专利名称：生物技术生产软骨素的制作方法
生物技术生产软骨素领域现状软骨素是由交替的N-乙酰-D-半乳糖胺β 1 4和D-葡糖醛酸β 1 3的残基形成的天然线性多糖。在脊椎动物中，软骨素以各种N-乙酰-D-半乳糖胺的4和6位羟基残基硫酸化所产生的硫酸化形式存在，在一些情况下，是葡糖醛酸的2和3位残基硫酸化(Sugahara K等人，J. Biol. Chem.，1996，271，26745-54)。软骨素的分子量和硫酸化的程度与位点取决于组织的类型和年龄(Kuettner KE等人编著，Articular cartilage and osteoarthritis,NY,Raven Press, 1992 ；Volpi N编著，Chondroitin sulfate !structure, role and pharmacological activity, S.Diego, California Academic Press-Elsevier Inc,2006)o硫酸软骨素属于葡糖氨基聚糖的大家族，称为GAG(Beaty NB和Mello RJ, J. Chromatography and BiomedicalApplications，1987，418，187-222)。这些多糖与蛋白质共价连接作为蛋白聚糖，是所有结缔组织的胞外基质的普遍组分，发挥多种功能 (Ruoslathi E, Ann. Rev. Cell. Biol. , 1988,4,229-255 ；Kjellen L and Lindahl U, Ann. Rev.Biochem.，1991，60，443—76)。一些病原细菌生产荚膜结构作为致病性因子。在一些情况下，为了在感染过程中欺骗免疫系统，荚膜是由GAG或相关结构形成的。这些病原体的实例是多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida) (DeAngelis PL,等人，Carbohydrate Res. 2002，337 (17)， 1547-52 ；Harper Μ,等 A, FEMS Microbiol.Lett. ,2006,265(1), 1-10 ；LeonovAV,等人，Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. 2006，Nov-Dec (7)，94-7)、大肠杆菌有荚膜菌株 K4 和 K5(Roberts IS, Ann. Rev. Microbiol. 1996,50,285-31 ；Bronner D,等人， J Bacteriol. 1993Sep ；175 (18) :5984-92 ；Jann B and Jann K In Escherichia coli Mechanisms of virulence. Cambridge Univ. Press. 1997 ；WhitfieldC, Annu. Rev. Biochem. 2006,75 :39-68. Stevens MP,等人，Mol. Microbiol. 1997，24 (5)，1001-12 ; Whitfield C and Roberts IS, Mol. Microbiol. 1999,31,1307-20 ；Ninomiya Τ,等人， J. Biol. Chem. 2002，277 (24)，21567-75)，和一些有荚膜的链球菌菌株(ffessels MR,等人， Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1991,88,19,8317-21 ；Tlapak-SimmonsVL 等人，J. Biol. Chem.， 2005，280，13，13012-18)。硫酸软骨素被用作抗风湿和保护软骨(condroprotective)药物，应用于治疗膝的胫腓骨关节炎tibiofibular osteoarthritis和关节软骨的骨关节炎(Kuettner KE 等人编著，in Articular cartilage and osteoarthritis, NY, Raven Press, 1992 ； Simanek V 等 A,2005,149,51-56 ；Goerres GW 等人，J.Clinical Desitometry 2005， 8,484-487 ；Altman RD φ A, OsteoArthritis and Cartilage 2005,13,13-19 ；Chan PS,等人，OsteoArthritis and Cartilage 2005，13，387-394 ;Chou MM,等人，Exp. Biol. Med. 2005,230,255-262 ；Clegg DO,等人，New England J. of Medicine，2006，23， 795-808 ;Roman-Blas 等人，OsteoArthritis and Cartilage,2006,14,839-848 ；Maheu E 等人，OsteoArthritis and Cartilage，2006，14，303-322 ;FotiniN 等人，Biomed. Chromatogr. 