专利名称：用于诊断和治疗脑炎或癫痫的方法
技术领域：
本发明涉及用于在对象中诊断和治疗自身免疫性脑炎或癫痫的方法，其使用针对抑制性Y -氨基丁酸-B (GABAb)受体的抗体。
背景技术：
突触可塑性是神经元的基本特性，其构成记忆、学习和认知机制的基础。可塑性依赖于离子通道和突触受体间复杂的相互作用，所述受体包括兴奋性谷氨酸N-甲基-D-天冬 氨酸受体(NMDAR)和α -氨基-3-羟基-5-甲基_4_异恶唑丙酸受体(AMPAR)。这些受体被药物学或遗传学阻断的动物模型产生严重改变的记忆、学习、行为和癫痫发作。因此，可预期针对这些受体的胞外结构域的免疫应答将导致相似的症状。事实上，最近鉴定的两种与NMDAR的NRl亚基和AMPAR的GluRl/2亚基的胞外表位的抗体相关的疾病导致了表现出突出的精神、行为和记忆问题的脑炎，其通常伴有癫痫发作。在这两种突触自身免疫中，每一抗体均在培养的神经元中引起靶受体水平剧烈和特异的降低，表明它们是致病性的。此夕卜，神经系统综合征通常响应治疗，并且在某些患者中免疫应答作为表达靶受体的肿瘤的副肿瘤表现而发生，其在许多方面与神经肌肉突触的自身免疫性疾病(如，兰伯特-伊顿(Lambert-Eaton)综合征和重症肌无力)类似。这些发现以及某些疾病(如，抗NMDAR脑炎)显著的特异性和高频率的抗体综合征已经引起对其它记忆和行为受损和频繁发生癫痫发作的综合征的注意。在某些此类综合征中，经验性免疫疗法的临床疗效、表明边缘叶脑炎的脑脊液(CSF)磁共振成像(MRI)结果或针对仍未知的神经元胞外抗原的抗体的检出提示了免疫介导的发病机理。对多种抗原功能的更好的理解可以帮助改进治疗策略。然而，对目前面临这些患者的临床医生，影响神经系统疗效的最好的机会取决于(I)对疾病的快速诊断，(2)肿瘤的早期发现和治疗，和(3)免疫疗法的使用。因此，存在对改进的诊断和治疗自身免疫性脑炎或癫痫发作的方法的需要。发明概述在一个实施方案中，本发明提供了用于诊断对象中的脑炎的方法，其包括步骤从所述对象获得生物学样品；和测试所述生物学样品以确定针对GABAb受体的抗体的存在，其中在所述生物学样品中存在所述抗体代表自身免疫性脑炎，从而确定所述对象中脑炎的病因。在示例性的实施方案中，所述抗体结合GABAb受体的BI亚基。在另一个实施方案中，本发明提供了用于诊断对象中与自身免疫性脑炎相关的隐匿性肿瘤的方法，其包括步骤从所述对象获得生物学样品；和测试所述生物学样品以确定针对GABAb受体的抗体的存在，其中在所述生物学样品中存在所述抗体代表在所述对象中存在所述隐匿性肿瘤，并且该肿瘤是所述自身免疫性脑炎的病因。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于诊断对象中的癫痫的方法，其包括步骤从所述对象获得生物学样品；和测试所述生物学样品以确定针对GABAb受体的抗体的存在，其中在所述生物学样品中存在所述抗体代表在所述对象中存在肿瘤，并且所述肿瘤是所述癫痫的病因，从而诊断所述对象中的所述癫痫。在另一个实施方案中，本发明提供了用于诊断患有癫痫的对象中的肿瘤的方法，其包括步骤从所述对象获得生物学样品；和测试所述生物学样品以确定针对GABAb受体的抗体的存在，其中在所述生物学样品中存在所述抗体代表在所述对象中存在肿瘤，从而诊断所述患有癫痫的对象中的所述肿瘤。在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗对象中的自身免疫性脑炎的方法，其包括步骤通过测试来自所述对象的体液中的针对GABAb受体的抗体来检测与所述自身免疫性脑炎相关的肿瘤，其中在所述体液中存在所述抗体代表在所述对象中存在所述肿瘤，并且所述肿瘤是所述自身免疫性脑炎的病因；和治疗所述肿瘤。在另一个实施方案中，本发明提供了用于检测针对GABAb受体的抗体的方法，其中 所述抗体的检出导致用免疫疗法来治疗癫痫或脑炎。通过以下详细描述的实施例和附图
