专利名称：一种新的用于生成诱导性多能干(iPS)细胞或组织特异性细胞的蛋白质递送系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于治疗目的的蛋白质递送系统；更特别地，所述蛋白质递送系统可以用于递送重编程因子(reprogramming factor),致使体细胞分化为用于再生医学或疾病治疗的多能干(iPS)细胞或组织特异性细胞。
背景技术：
在过去，已通过核移植和细胞融合的方式来生成多能干细胞(Shinya Yamanaka, Pluripotency and Nuclear Reprogramming, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363(1500) :2079-2087 (June 27,2008))。两种方法都需要胚胎干细胞，这给研究和治疗使用都带来了伦理困境。通过最近发现的诱导性多能干(iPS)细胞克服了这个问题，所述诱导性多能干(iPS)细胞具有胚胎干(ES)细胞的同样吸引人的生物学特性(Yamanaka， A Fresh Look at iPS Cells. Cell 137 :13-17(S. 2009))。通过迫使确定因子的表达，于2006年首次由小鼠成纤维细胞生成诱导性多能干细胞(Takahashi, Y.和 S. Yamanaka, Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors, Cell 126 663-676(2006))并且于2007年首次由人成纤维细胞生成诱导性多能干细胞(Yu Junying, 等人，Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells, Science 318 :1917-1920 (2007), Takahashi, K.,等人 Induction of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblasts by Defined Factors,Cell 131 :861-872 (2007))。 在以下的研究中一个包括 0ct-3/4、Sox2、Klf4 和 c-Myc (Takahashi, Cell 126 :663-676 ； Takahashi, Cell 131 :861-872);另一个包括 0ct4、Sox2、Nanog 和 Lin28 (Junying, Cell 318 :1917-1920),两组因子已用于引发将成年体细胞重编程为iPS细胞。通过抑制(knock down)p53的活性可以将这些确定因子的重编程效率提高10倍。在2008年,Melton组证实了通过递送三种转录因子,Ngn3 (也称为Neurog3)、Pdxl 和Mafa的特定组合，将成年小鼠的分化的胰腺外分泌细胞重编程为与β -细胞非常相似的细胞(Zhou, Q.等人，In Vivo Reprogramming of Adult Pancreatic Exocrine Cells to β-cells，Nature 455:627-633(2008))。诱导的细胞与内源性胰岛细胞在形态上不可区分；它们表达对细胞功能必须的基因，并且可以通过重塑局部脉管系统和分泌胰岛素来改善高血糖症。该研究提示，在不逆转为多能干细胞状态的情况下，可以通过转录因子的特定组合直接将成年体细胞重编程为组织特异性细胞。iPS细胞的潜力是巨大的。然而，iPS细胞的临床应用面临许多障碍(Yamanaka， Cell 137 :13-17 ；Miura, K.等人，Variation in the Safety of Induced Pluripotent Stem Cell Lines, Nature Biotechnology 27(8) :743-745(2009) ；Carpenter, M.等人，Developing Safe Therapies From Human Pluripotent Stem Cells, Nature Biotechnology 27:606-613(2009))。一个主要障碍是与重编程因子的递送载体直接相关。最初，通过逆转录病毒载体或慢病毒载体将重编程因子基因引入躯体成纤维细胞(Takahashi, Cell 126 :663-676 Junying, Cell 318 :1917-1920 ;Takahashi, Cell 131 861-8723-5)。通过逆转录病毒载体或慢病毒载体重编程的方法仅有 O. 05%的效率 (0kita,K.等人,Generation of Mouse Induced Pluripotent Stem Cells Without Viral Vectors,Science 322 :949-953 ;Yamanaka,S. Elite and Stochastic Models for Induced Pluripotent Stem Cell Generation, Nature 460:49-52(2009))。癌基因的插入激活一直是使用逆转录病毒载体或慢病毒载体的主要关注的问题， 因为这些载体随机地整合到宿主的基因组。