2006,20,539-550 ；Lagnaoui R 等人，Thrapie2006，61，341-346 ;Volpi N 编著，Chondroitin sulfate :structure, role and pharmacological activity, S. Diego, California AcademicPress-Elsevier Inc, 2006 ；Zhang W^A Ann. Rheum. Dis. 2007,66, 377-388)。目前，硫酸软骨素是通过提取技术从各种动物来源获得的，例如猪软骨、鲨鱼鳍和硬骨鱼的软骨。原材料的短缺和下游纯化工艺的复杂程度限制了该活性成分的全球利用度，因此市场受限于不能满足不断增长的需求。而且，从长远来看，由于不断颁布对动物来源药物的安全性日益严格的管理条例，通过提取获得的硫酸软骨素可能将被排除在制药市场之外。因此，对于开发替代性的生物技术对策，通过合适的微生物发酵来生产该类多糖或其前体的兴趣与日俱增。科学文献(RodriguezML 等人，Eur. J. Biochem.，1988，177，117-24 ；Manzoni M 等人，Biotechnology Letters，1996，18，383-6)和专利文献(W0 01/02597 Al)的报道显示通过发酵获得软骨素的可能性，使用大肠杆菌K4菌株生产软骨素衍生物——K4多糖，其碳骨架与软骨素相同，但在葡糖醛酸的C3处添加了 β呋喃果糖残基。可以通过对果糖残基的受控的酸水解，从Κ4多糖获得软骨素(US6，288, 044 ；US 6，777，398)。然而，由于多糖前体在发酵过程中的低产量，在最佳情况下不超过0. 42g ·厂1 (W001/02597)，从K4前体生产软骨素没有被开发作为实际的工业方法。U. S. 2005266460 和一系列已报道的专利文件(W0 0180810, EP1282684, EP 1832662，U. S. 20030104601, U. S. 20050164984)描述了多杀巴斯德氏菌的软骨素合酶的用途，该酶催化从相应的UDP糖合成软骨素。特别的是，这些文件要求保护编码所述酶的核苷酸序列片段，表达此类核苷酸序列片段的重组系统(在原核和真核生物中的表达系统)的构建和使用，和从此类重组系统生产各种大小的软骨素。所有的文件都缺少关于要求保护的工艺的实验数据，特别是完全没有详细报道关于在生物技术方法中生产酶的发酵模式和软骨素产量的数据。在第一优先权之后约10年内，没有开发出任何与上述要求保护的内容相关的产业方法。U. S. 20070015249和之前报道过的专利文件U. S. 20030109693描述了从大肠杆菌
K4中生产软骨素合酶，及其在体外生产软骨素的用途。由大肠杆菌K4的kfoC基因编码的酶的生产，其特征是下列步骤kfoC扩增、将基因克隆到载体pTrcHis中，和从商业的大肠杆菌TOP菌株中表达，其中所述基因位于负责荚膜抗原生物合成的基因簇的II区中。这两份文件还要求保护具有天然和人工突变的蛋白质，所述突变可引起软骨素合酶轻微的结构改变而不改变其催化功能。这些文件还缺少关于要求保护的生产工艺的产量、软骨素合酶的生产和在体外从相应的UDP-糖生产软骨素的数据。EP 1950308 和一系列在先的专利文件(W0 2007145197、W02007069693、WO 2007058252、WO 2007058252、WO 2007023867)描述了使用大肠杆菌K4及其变体的软骨素合酶，在体外合成软骨素及其衍生物的方法，所述变体只有两种转移酶活性中的一种。U. S. 7，273，729 和一系列在先的专利文件(JP 2004024208、US20060052335, US 20060057697、US 7，232，676)描述了人软骨素合酶的用途，该酶催化从相应的UDP糖合成软骨素。文件要求保护人软骨素合酶的结构、包含所述酶序列的表达载体、所述载体在真核细胞中的表达，和合成软骨素多糖链的方法。