，本发明其它的特点和优势将显而易见。然而，应理解详细的说明书和具体的实施例在表明本发明优选的实施方案的同时仅以说明性的方式给出，因为根据本详细说明书在本发明的精神和范围内的各种改变和修改对本领域技术人员将是显而易见的。附图概述本专利或申请文件包含至少一幅彩色形式附图。在提出要求并支付必要的费用后，将提供含有彩色附图的本专利或专利申请出版物的拷贝。图I显示了具有针对GABAb受体的抗体并患有边缘叶脑炎的患者的MRI。在初诊(presentation)时(A)拍摄的来自病例I的轴位FLAIR脑MRI,在内侧颞叶(箭头)显示了增强的信号，在左侧更显著。I个月后的重复研究(B)显示了改善。在初诊后的3个月和9个月后的重复研究(C，D)是稳定的。图2显示了用患者的抗体免疫标记的大鼠脑。用患有边缘叶脑炎的患者的CSF抗体免疫染色的大鼠脑矢状切面。在海马、丘脑、小脑和大脑皮质的神经毡中观察到广泛的染色。图3显示了患者的抗体与胞外表位反应并沉淀GABAb受体的BI和B2亚基。将大鼠海马神经元培养物(活的，非透化处理的)与患有LE的患者的CSF孵育。深色的点样反应代表患者的抗体与细胞表面抗原(A);标尺=10 μ mo使用患者的抗体沉淀的这些抗原示于用EZBlue可视化蛋白质的凝胶中(B)。患者的抗体(P)沉淀了 2条在 105_90kDa的蛋白质条带；使用来自对照个体(N)的CSF的沉淀中见不到这些条带。使用质谱分析对所有条带进行测序，确定了 GABAb受体的BI和B2亚基。其它较小的条带为蛋白降解片段和患者的免疫球蛋白G(IgG)。随后将凝胶转移至硝酸纤维素膜并用特异性针对每一 GABAb亚基的单克隆抗体进行免疫印迹，确定了患者的抗体可沉淀BI和B2亚基(D)。图4显示了患者的抗体在神经元突触中特异性地识别GABAb受体。用患者抗体(绿色)、针对GABAbi受体胞内表位的豚鼠多克隆抗体(红色)和突触前标记物巴松管蛋白(basson)(蓝色)三重标记的培养的大鼠胚胎海马神经元的共聚焦图像(a)。来自同一神经元的树突区域显示了患者的抗体染色(b)、豚鼠多克隆GABAbi受体抗体染色(C)、患者和豚鼠抗体染色(d)和三重染色(e)。24个神经元树突的共定位标记定量示于(f)。图5显示了使用基于HEK293细胞的测定检测针对GABAbi亚基的抗体。用GABAb受体BI和B2亚基转染的HEK293细胞显示了对来自患有边缘叶脑炎的患者的CSF (a)和针对GABAb受体BI亚基的多克隆抗体(b)的反应性；两种反应性整合在(c)中。同样的细胞不与来自对照个体(d)的CSF反应；反应性整合在(f)中。免疫荧光法；X400倍。图6显示了小细胞肺癌的GABAb受体表达。用针对GABAbi受体的多克隆抗体和生物素标记的来自具有针对GABAbi受体的抗体的患者的IgG免疫染色两个SCLC (a, c)的连续切面。两种抗体显示了混合的免疫染色，表明在两个SCLC中都表达GABAbi受体。抗生物素蛋白-生物素过氧化物酶方法；用苏木精轻度复染的切面；X400倍。图7显示了使用基于HEK293细胞的测定检测GABABR_ab。转染HEK293细胞使其表达GABAB1/B2受体并且与患者活的非透化处理的CSF孵育。之后，固定细胞并且与针对GABAb 受体BI亚基的胞内表位的多克隆抗体孵育。注意到患者的CSF将特异性表达GABAb受体的细胞的细胞表面染色(A)，如通过胞内报告抗体证实的那样(B)。两者的反应性整合示于Co细胞核用DAPI复染。标尺=20 μ m。图8显示了与具有GABABR_ab的患者的CSF体内孵育的大鼠海马神经元的初级培养物。在神经元细胞膜中存在深色点状反应。标尺=20 μ m。发明详述本发明涉及用于在对象中诊断和治疗自身免疫性脑炎或癫痫的方法，其使用针对GABAb受体的抗体。