有的优势：本发明方法在对沙雷菌进行检测鉴定中具有快速、灵敏度高、特异性强等特点。本发明为我国卫生部制定的《人间传染的病原微生物名录》(2006)中三类病原微生物黏质沙雷菌和液化沙雷菌的检测和鉴定提供高效的技术手段，同时有助于实现沙雷菌属和其他肠杆菌科细菌的快速鉴别诊断，解决类似背景技术中所述实现对肠道沙门菌和沙雷菌属的快速鉴别诊断的各种实际问题，具有潜在实际应用价值。

本发明所提供的一种快速检测鉴定沙雷菌属的PCR方法，具有如下有益效果：

1、特异性强：以编码DNA促旋酶中B亚单位蛋白的gyrB基因为靶基因设计的特异性引物，在PCR试验中仅可扩增出沙雷菌，而包括鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌、大肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、宋氏志贺菌、产酸克雷伯菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌、产气肠杆菌等在内的9种非沙雷菌的扩增均为阴性，显示了该引物良好的特异性。

2、灵敏度高：用沙雷菌的基因组DNA 进行PCR反应其检测灵敏度可达到9.785pg/μL。

3、结果可靠：已经用深红沙雷菌、无花果沙雷菌、居泉沙雷菌、普利茅斯沙雷菌、黏质沙雷菌、液化沙雷菌、变形斑沙雷菌等7种沙雷菌对引物进行验证，因此可以充分保证结果的可靠性。

4、实用性好：根据细菌的生化特性和血清学的传统分离鉴定方法所需检测时间长，本发明采用分子生物学的方法弥补了传统分离鉴定方法的不足，大大减少了检测工作所需时间，为临床因沙雷菌所引起的败血症等危重病人的及时诊断和治疗提供了宝贵的时间。同时，在进口动物源性饲料的沙门菌检疫方面，为肠道沙门菌和沙雷菌属的快速鉴别诊断提供了新方法。

附图说明

图1为沙雷菌属PCR引物特异性试验结果。其中，图1（a）中M为100bp DNA梯度标记物(从下往上依次为100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、1000bp、1500bp)；NC为阴性对照；泳道1～7依次为：居泉沙雷菌Serratia fonticola；变形斑沙雷菌Serratia proteamaculans；粘质沙雷菌 Serratia marcescens；无花果沙雷菌 Serratia ficaria；普利茅斯沙雷菌 Serratia plymuthica；液化沙雷菌 Serratia liquefaciens；深红沙雷菌 Serratia rubidaea；图1（b）中M为100bp DNA 梯度标记物(从下往上依次为100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、1000bp、1500bp)；NC为阴性对照；PC为阳性对照（居泉沙雷菌Serratia fonticola）；泳道1～9依次为：大肠杆菌Eschericha coli；弗氏柠檬酸杆菌Citrobacter freundii；宋氏志贺菌 Shigella sonnei；产酸克雷伯菌 Klebsiella oxytoca；粪肠球菌Enterrococcus faecalis；产气肠杆菌 Enterobacter aerogenes；肠炎沙门菌 Salmonella enteritidis；鼠伤寒沙门菌 Salmonella typhimurium；肺炎克雷伯菌 Klebsiella pneumoniae。

图2为沙雷菌属PCR引物最佳退火温度试验结果。其中：M为100bp DNA梯度标记物(从下往上依次为100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、1000bp、1500bp)；NC为阴性对照；泳道1～10的温度依次为：53.2℃、53.9℃、55.0℃、56.2℃、 57.4℃、58.6℃、59.8℃、61.0℃、62.1℃和62.8℃。

图3为沙雷菌属（居泉沙雷菌Serratia fonticola）PCR试验最低检测限试验结果。其中：M为100bp DNA 梯度标记物(从下往上依次为100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、1000bp、1500bp)；NC为阴性对照；泳道1～8的温度依次为：97.85 ng、 9.785 ng、978.5 pg、97.85 pg、9.785 pg、978.5 fg、97.85 fg和9.785 fg。

具体实施方式

实施例1：沙雷菌属PCR引物特异性试验

1.1材料的准备

供试沙雷菌如下：居泉沙雷菌Serratia fonticola;变形斑沙雷菌Serratia proteamaculans;粘质沙雷菌 Serratia marcescens;无花果沙雷菌 Serratia ficaria;普利茅斯沙雷菌 Serratia plymuthica;液化沙雷菌 Serratia liquefaciens;深红沙雷菌 Serratia rubidaea；非沙雷菌如下：大肠杆菌Eschericha coli;弗氏柠檬酸杆菌Citrobacter freundii;宋氏志贺菌 Shigella sonnei;产酸克雷伯菌 Klebsiella oxytoca;粪肠球菌Enterrococcus faecalis;产气肠杆菌 Enterobacter aerogenes;肠炎沙门菌 Salmonella enteritidis;鼠伤寒沙门菌 Salmonella typhimurium;肺炎克雷伯菌 Klebsiella pneumoniae。

以上所用的菌株均来自国内权威微生物菌种保藏中心。

1.2 PCR方法的建立

1.2.1引物的设计合成：基于沙雷菌的gyrB（编码DNA促旋酶中B亚单位蛋白的基因）基因序列，通过大量比对及筛选获得高度保守且特异性强的序列用于特异性引物的设计，经NCBI Blast比对验证所设计引物的特异性，由上海生工生物技术服务有限公司合成。所设计引物序列如下，并针对所设计的引物用温度梯度PCR仪摸索其最佳退火温度，见实施例2。