U. S. 20070059805要求保护人软骨素合酶的结构、包含所述酶序列的表达载体、所述载体在真核细胞中的表达，和合成软骨素多糖链的方法。所有上述提及的文件都没有解决相比通过从动物来源提取获得的硫酸软骨素，以有竞争力的成本生产软骨素的难题。特别是使用大肠杆菌K4、多杀巴斯德氏菌及其软骨素合酶变体进行发酵生产，其特征是发酵肉汤中的产量不超过0. 5g · Γ1。使用大肠杆菌Κ4、 多杀巴斯德氏菌或人的软骨素合酶及其变体的类似的生物技术方法，具有与酶生产和使用 UDP糖作为底物相关的高成本。因而，以与市场需求相符合的成本生产软骨素的难题仍然没有实践的解决方案。发明概述令人惊讶的发现，通过使用基于优化的三阶段发酵方法(分批-补料分批-微滤方案)和遗传修饰的细菌的整合对策，可以通过发酵生产软骨素，获得>881^的产量。所述细菌优选是遗传修饰的大肠杆菌Κ4菌株，从而改造方法的目标是通过插入多拷贝的自体RfaH基因，改善负责合成Κ4多糖的整个酶复合体的加工性能，所述RfaH基因作为负责合成荚膜材料的基因簇转录的正调节子发挥作用。高产量、易于开发下游纯化方法、方法的低的总成本和低环境影响，使这些发现优于之前描述过的生物技术对策(Rodriguez ML等人，Eur. J. Biochem.，1988，177， 117-124 ；Manzoni M 等人，BiotechnologyLetters，1996，18，383-386 ;W0 01/02597 Al; US 6，288，044 ；US6, 777，398 ；US 2005266460 ；WO 01/80810 ；EP 1282684 ；EP 1832662 ； US 20030104601 ；US 20050164984 ；US 20070015249 ；US 20030109693 ；EP 1950308 ； WO 2007145197 ；WO 2007069693 ；WO 2007058252 ；W02007058252 ；WO 2007023867 ； US 7，273，729 JP 2004024208 ；US20060052335 ；US 20060057697 ；US 7，232，676 ；US 20070059805)。所开发的发酵方法，整合软骨素的位点选择性化学硫酸化作用的对策，使要求保护的生物技术方法与从动物来源的原材料中提取硫酸软骨素的常规方法相比较更有竞争性，后者由于目前关于产品安全性的条例的改变，可能将从制药市场中消除。发明详述本发明描述了使用遗传修饰的细菌微生物(例如大肠杆菌，优选K4)和使用允许生产荚膜多糖、软骨素前体(在多糖K4的情况下，是在位置3的葡糖醛酸果糖基化的软骨素)的特定生长条件的发酵方法，获得高于8g · Γ1的产量，该产量比迄今描述过的方法高约20倍。该对策的特征是下列阶段多步骤发酵方法(分批-补料分批-微滤方案)，应用重组的大肠杆菌K4菌株， 其特征是存在多拷贝的自体RfaH基因(Santangelo和Roberts T.J Mol Cell 2002 APR 9(4) :698-700),所述RfaH基因是负责合成荚膜材料的基因簇转录的正调节子；对缺少生物量的已耗尽的发酵肉汤直接进行水解处理，能够将多糖K4转化为软骨素和果糖，同时通过切割微生物大量生产的脂多糖(LPQ成为0-链和脂质A，而使发酵上清液脱毒，后者被立即沉淀，可以方便的去除；基于膜处理(membrane processes)的创新的下游纯化工艺，能够将软骨素0-链与培养基中存在的其他污染物分离。相比现有技术，要求保护的方法是新颖和有创造性的，因为这是唯一允许在工艺规模实施来生产软骨素的方法，作为具有极大制药市场潜力的多糖，软骨素目前还没有实现生产、提取或生物技术的方法。此外，所要求保护的方法整合了软骨素的位点选择性硫酸化对策，使得目前能够满足市场上对硫酸软骨素的增长的需求，规避了现有生产对策中基于动物来源的提取和与使用动物来源相关的问题。细菌菌株的改造野牛型大肠杆菌K4 (EcMwt)——有许多已知的大肠杆菌菌株都是有荚膜的，基于荚膜的抗原决定簇(目前已知约80种抗原决定簇)和物理、生物化学和遗传性规则，被分为4个不同的血清学类别。组1和4的荚膜属于引起肠道感染的大肠杆菌菌株，包括致肠病型(EPEC)、产肠毒素型(ETEC)和肠出血型(EHEC)菌株。组1荚膜是由多糖形成的，由于存在具有非常相似的结构的糖醛酸，其是酸性的。组4荚膜的结构反而极其不同，特征是在其重复的单元中存在N-乙酰化的氨基糖。组2和3中的荚膜属于引起肠外感染(ExPEC)的大肠杆菌菌株。EcMwt是经过遗传修饰过表达K4多糖的微生物，属于血清学2组，可以以不同的代码从主要的微生物保藏机构获得，例如美国典型培养物收藏中心USA(ATCC 23502)、 国际埃希氏菌中心，丹麦(菌株Bi 8337/41)、英国国立典型培养物收藏中心，UK(菌株NCTC 9005)和 Freiburg 收藏中心(菌株 U1-41 2616) 令人惊讶的是，发现EcMwt携带了内源性质粒，自此以首字母缩写PK4命名，该质粒在大肠杆菌K4中的存在尚未见文献描述过。PK4包括约93，000个碱基，是组成型的，其特征是包括可用于插入异源基因序列 IDNO :1和/或IDNO 6的序列。它平均存在1_5拷贝/细胞，并且它的遗传修饰是稳定的。RfaH,负靑荚膜材料合成的基因簇的转录调控子——细菌中的长的多顺反子操纵子的转录通常基于辅助蛋白质，其分子机制尚不清楚。例如，负责合成荚膜分子组分的基因簇2区和3区的单个mRNA分子的转录受抗终止子基因rfaH编码的蛋白质的控制，后者因此作为转录的正调控子发挥功能，阻止转录物的过早阻碍。