一种沙雷菌定量检测荧光pcr试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及医学检验技术领域，具体设及一种沙雷菌定量检测巧光PCR试剂盒及 其应用。
【背景技术】
[0002] 沙雷菌是一种能引起沙雷菌肺炎和败血症的致病菌，在环境中广泛存在，主要为 医院内获得性感染，发病率明显增多，且耐药菌株增多，治疗困难。与一般急性细菌性肺炎 相似，主要表现为发热、寒战、咳嗽、咯血疲或假性血疲或黄疲、呼吸困难、胸痛。沙雷菌感染 已成为常见的、传播广泛的条件致病菌之一，但早期诊断困难，常常导致治疗时机延误，病 死率高。传统的分离、培养和病理鉴定等诊断方法敏感性低、阳性率低。早期、快速、简便、 敏感、特异的诊断方法是目前条件性沙雷菌感染实验诊断研究领域的热点。
[000引巧光PCR技术在1995年由美国阳公司率先研制成功，它兼有PCR的高灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，结果直观，能直接检测PCR过程中的变化。与普 通PCR相比，其结果可实时观察，产物不需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了 污染。
【发明内容】
[0004] 本发明需要解决的现有技术的问题是：沙雷菌感染早期诊断困难，现有技术的诊 断方法敏感性低、阳性率低，导致病情延误。
[0005] 为了解决上述问题，本发明提供了一种沙雷菌定量检测巧光PCR试剂盒，用来解 决现有的沙雷菌感染诊断困难，敏感性低、阳性率低的问题。
[0006] 具体而言，本发明提供了一种沙雷菌定量检测巧光PCR试剂盒，所述的试剂盒包 括阳性标准品、阴性标准品、反应液和DNA聚合酶，所述阳性标准品、阴性标准品和反应液 中均含有用于沙雷菌检测的特异性引物和特异性探针。
[0007] 优选的，所述特异性引物包括引物1和引物2,其中引物1的序列SQ1为： 5' -cacgccatcagatgtgcc-3';
[0008] 引物 2 的序列SQ2 为：5, -agtgtggctggtcatcctctc-3,。
[0009] 优选的，所述特异性探针为带有巧光基团和泽灭基团的特异性序列，其中，所述的 巧光基团选自FAM、肥X、TET、VIC中的一种，优选为FAM、VIC;所述的泽灭基团选自MGB、 TAMRA、B册中的一种，优选为MGB。
[0010] 优选的，所述的特异性探针的序列SQ3为：5' -ctcacctaggcgacgat-3'。
[0011] 优选的，所述阳性标准品中含有插入了沙雷菌特异性DNA序列SQ4的重组质粒，其 中，SQ4的序列如下：
[0012] cttcgggcctcacgccatcagatgtgcccagatgggattagctagtaggtggggtaatgg 60
[0013] ctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgag 120
[0014] 曰c曰cggtcc曰 g曰ctcct曰eggg曰ggc曰gc曰 gtgggg曰曰t曰 ttgc曰c曰曰tgggege曰曰gee 180
[0015] 优选的，所述重组质粒的浓度为1.OX1〇3~1. 0X107。
[0016] 优选的，所述的阴性标准品包含有不含沙雷菌特异性DNA序列的质粒。
[0017] 优选的，所述的质粒或重组质粒相同，选自祀了3、口11〔3、口61-1\地1?322、口10-1'中的 一种，优选为pGM-T、地R322。
[0018] 优选的，所述的反应液还包括缓冲液和dNTPs。
[0019] 优选的，所述的缓冲液包括Ξ径甲基氨基甲烧、氯化钟和氯化儀。
[0020] 优选的，所述的Ξ径甲基氨基甲烧的浓度为50~200禮，优选为100~150mM;氯 化钟的浓度为300~800mM，优选为400~600mM;氯化儀的浓度为10~30mM，优选为10~ 20mM〇
[0021] 优选的，所述的DNA聚合酶为化qDNA聚合酶。
[0022] 本发明同时提供了引物1的序列SQ1、引物2的序列SQ2和特异性探针的序列SQ3 用于制备沙雷菌含量测定用试剂中的应用。
[0023] 优选的，所述的沙雷菌含量测定用试剂的使用方法如下：
[0024] 取样本DNA加入到反应液中，作为样品检测组，然后分别在阳性标准品、阴性标准 品W及样品检测组中加入DNA聚合酶，混合均匀后进行巧光定量PCR反应，其中反应液、阳 性标准品、阴性标准品中均含有引物1的序列SQ1、引物2的序列SQ2和特异性探针的序列 SQ3。
[00巧]优选的，所述的巧光定量PCR反应条件为：94~95°C预变性2~5min，1个循环； 94~95°(：15~203、55~601：30~503,40~50个循环。
[0026] 其中，所述的质粒可W为本领域常用的任何可插入外源基因的质粒，可W为常见 的祀Ts系列、pUCs系列、PBR322、pGM-T等，pUCs系列优选为PUC18、PUC19等。
[0027] 其中，特异性引物与特异性探针根据沙雷菌高度保守序列特性设计，用于检测沙 雷菌。
[0028] 而且，发明人创造性的选取了沙雷菌特异性DNA序列SQ4,将其与质粒载体连接的 重组质粒作为阳性标准品，其检测的特异性高，灵敏度高。
[0029] 本发明的有益效果为：