上游引物F：5’ -GATCCACCCCAACGTGTTCT-3’

下游引物R：5’ -GGCACTTTCACCGAAACCAC-3’

扩增片段大小为279bp。

1.2.2基因组DNA提取

1.2.2.1煮沸法：

1、挑取单菌落划线接种于LB琼脂平板， 37℃培养18h-24h；

2、刮取1～2接种环菌苔加入150微升Tris-EDTA (TE) 缓冲液中，混匀，100℃沸水浴中煮沸10min；

3、12000 r/min 离心10min，取上清，-20℃保存备用。

1.2.2.2 试剂盒提取法：按照TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒使用说明书操作提取DNA。将所提取的细菌DNA保存在TE缓冲液中，用超微量核苷酸测定仪测定DNA浓度和质量（OD₂₆₀/OD₂₈₀介于 1.7~1.9 且浓度大于 20ng/μL时，可用于后续PCR反应），-20℃保存备用。

1.2.3 PCR扩增反应体系：总体积为25μL，2×GoTaq Green Master Mix 12.5μL，上下游引物各1μL（终浓度为0.8μM），灭菌ddH₂O 9.5μL，DNA模板 1μL。

1.2.4 PCR反应循环设置：95℃预变性2 min；95℃ 30s, 56℃ 30s, 72℃ 30s，30个循环；72℃延伸5 min，反应结束。

1.2.5 PCR扩增产物检测和鉴定：取6μLPCR产物点样于1.5%琼脂糖凝胶（含溴化乙锭），将琼脂糖凝胶置于1×TAE缓冲液中用120V电压电泳50 min后，取出，置于凝胶成像仪中用紫外灯观察。若在279bp的位置出现扩增条带，则说明所扩增的样品为沙雷菌。电泳结果显示只有沙雷菌的PCR扩增产物在279bp的位置有明亮的扩增条带(见图1（a）)，用其他非沙雷菌的DNA作为模板进行PCR反应均未观察到有扩增条带(见图1（b）)，说明引物的特异性很强。

实施例2：PCR引物最佳退火温度筛选

2.1材料准备

采用实施例1中1.2.2所提取的沙雷菌（以居泉沙雷菌为例）DNA作为PCR反应的模板。

2.2 PCR

2.2.1 PCR扩增反应体系：总体积为25μL，2×GoTaq Green Master Mix 12.5μL，实施例1中1.2.1所述上下游引物各1μL（终浓度为0.8μM），灭菌ddH₂O 9.5μL，DNA模板 1μL。

2.2.2 PCR反应循环设置为：95℃预变性2 min；95℃ 30s, 应用梯度PCR仪设置10个退火温度53.2℃～62.8℃ 30s, 72℃ 30s，30个循环；72℃延伸5 min，反应结束。

2.2.3 PCR扩增产物检测和鉴定：取6μLPCR产物点样于1.5%琼脂糖凝胶（含溴化乙锭），将琼脂糖凝胶置于1×TAE缓冲液中用120V电压电泳50min后，取出，置于凝胶成像仪中在紫外灯下观察。在279bp的位置上均有扩增条带（见图2），其中泳道1～5扩增条带亮度无明显差异，泳道6～10扩增条带亮度逐渐变弱，同时考虑到适当提高退火温度可以提高特异性扩增，所以退火温度选择为56℃。

实施例3：沙雷菌属PCR检测灵敏度试验

3.1材料准备

采用10倍浓度系列稀释法将实施例1中1.2.2所提取的沙雷菌（以居泉沙雷菌为例）DNA原液 （ 97.85ng/μL）稀释成9.785 ng、978.5 pg、97.85 pg、9.785 pg、978.5 fg、97.85 fg和9.785 fg共7个不同浓度梯度。对连同原液在内的共8个浓度的沙雷菌DNA进行PCR灵敏度试验。

3.2 PCR检测

3.2.1 PCR扩增反应体系：总体积为25μL，2×GoTaq Green Master Mix 12.5μL，实施例1中1.2.1所述上下游引物各1μL（终浓度为0.8μM），灭菌ddH₂O 9.5μL，DNA模板 1μL。

3.2.2 PCR反应循环设置：95℃预变性2 min；95℃ 30s, 56℃ 30s, 72℃ 30s，30个循环；72℃延伸5 min，反应结束。

3.2.3 PCR扩增产物检测和鉴定：取6μLPCR产物点样于1.5%琼脂糖凝胶（含溴化乙锭），将琼脂糖凝胶置于1×TAE缓冲液中用120V电压电泳50min后，取出，置于凝胶成像仪中在紫外灯下观察。若在279bp的位置出现扩增条带，则说明该浓度的样品可以被扩增。电泳结果显示DNA浓度为9.785 pg/μL时279bp的位置仍然有扩增条带（见图3），说明此检测方法具有较高的灵敏度，可以达到9.785 pg/μL。

以上所述为本发明优化后较为理想的反应设置，凡是依照本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属于本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120> 一种快速检测鉴定沙雷菌属的PCR方法

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<170> PatentIn version 3.3

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