通过增加RNA聚合酶的加工性能，由RfaH基因编码的蛋白质激活若干负责肠道细菌致病性和育性的基因转录(Stevens MP 等人，Mol. Microbiological.，1997，24，1001-12)。一般而言，由 RfaH 基因编码的蛋白质是大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌(S. typhimurium)的脂多糖核心的生物合成(Pradel E和 Schnaitman CA, J. Bacteriol.，1991，173，6428-31 ；Brazas R,等人，J. Bacteriol. 1991， 173,6168-73)、α-溶血素的合成和分泌(Bailey MJA 等人，Mol. Microbiol. 1992,6, 1003-10)以及性别因子 F 的生产(Beutin L 和 Achtman MJ，Bacteriol. 1979，139，730-37) 所必需的。并且，Zhang 及其同事(Zhang L 等人，Infect. Immuno. 2004,72,7282-93)报道，一般而言，血清学2组的荚膜抗原的表达需要rfaH基因编码的蛋白质，并显示所述蛋白质是负责在大肠杆菌K5中合成荚膜多糖的基因簇2区的转录所必需的。Rahn和 Whitfield (Rahn A 和 C. Whitfield，Mol. Microbiological. 2003，47，1045-60)显示，在大肠杆菌血清学1组中的K30，合成荚膜的簇的转录受RfaH基因产生的抗终止子机制的调节。RfaH基因和相应蛋白质在荚膜组分合成方法中的关键角色被涉及删除或改变该基因的研究所间接证实。具体而言，Nagy及其同事(NagyG，等人，Infect. Immun. 2002，70， 4406-13)报道，从尿致病性(uropathogenic)大肠杆菌536菌株的基因组中删除rfaH基因急剧的降低了在小鼠中的致病性，从野生型菌株导致的100%致死降低到突变菌株的 18%。消除RfaH基因还决定了 LPS表型的改变，和降低的K15荚膜和α-溶血素生产。Stevens 及其同事(Stevens MP 等人，FEMS Microbiol. Lett.，1994，124，93-8)显示了在 rfaH基因序列中导入突变，使大肠杆菌K5细胞在37°C不能生产荚膜。相反，文献中没有关于rfaH过表达效果的可获得的数据。在菌株EcMwt中，rfaH基因处于受调控的启动子控制，该启动子决定了在静止生长期中的最大表达(Stevens MP，等人，Mol. Microbiol.，1997，24，1001-12 ；Stevens Μ. P.， 等人，FEMS Microbiol. Lett.，1994，124，93-98)。令人惊讶的是，发现在细菌(例如大肠杆菌，尤其是EcMwt)的遗传材料中整合一份或多份拷贝的rfaH基因，显著的改善了 K4多糖的生产。为了实现更有效的转录，可以将整合的rfaH基因置于优选在生长的所有阶段都有效的启动子控制下，例如pGap，这是编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的GapA基因的组成型启动子，该酶是大肠杆菌代谢必需的关键酶。具体而言，PGap启动子的结构是多启动子区，包括P1、P2、P3和P4启动子。其中， Pl启动子是最强的，然而，四个启动子协同作用，保证在不同条件下的基因转录，使其更通用和有效。仍然可以使用在大肠杆菌中有活性的其他组成型启动子。因此，本发明的另一个目标是具有作为荚膜多糖的软骨素前体的细菌菌株，优选改造的大肠杆菌菌株，其中所述多糖优选是K4，其特征是包含至少一拷贝的编码rfaH蛋白或其功能等价片段的序列。这可以通过插入多个基因拷贝以可选的或组合的方式，作为染色体DNA元件或作为质粒元件或可转座元件而改造。根据优选的实现手段，编码rfaH蛋白的序列置于组成型启动子的控制下，或者包括至少一种选自 SEQIDN0 :1、SEQIDN0 :6、SEQIDN0 :9、SEQIDN0 :11、SEQIDN0 :12、SEQIDN0 13、SEQIDN0 20 的序列。令人惊讶的是，发现通过使用按三个顺序步骤进行的发酵方法分批、补料-分批和微滤分案，可以从这些改造的细菌中获得高产量的K4多糖。第一个分批阶段持续到由于营养物耗尽而发生微生物(μ )生长速率降低，同时导致PO2增加时为止。第二个补料-分批阶段的关键特征是补料模式，其利用浓缩的营养物溶液，支持微生物以低于最大的速率生长。具体而言，所要求的发酵对策涉及这样的可能性，即通过用发酵参数的变化驱动补料，而自动优化营养物的添加，所述参数是与营养物利用度的条件典型相关的，例如α分压或培养基的ρη。