[0030] 1)本发明试剂盒定量准确，兼有PCR的高灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精 确定量的优点，结果直观，能直接检测PCR过程中的变化，与普通PCR相比，其结果可实时观 察，产物不需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了污染。
[0031] 2)本发明试剂盒检测灵敏度和特异性高，由于采取特异性引物和探针的双保险设 计，灵敏度和特异性均有很大提高，能在临床症状出现之前检测到沙雷菌的感染。
[0032] 3)本发明试剂盒检测速度快，总共仅需2个小时，步骤简单，可同时进行高通量样 本检测。
[0033] 下面结合附图和各个【具体实施方式】，对本发明及其有益技术效果进行详细说明， 其中：
【附图说明】
[0034]图1为实施例一的沙雷菌阳性标准品的巧光PCR扩增曲线和阴性标准品的巧光 PCR扩增曲线。
[003引图2为实施例一的沙雷菌临床样本的巧光PCR扩增曲线。
【具体实施方式】
[0036] 如上所述，本发明提供了一种用于沙雷菌定量检测巧光PCR试剂盒，其目的是为 了提高被测人群沙雷菌诊断的灵敏度和特异性，提供早期诊断的可靠性。
[0037] 具体而言，本发明提供了一种沙雷菌定量检测巧光PCR试剂盒，所述的试剂盒包 括阳性标准品、阴性标准品、反应液和DNA聚合酶，所述阳性标准品、阴性标准品和反应液 中均含有用于沙雷菌检测的特异性引物和特异性探针。
[0038] 其中，在本发明的一种优选实施方式中，所用到的特异性引物W及特异性探针的 DNA序列分别为：
[0039]特异性引物1的序列SQ1为：5' -cacgccatcagatgtgcc-3'，作为正向引物；
[0040]特异性引物2的序列SQ2为：5' -agtgtggctggtcatcctctc-3'，作为反向引物；
[0041]特异性探针的序列SQ3 为：5' -ctcacctaggcgacgat-3'。
[0042] 在所述阳性标准品中含有插入沙雷菌特异DNA序列SQ4的pGM-T载体质粒，所插 入序列SQ4如下：
[0043]SQ4:
[0044]cttcgggcctcacgccatcagatgtgcccagatgggattagctagtaggtggggtaatgg 60
[0045]ctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgag 120
[0046] 过c过cggtcc过 g过ctcct过eggg过ggc过gc过 gtgggg过过t过 ttgc过c过过tgggcgc过过gcc 180
[0047] 在本发明的具体实施中，所述阳性工作标准品含有重组质粒的浓度为1. OX lO3~ 1.OXl〇7。
[0048] 本发明中的样本DNA不仅仅来源于动物或人体的全血液或者肺泡灌洗液，还可W 是任何与沙雷菌相关的样本。本发明提到的特异性引物1的序列SQ1和引物2的序列SQ2 W及特异性探针的序列SQ3可W应用于制备测量沙雷菌含量的试剂。
[0049] 应当说明的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员 常规的方法，具体可参照萨姆布鲁克和拉塞尔主编的《分子克隆实验指南》第Ξ版，或按照 制造厂商所建议的步骤和条件。
[0050] 下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细的说明，其中实施例中所用 的试剂和仪器的厂家如下：
[0051] 巧光定量PCR仪，厂家：美国ABI实时巧光定量PCR仪7500,美国；
[0052]dNTPs，厂家：TAKARA，日本；
[0053]TaqDNA聚合酶，厂家：TAKARA，日本；
[0054]DNA基因组提取试剂盒，购自天根公司；
[00巧]pGM-T质粒载体，PUC18质粒载体，PMD18-T质粒载体，均购自天根生化科技（北 京）有限公司；
[0056] 本发明中用到的特异性引物，W及特异性探针序列均由上海英驗生物技术有限公 司合成，其中，特异性探针上连接的巧光基团和泽灭基团一并由上海英俊生物技术有限公 司合成。
[0057] 实施例一
[005引（一）试剂盒的准备
[0059] (1)引物和探针设计与合成
[0060] 根据沙雷菌的高度保守序列，设计了特异性引物和特异性探针，
[0061] 其中，正向引物SQ1 为 5, -cacgccatcagatgtgcc-3，；
[0062] 反向引物SQ2 为 5, -agtgtggctggtcatcctctc-3，；
[0063]特异性探针SQ3为5' -ctcacctaggcgacgat-3'，其中MGB作为泽灭基团，FAM作为 巧光基团，FAM和MGB分别连接在特异性探针序列SQ3的5'和3'端。
[0064] (2)沙雷菌阳性模板的制备
[0065] 制备含有沙雷菌核酸序列的质粒作为阳性模板，用于在试剂盒检测时制备阳性标 准品。
[0066] 首先使用引物SQ5 :5, -cttcgggcctcacgc-3,和引物SQ6 :5, -ggcttgcgcccattg-3'，采用常规PCR技术扩增沙雷菌基因祀序列，然后将经过纯化的PCR产物连接到pGM-T载 体上，得到连接有目的基因的质粒；接着转化大肠杆菌T0P10感受态细胞，并通过筛选构建 好的重组质粒作为阳性标准品，将构建的重组质粒经双向DNA