在一个实施方案中，本文提供的是用于诊断对象中脑炎的方法，其包括步骤从所述对象获得生物学样品；和测试所述生物学样品以确定针对GABAb受体的抗体的存在，其中在所述生物学样品中存在所述抗体代表自身免疫性脑炎，从而确定所述对象中脑炎的病因。在另一个实施方案中，本文提供的是用于诊断对象中与自身免疫性脑炎相关的肿瘤的方法，其包括步骤从所述对象获得生物学样品；和测试所述生物学样品以确定针对GABAb受体的抗体的存在，其中在所述生物学样品中存在所述抗体代表在所述对象中存在隐匿性肿瘤，并且所述肿瘤是所述自身免疫性脑炎的病因。在另一个实施方案中，本文提供的是用于诊断对象中的癫痫的方法，其包括步骤从所述对象获得生物学样品；和测试所述生物学样品以确定针对GABAb受体的抗体的存在，其中在所述生物学样品中存在所述抗体代表在所述对象中存在肿瘤，并且所述肿瘤是所述癫痫的病因，从而诊断该对象中的该癫痫。在另一个实施方案中，本文提供的是用于诊断患有癫痫的对象中的肿瘤的方法，其包括步骤从所述对象获得生物学样品；和测试所述生物学样品以确定针对GABAb受体的抗体的存在，其中在所述生物学样品中存在所述抗体代表在所述对象中存在所述肿瘤，从而诊断所述患有癫痫的对象中的所述肿瘤。在另一个实施方案中，本文提供的是用于治疗对象中的自身免疫性脑炎的方法，其包括步骤通过测试来自所述对象的体液中的针对GABAb受体的抗体来检测与所述自身免疫性脑炎相关的肿瘤，其中在所述体液中存在所述抗体代表在所述对象中存在所述肿瘤，并且所述肿瘤是所述自身免疫性脑炎的病因；和治疗所述肿瘤。在一个实施方案中，本发明提供了确定对象中的脑炎病因的方法，其包括步骤测试所述对象的体液中的针对GABAb受体的抗体，从而在对象中确定脑炎的病因。在另Iv实施方案中，在体液中存在GABAB受体BI亚基的抗体代表该脑炎为自身免疫病源的。在另一个实施方案中，在体液中存在GABAb受体B2亚基的抗体代表所述脑炎为自身免疫病源的。每一可能性代表了本发明独立的实施方案。 在另一个实施方案中，本文提供的方法和组合物有利于对严重形式的自身免疫性脑炎的识别，所述脑炎通常对治疗有响应。在另一个实施方案中，本文描述的方法和组合物强调了自身免疫可影响行为的概念，尤其是针对GABAb受体的抗体可能改变情感(在一个实施方案中)或记忆，意识或它们的组合(在其它独立的实施方案中)。在另一个实施方案中，本发明提供了确定对象中自身免疫性脑炎病因的方法，其包括步骤测试所述对象的体液中的针对GABAb受体的抗体，从而确定对象中自身免疫性脑炎的病因。在另一个实施方案中，在对象中存在抗体代表存在肿瘤。在另一个实施方案中，肿瘤是自身免疫性脑炎的病因。每一可能性代表了本发明独立的实施方案。 在另一个实施方案中，本发明提供了诊断对象中自身免疫性脑炎的方法，其包括步骤测试对象的体液中的针对GABAb受体BI亚基的抗体，从而诊断所述对象中的所述自身免疫性脑炎。在本文描述的方法中使用的生物学样品为通过本发明的方法测试的体液，在另一个实施方案中为脑脊液(CSF)。在另一个实施方案中，所述体液为血浆。在另一个实施方案中，体液为本领域已知的任何其它类型的流体。每一可能性代表了本发明独立的实施方案。在另一个实施方案中，生物学样品是羊水、血液、血清、唾液或在另一个实施方案中为它们的组合。在另一个实施方案中，本发明的方法和组合物的脑炎为自身免疫性脑炎。在一个实施方案中，自身免疫性脑炎是副肿瘤脑炎。在另一个实施方案中，自身免疫性脑炎为非副肿瘤脑炎。在另一个实施方案中，自身免疫性脑炎为副肿瘤自身免疫性脑炎。在另一个实施方案中，自身免疫性脑炎为非副肿瘤自身免疫性脑炎。在另一个实施方案中，自身免疫性脑炎为本领域已知的任何其它类型的自身免疫性脑炎。每一可能性代表了本发明独立的实施方案。在一个实施方案中，通过本文描述的方法诊断副肿瘤抗GABAb脑炎的频率是未知的。在另一个实施方案中，副肿瘤抗GABAb脑炎频繁地未被识别。