该对策是通过专用软件创造控制环路来实施的， 所述专用软件基于PID控制器的优化参数，确保为了满足微生物生长的营养物需求而实时调节，从而延长了生长期，避免了代谢物溢流现象，该现象可能导致基质中积累抑制生长的有机酸(在EcK4的情况下，> 5g · L—1的醋酸浓度抑制生长)。第三个阶段被成为微滤分案，是当毒性分解代谢产物积累导致微生物生长降低或停止生长时激活的，即使仍存在可利用的营养物。该工艺涉及使用置于生物反应器内部或外部的微滤模块，对培养基微滤。在微滤过程中，通过水平控制器保持发酵体积恒定，是通过添加与培养基制品使用的相容性组成的生理盐水，自动恢复所移除的微滤液的体积，保持发酵体积恒定。在发酵方法末期，K4多糖部分存在于微滤液中，部分存在于发酵罐中。分批生长——培养基中释放K4多糖是EcK4r和EcMwt的组成型特征，同时生物量产量和生产率(K4多糖/生物量)取决于培养基的组成和发酵条件。营养物一为了生产K4多糖，EcK4r和EcMwt的生长可以使用具有不同组成的培养基；例如，葡萄糖、糊精、淀粉、甘油、玉米浆、糖蜜可用作碳源，而蛋白胨、酵母提取物、 酪蛋白水解物、胰蛋白胨和大豆粉、棉花粉(cotton flour)、豌豆粉可用作非动物来源的有机氮和复杂营养物。然而，培养基中的碳源和有机氮源之间的比例对有效生产是关键性的 (K4多糖/生物量)。具体而言，培养基中的有机氮量的减少，导致微生物较低的生长能力， 这与较高的生产K4多糖的能力相关。由于第二种效应的影响大于第一种，因此，在较少复杂来源的半确定成分培养基中观察到较高的生产率(K4多糖/L发酵液)。充氧作用——培养基的充氧作用对微生物的生长和K4多糖的生产没有关键性的效应，只要避免严格厌氧条件，保证在纯氧中至少PA > 5%的饱和度。pH——生长发生在pH 3和10之间，然而pH 6-8的范围对微生物的生长和K4多糖的生产是最佳的。因此，用PH稳态系统将培养基的pH自动维持在该pH间隔范围内。温度——微生物的生长和K4多糖的生产发生在25-40°C间隔范围内，最大的产量在 37°C。生长期——微生物在培养基中释放K4多糖，在指数生长期释放部分K4多糖，在静态期完全释放K4多糖。在摇瓶和发酵罐中的牛长——在可比较的生长条件下，发酵罐比摇瓶产生高4倍的产量(K4多糖/L发酵液)。补料-分批生长——令人惊讶的发现，补料对策避免了溢流代谢，是通过保持新鲜营养物的添加低于底物摄取的关键速率，改善生物量和多糖K4的产量而获得的。例如，可以通过使营养物补料处于反应器中的溶解氧浓度的控制下的发酵对策来实现，所述溶解氧浓度应该维持在30%的p02。这是通过与投递浓缩营养物溶液(例如，甘油-大豆或葡萄糖-酵母提取物)的补料泵连接的PID控制器快速而可复制的实现的。实际上，向生物反应器中添加碳源导致DOT减少(溶解氧强度(DissolvedOxygen Tension)).因而，在分批发酵的末期，尤其是当P02值开始增加时，开始浓缩营养物供应的补料阶段，并以低的偏移 (-20%的PA设定)恢复PA至设定值。当PA值达到设定点时，补料泵自动停止，关闭补料， 直到发酵肉汤中的碳源耗尽，导致PO2值突然升高，并触发如上所述的新一轮循环。然后，在代谢控制下，根据培养物的营养需求自动并顺序的进行补料阶段。通过PH变化的作用可以激活相似的补料驱动对策；在此情况下，必需排除用于PH调节的自动化pH稳态系统，当pH 增加到超过预定义的基于微生物生理学的阈值(例如，PH 7.8)时，通过内收泵(adduction pump)的开启向内补料。在微滤方案下的生长——通过微滤工艺去除发酵培养基中积累的有毒组分，可以延长微生物的生长期和K4多糖的生产。微滤工艺是用外部单元进行的，所述单元优选用中空纤维制造，用切向微滤方案操作，降低了滤膜的污垢，并维持了高的跨膜流动。微滤液的体积是使用水平控制器，用与培养基相同组成的生理盐溶液自动恢复的。在微滤过程中，营养物是根据受限于生长速率的补料方案，以浓缩溶液的形式添加的。这允许避免不理想的代谢物溢流现象和在微滤培养基的输出流(洗脱液)中丢失营养物。这些条件导致发酵培养基的可溶性组分的连续稀释，因此生产的软骨素的一部分可见于渗透液中的。在微滤方案中，由于膜的阻力(Rm)和膜上形成的滤饼的阻力(Re)，在发酵方法的第三阶段中获得的渗透液含有低水平的大分子污染物(例如，蛋白质、LPS等)。 因此，可以在超滤膜(UF)上直接处理此类渗透液，避免蛋白酶预处理，相反所述预处理是在去除细胞组分后耗尽的培养肉汤所需要的。可选的，将微滤的渗透液添加到不含细胞组分的耗尽的培养肉汤中。从发酵肉汤中纯化软骨素分离生物量——在发酵方法末期，可以通过微滤或离心，或通过使用Fimda板式过滤器的土过滤(earth filtration)，来实现生物量去除。通过微滤去除生物量——微滤方法在发酵方法的末期持续，中断添加生理盐水。 当微滤液中的生物量的量达到方法相容的最大值时(300-400g湿生物量L—1，对应于浓缩发酵肉汤的体积3-5倍)，添加一倍体积的去离子水，继续微滤；重复该洗涤步骤至少3次。 