尽管在iPS细胞中转基因大量沉默，但c-myc 转基因的再活化可以导致肿瘤发生(Okita,K.,等人,Generation of Germline-Competent Induced Pluripotent Stem Cells, Nature 448 :313-318 (2007))。这些转基因的渗漏表达也可以抑制全iPS细胞的分化和成熟,导致畸胎瘤形成的更大风险(Yamanaka, Cell 137 13-17)。此外，在由iPS细胞再分化的细胞中，可以使转基因再活化和表达，导致iPS细胞的再编程分化状态或肿瘤形成的风险。非整合病毒载体，例如腺病毒载体随后用于递送这些重编程因子基因(Zhou， Nature 455 :627-633 ；Stadtfeld, Μ.等人，Induced Pluripotent Stem Cells Generated Without Viral Integration, Science 322:945-949(2008))。然而，对于有效转导至缺乏腺病毒受体CAR的细胞类型，需要大量的腺病毒载体，所述大量的腺病毒载体可以引起对细胞的致细胞病变效应。此外，如果选择“非-无内容(non-gutless) ”腺病毒载体作为递送载体，那么一些腺病毒基因的低水平表达可以影响转导的细胞。也可以经直接的质粒转染来实现重编程(Okita, Science 322 :949-953 ；Yu, J.等人，Human Induced Pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences, Science 324 :797-801 (2009))，但其效率比逆转录病毒载体的效率低100倍多(Okita, Science 322:949-953)。腺病毒载体转导和质粒转导两者可能都不排除稳定的整合。腺病毒载体的整合频率为 ICT3至ICT5/细胞(Harui, A.等人，Frequency and Stability of Chromosomal Integration of Adenovirus Vectors, J. Virology 73:6141-6146(1999))。生产多能干细胞的方法的比较显示于表I中。表I.用于生成多能干细胞的三种方法的优点和缺点
权利要求
1.一种用于生成诱导性多能干(iPS)细胞的构建体，该构建体包括受体结合结构域、转运结构域、货物承载结构域和诱导物。
2.根据权利要求1所述的构建体，其中，所述受体结合结构域、转运结构域和货物结构 域是外毒素结构域。
3.根据权利要求2所述的构建体，其中，所述外毒素是梭菌属(Clostridium)毒素。
4.根据权利要求3所述的构建体，其中，所述梭菌属毒素是艰难梭菌(C.difficile)毒素。
5.根据权利要求4所述的构建体，其中，所述艰难梭菌毒素是TcdA。
6.根据权利要求4所述的构建体，其中，所述艰难梭菌毒素是TcdB。
7.根据权利要求2所述的构建体，其中，所述外毒素是无毒的。
8.根据权利要求3所述的构建体，其中，所述梭菌属毒素是肉毒梭菌(C.botulinum)毒素。
9.根据权利要求7所述的构建体，其中，所述肉毒梭菌毒素选自BoNTA、BoNTB、BoNTC、 BoNTD、BoNTE、BoNTF 和 BoNTG。
10.根据权利要求7所述的构建体，其中，用非特异性受体结合结构域来替代所述肉毒 梭菌毒素的受体结合结构域。
11.根据权利要求3所述的构建体，其中，所述梭菌属毒素是梭菌的C2毒素。
12.根据权利要求1所述的构建体，其中，所述诱导物是0ct3/4。
13.根据权利要求12所述的构建体，其中，所述构建体具有包含序列IDNo. 1的序列。
14.根据权利要求12所述的构建体，其中，所述构建体具有包含序列IDNo. 2的序列。
15.根据权利要求12所述的构建体，其中，所述构建体与选自序列IDNo.1和序列ID No. 2的序列具有基本上相同的序列。
16.根据权利要求1所述的构建体，其中，所述诱导物是Sox2。
17.根据权利要求16所述的构建体，其中，所述构建体具有包含序列IDNo. 3的序列。
18.根据权利要求16所述的构建体，其中，所述构建体具有包含序列IDNo. 4的序列。
19.根据权利要求16所述的构建体，其中，所述构建体与选自序列IDNo.1和序列ID No. 2的序列具有基本上相同的序列。
20.根据权利要求1所述的构建体，其中，所述诱导物选自Klf4、c-Myc、Nanog、lin28、 hTERT (人端粒酶)和SV40大T抗原。
21.根据权利要求1所述的构建体，其中，所述货物承载结构域是无活性的外毒素结构域。
22.一种用于生成诱导性多能干(iPS)细胞的构建体，该构建体包括无毒的梭菌属毒素和诱导物，其中所述梭菌属毒素还包含受体结合结构域和转运结构域。
全文摘要
描述了一种新的用于生成诱导性多能干(iPS)细胞的蛋白质递送系统。该递送系统包括构建体，所述构建体具有识别体细胞中的受体的受体结合结构域、允许诱导物转移至胞质腔的转运结构域和诱导物与其连接并促进诱导物转移至细胞的货物承载结构域。
文档编号C12N15/31GK102612562SQ201080048916
公开日2012年7月25日 申请日期2010年8月27日 优先权日2009年8月27日
发明者G·A·奥伊勒, 张永年 申请人:色奈普提科研究有限公司