将在发酵过程中生产的所有渗透液和与去除生物量(无细胞培养基)相关的渗透液倒在一起，进行下游方法的后续步骤。可选的，可以将培养肉汤收集到消毒的容器中，并在特定的自动化系统中进行交叉流微滤处理，使用截留在0. 22至0. 6 □ m的盒式或优选中空纤维。在此情况下，操作条件涉及150CM 40°C之间的T，在0. 8至1. 2atm之间的跨膜压力，和40-100L · (min · mT1 的再循环切向流容量。施加较高的Δρ(>0. 5atm)导致跨膜流的增加和较短的处理时间， 但导致形成较厚的滤饼，后者阻止了完全回收洗脱液中的K4多糖。通过离心去除生物量——在发酵末期，通过连续离心从培养肉汤中分离生物量。 如果预先没有超滤，则在实施下游方法的后续阶段前，将回收的培养肉汤添加到超滤渗透液中。通过土过滤去除生物量——对于每升肉汤，所添加的过滤土(优选硅藻土 )的量等于肉汤中湿生物量重量的4-8倍，然后，将悬浮液补入FUNDA型平板滤器中，在压力下 (3-6bar)过滤。可以在通过特定的不对称微滤胶囊(例如，GE的0. 6至0. 2 □ m)微滤后， 处理澄清的肉汤(0D600 ( 0. 1)以蛋白质降解。蛋白质的水解降解——为了将含有K4多糖的培养基去蛋白质，添加一种或多种蛋白水解酶，优选真菌蛋白酶(米曲霉(Aspergillus oryzae) 2-6UL—1)，并允许根据使用的温度作用一定的时间长度05-37°C下l-;3h，4°C下8-20h)。超滤-渗滤——使用手动或自动化系统，超滤不含细胞组分和经去蛋白化的发酵材料，所述系统安装了用于切向超滤(UF)的膜，所述膜装备为盒式或中空纤维模块，由与方法相容的材料制造而成，优选聚醚砜或聚丙烯，截留为50-300KDa，优选lOOKDa，并具有包含在0. 02至0. 05m2/升待处理液体之间的面积。UF加工参数的操作范围实例是切向流再循环容量4-10L · min—1 ；跨膜压力0. 5-1. 4atm ；温度20_40°C ；pH 4-8。培养肉汤不含细胞并经过去蛋白化，如果没有分开处理，则可以补充来自发酵阶段的渗透液，将所述培养肉汤初始体积浓缩至多10-20倍，去除低分子量的污染物(盐、肽、剩余营养物)。之后，用去离子化水或超纯水(HPW 2-5体积)透析浓缩液，完全去除低分子量组分。酸处理——浓缩液进行酸水解有双重目的，即将K4多糖去果糖基化形成软骨素和果糖，以及将LPS脂多糖脱毒化，从沉淀的脂类组分(脂质A)中分离多糖组分(0-链)。使用的非穷举的水解条件实例是0. 5至3.0% (ν/ν)的醋酸，pH 2-4，温度60-100°C，水解时间1-池。在通过离心、过滤或微滤去除LPS的脂类组分后，使溶液成为中性pH，并与等体积的0. 1-0. 2M NaCl溶液混合，并再次浓缩-渗滤。可选的，可以在未浓缩的澄清肉汤去蛋白化后实施酸水解醋酸pH< 3， l-3h IOO0C )。该实验方法还导致脂多糖水解，和脂质A的后续释放及其沉淀，以及K4多糖的去果糖基化，从而产生软骨素。在水解后，冷却培养肉汤并离心，调节上清液至pH7，补充NaCl，然后浓缩并渗滤， 去除培养基的0-链和剩余组分。使用的膜(盒式或中空纤维模块)由与方法相容的材料制成，优选聚丙烯或聚醚砜，截留为lO-lOOKDa，优选50KDa，并具有0010-0005m2/升待处理液体的过滤面积。由于去果糖基化涉及k4多糖和软骨素的分子量之间约30%差异，故限制了膜的大小，因此，选定的截留分子范围允许良好的回收，同时保留从低分子量污染物中纯化的效应(醋酸钠、其他盐类、肽剩余物、0-链)。UF方法参数的操作范围实例是切向流再循环容量 4-10L .HiirT1 ；跨膜压力0. 8-1. 4atm ；温度20-40°C ;pH5_8。将上清液初始体积浓缩3-5倍， 去除大部分低分子量的污染物(果糖、0-链、盐)，然后用去离子化水(5. 2倍体积)渗滤，完全去除低分子量组分，并推动0-链(10-15KDa)与去果糖基化的软骨素(30_50KDa)分离。回收软骨素——可以如下回收滞留物中存在的软骨素a)通过用有机溶剂沉淀 (在存在0. 1-0. 3M氯化钠的条件下的2-5倍体积的95% ν/ν乙醇或丙酮)和之后在真空下热干燥；b)通过冻干；c)通过喷雾干燥器。要求保护的下游方法能够回收> 80%的理论值，导致生产> 95%纯度的软骨素， 内毒素含量降低> 104，蛋白质含量< 0.05%且丽30-50KD。在并非意在限制本发明范围的条件下，下列实施例描述了 K4多糖的重组过度生产子的构建，发酵对策和软骨素纯化的下游方法。实施例部分实施例1 构建重组EcK4rl用于构建重组子EcK4rl (大肠杆菌K4重组子1)的对策涉及为了在整个生长期内获得rfaH基因的持续转录，而在多拷贝(1- 的EcMwt (野生型K4大肠杆菌)内源性H(4 质粒中整合含有处于PGapPl (编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶，GADPH的基因的组成型Pl启动子的一部分)控制下的rfaH基因的表达盒。A)构建插入盒1)从EcMwt中提取基因组DNA——根据生产商提供的规程，使用Qiagen提供的 DNeasy Blood & Tissue试剂盒从EcK4wt中提取基因组DNA。2)适用于整合盒——在所有的PCR反应中，使用高保真的DNA聚合酶(Expand High Fidelity PCR System，Roche)，在扩增过程中降低失误率。根据相同的规程实施所有的扩增步骤，包括50-100ng起始材料；终浓度达200mM的引物Up ；终浓度达200mM的引物 Dw ；IX Taq缓冲液；IU Taq ；超纯milliQ H2O至50 μ 1终体积。表1列举了扩增实验中使用的所有引物。3)功能盒(片段I)的扩增~使用引物对pK4_up和FRT_dw(表1)扩增试剂盒提供的盒。pK4-up oligo含有与PK4质粒的5’部分相似的50bp区域，这是重组事件意在靶向的。使用的PCR模式是94°C下2' ；25个循环94°C下1'，56°C下Γ，72°C下2'； 72°C下 30〃。
4) Pgap (Pl)启动子(片段II)的扩增~使用EcMwt染色体DNA作为扩增甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子的模板。pGap_Up和pGap_dw引物(表1)用于根据下列模式的 PCR 反应94°C下 2' ；25 个循环94°C下 30〃，52°C下 30〃 ；72°C下 30"。表1 用于构建盒和用于在EcK4rl突变体中筛选阳性克隆的引物。
[0076J
权利要求
1.从细菌荚膜多糖前体制备软骨素的方法，其特征是生长和扩增包含至少一份改造拷贝的编码rfaH蛋白或其功能等价片段的序列的细菌。
2.根据权利要求1的方法，其中所述rfaH蛋白编码序列选自a.编码细菌中的rfaH蛋白的序列，b.能够在严紧条件下(例如，包括40至50°C之间的温度，1.2-1.8x HPB)与大肠杆菌 rfaH序列杂交的序列。
3.根据权利要求2的方法，其中所述rfaH序列或其功能等价片段包含在具有序列SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 13, SEQ ID N0:20 的表达盒内。
4.根据权利要求1-3的方法，其中所述细菌是大肠杆菌(Escherichiacoli)，选自菌株K5、Κ4、Κ30，具有作为多糖前体的Κ5、Κ4和Κ30荚膜多糖，或者所述细菌是多杀巴斯德 1 (Pasteurella multocida)。
5.根据权利要求1-4的方法，其中所述生产生物是在位置3的葡糖醛酸残基上具有果糖基化的荚膜多糖软骨素的大肠杆菌菌株EcK4。
6.根据权利要求5的方法，其中所述大肠杆菌K4菌株选自ATCC23502I(美国典型培养物收藏中心——USA)、菌株Bi 8337/41(国际埃希氏菌中心——丹麦)、菌株NCTC 9005(英国国立典型培养物收藏中心——UK)、菌株U1-41 2616 (Freiburg收藏中心)。
7.根据权利要求1-6的方法，其中所述rfaH蛋白编码序列是通过插入多个基因拷贝而改造的。
8.根据权利要求7的方法，其中所述多基因拷贝包括在染色体DNA、质粒元件或可转座元件中。
9.根据权利要求8的方法，其中所述质粒元件是K4中的内源性质粒，优选的特征是至少包括序列ID NO :1禾口 ID NO :6。
10.根据权利要求1-9的方法，其中所述rfaH蛋白编码序列是通过插入组成型启动子而改造的。
11.根据权利要求10的方法，其中所述组成型启动子选自甘油醛-3-磷酸脱氢酶编码基因的多重启动子和其他大肠杆菌蛋白质的组成型启动子，及其功能性等价片段。
12.根据权利要求1-11的方法，其中细菌的生长和扩增是通过在含有至少一种有机氮源、一种碳源和矿物盐的复杂培养基中培养而进行的。
13.根据权利要求12的方法，其中所述有机氮源选自一种或多种下列化合物酵母提取物、bacto casitone、胰蛋白胨、豆粉、棉花粉、豌豆粉；碳源选自一种或多种下列化合物 葡萄糖、蔗糖、乳糖、糊精、淀粉、玉米浆、甘油；矿物盐选自一种或多种下列的盐磷酸盐、 磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、盐酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐、钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、铵盐、锰盐、铁盐、铜盐。
14.根据权利要求12-13的方法，其中在培养基中，有机氮源的比例范围从0.1至 10%,优选从0. 1至3%，碳源的比例范围从0. 1至20%，优选从0. 5至5%，矿物盐的比例范围从1至5%，优选从1.5至2.5%。
15.根据权利要求1-14的方法，其中细菌的生长和扩增是在分批发酵的条件下进行的。
16.根据权利要求15的方法，其中，在分批阶段末期，随着营养物减少，通过添加浓缩的营养物溶液按补料-分批分案进行发酵。
17.根据权利要求16的方法，其中浓缩的营养物溶液包括碳源，例如甘油、葡萄糖、糊精、淀粉、玉米浆或其组合；和氮源，例如酵母提取物、大豆蛋白胨、植物蛋白水解物或其组I=I O
18.根据权利要求12-17的方法，其中碳源和氮源的重量比范围从1至20，优选从5至10。
19.根据权利要求16-18的方法，其中浓缩营养物溶液的添加是在检测了发酵材料的 PO2后进行的，且其中所述PA维持在10-50%，优选25-35%的空气饱和范围内。
20.根据权利要求19的方法，其中浓缩营养物溶液的添加是通过将营养物补料泵置于发酵材料的PH控制下进行的，且其中所述pH维持在6至7. 5，优选7. 2至7. 5的范围。
21.根据权利要求15-20的方法，其中a)分批阶段进行的时间范围从6至8小时，生物量浓度按湿重表示范围从0.6至1%;b)补料-分批阶段进行的时间范围从6至12小时，生物量浓度按湿重表示范围从15至 4(^广，该阶段是当微生物生长由于营养物耗尽而倾向于减慢时激活的，一般在发酵7- 后；其中，任选的，补料-分批阶段b)整合了发酵肉汤的微滤，所述微滤是基于由毒性分解代谢产物积累导致微生物生长率降低而激活的，优选在微生物生长12-48小时后进行，其中通过添加与培养基使用的相同组成的生理盐水保持发酵体积恒定，具有的生物量浓度按湿重表示范围从40至leOgL—1。
22.根据权利要求21的方法，其中微滤阶段是用板式结构(flatconfiguration)的膜或中空纤维膜进行的，截留在0. 1和0. 5μπι之间，优选在0. 1和0. 2μπι之间，操作的切向流为 80-120L(min · m2”，优选 90-100L(min-m2)-1。
23.根据权利要求1-22的方法，其中，在发酵末期，通过连续离心、过滤、优选在土滤器上进行，或者通过微滤，将生物量与培养肉汤分离，并回收无细胞的培养肉汤。
24.根据权利要求23的方法，其中为了获得软骨素，通过蛋白酶消化和酸热处理来处理包含软骨素的荚膜多糖前体的培养肉汤，组合至少一种下列额外的步骤超滤/渗滤、溶剂沉淀、真空过滤-干燥、喷雾干燥。
25.根据权利要求M的方法，其中蛋白酶消化是通过用2-5U/L的蛋白酶孵育无细胞培养肉汤来进行的，优选在室温下搅拌1-5小时，或在4°C搅拌IO-M小时。
26.根据权利要求M-25的方法，其中酸热处理是为了将K4荚膜多糖去果糖基化为软骨素；为了将LPS切割成寡糖(ο-链)和脂类(脂质A)组分，而通过用0.5%-2%稀释的醋酸，在60至110°C范围的温度下进行处理的，优选的时间范围是0. 5-2小时，其中所述脂类组分随后被沉淀并去除，例如通过离心。
27.根据权利要求23-26的方法，其中通过超滤/渗滤浓缩软骨素是在板式结构或中空纤维膜上进行的，截留分子量范围在50kDa至300kDa，优选IOOkDa,优选跨膜压力(TMP) 梯度范围从0. 8至1. 4atm，切向流为400_800L(h · m2”1。
28.根据权利要求23-27的方法，其中所述溶剂沉淀是通过向无细胞培养肉汤添加2-4 倍体积的可混溶有机溶剂，之后沉淀软骨素而进行的，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮。
29.根据权利要求23-28的方法，其中醋酸处理是在超滤/渗滤浓缩后进行的。
30.根据权利要求23-29的方法，为了回收形式为任选的干燥沉淀物的软骨素，还包括超滤和喷雾干燥器的干燥步骤。
31.制备硫酸软骨素的方法，其特征是使用根据权利要求1-30的方法，并进一步包括软骨素的位点选择性化学硫酸化作用。
32.大肠杆菌K4菌株，其特征是包括至少一个拷贝的改造的rfaH基因。
33.根据权利要求32的菌株，其中所述rfaH蛋白编码序列或其功能等价片段经改造包括多个基因拷贝，可选的或组合的包含在染色体DNA、质粒元件或可转座的元件中。
34.根据权利要求32-33的改造的大肠杆菌K4菌株，其中rfaH蛋白编码序列处于组成型启动子的控制下。
35.根据权利要求30的菌株，其特征是包括至少一种选自SEQIDN0:1、SEQIDN0 :6、 SEQIDN0 9, SEQIDN0 11, SEQIDN0 12、SEQIDN0 13、SEQIDN0 20 的序列。
全文摘要
描述了通过发酵遗传突变的细菌，高浓度的生产软骨素的创新方法。
文档编号C12P19/26GK102459625SQ201080032889
公开日2012年5月16日 申请日期2010年5月25日 优先权日2009年5月25日
发明者C·斯基拉尔迪, D·奇米尼, M·德罗萨 申请人:阿尔特刚股份有限公司