这可能是由若干令该疾病在副肿瘤脑炎中独特的特征所引起的，包括在一个实施方案中，20岁 50岁之间的相对年轻的女性，或在另一个实施方案中，罕见的具有突出精神病学症状的表现，或在另一个实施方案中，正常或非典型的MRI结果，其在75%的病例中由轻度、短暂的内侧颞叶外侧T2或FLAIR异常组成，其在某实施方案中伴有皮质增强，或还在另一个实施方案中，伴有卵巢肿瘤的良性表现。在一个实施方案中，使用本文描述的方法诊断任何表现出上文描述的症状的对象。在另一个实施方案中，自身免疫性脑炎为边缘叶脑炎。在另一个实施方案中，自身免疫性脑炎与边缘性机能失调相关。在另一个实施方案中，自身免疫性脑炎与边缘性机能失调无关。每一可能性代表了本发明独立的实施方案。在一个实施方案中，边缘叶脑炎引起典型地由快速和严重短期记忆丧失主导的令人印象深刻的缺陷。在另一个实施方案中，患者在成年后生活中显示了亚急性的脑炎，其主要影响边缘区域，在一个实施方案中其显示为癌症。在一个实施方案中，术语“边缘叶脑炎”指对象显示出严重的短期记忆丧失和与支气管癌相关的痴呆。在另一个实施方案中，本发明的方法和组合物的自身免疫性脑炎与癫痫发作相关。在另一个实施方案中，自身免疫性脑炎与间脑综合征相关。在另一个实施方案中，自身免疫性脑炎与精神病学症状相关。在另一个实施方案中，自身免疫性脑炎与认知异常相关。在另一个实施方案中，自身免疫性脑炎与行为异常相关。在另一个实施方案中，自身免疫性脑炎与健忘症相关。在另一个实施方案中，自身免疫性脑炎与记忆障碍相关。在另一个实施方案中，自身免疫性脑炎与记忆问题相关。在另一个实施方案中，自身免疫性脑炎与运动功能减退综合征相关。在另一个实施方案中，自身免疫性脑炎与运动障碍相关。在另一个实施方案中，自身免疫性脑炎与异常运动相关。在另一个实施方案中，运动障碍为本领域已知的任何其它运动障碍。每一可能性代表了本发明独立的实施方案。
在另一个实施方案中，自身免疫性脑炎与意识水平下降相关。在另一个实施方案中，自身免疫性脑炎与肺换气不足相关。在另一个实施方案中，自身免疫性脑炎与脑或脊髓任何部分机能失调相关。在另一个实施方案中，自身免疫性脑炎与任何上述症状或疾病的组合相关。每一类型的脑炎代表了本发明独立的实施方案。在一个实施方案中，自身免疫性脑炎与肿瘤相关。在一个实施方案中，肿瘤为肺癌或小细胞肺癌(SCLC)型神经内分泌肿瘤。在另一个实施方案中，肿瘤为卵巢畸胎瘤。在另一个实施方案中，肿瘤为胸腺肿瘤。在另一个实施方案中，肿瘤为睾丸肿瘤。在另一个实施方案中，与脑炎相关的癌症为子宫颈癌肿瘤。在另一个实施方案中，癌症为头颈癌肿瘤。在另一个实施方案中，癌症为乳腺癌肿瘤。在另一个实施方案中，癌症为肛门生殖器癌肿瘤。在另一个实施方案中，癌症为黑色素瘤。在另一个实施方案中，癌症为肉瘤。在另一个实施方案中，癌症为恶性肿瘤。在另一个实施方案中，癌症为淋巴瘤。在另一个实施方案中，癌症为白血病。在另一个实施方案中，癌症为间皮瘤。在另一个实施方案中，癌症为神经胶质瘤。在另一个实施方案中，癌症为生殖细胞瘤。在另一个实施方案中，癌症为绒毛膜癌。每一可能性代表了本发明独立的实施方案。在另一个实施方案中，癌症为胰腺癌。在另一个实施方案中，癌症为卵巢癌。在另一个实施方案中，癌症为胃癌。在另一个实施方案中，癌症为胰腺的恶性病变。在另一个实施方案中，癌症为肺腺癌。在另一个实施方案中，癌症为结直肠腺癌。在另一个实施方案中，癌症为肺鳞腺癌。在另一个实施方案中，癌症为胃腺癌。在另一个实施方案中，癌症为卵巢表面上皮肿瘤(如，其良性增生或恶性变种)。在另一个实施方案中，癌症为口腔鳞状细胞癌。在另一个实施方案中，癌症为小细胞肺癌。在另一个实施方案中，癌症为子宫内膜癌。在另一个实施方案中，癌症为膀胱癌。在另一个实施方案中，癌症为头颈癌。在另一个实施方案中，癌症为前列腺癌。在另一个实施方案中，癌症为急性骨髓性白血病(AML)。在另一个实施方案中，癌症为骨髓增生异常综合征(MDS)。在另一个实施方案中，癌症为非小细胞肺癌(NSCLC)。在另一个实施方案中，癌症为韦氏肿瘤(Wilm' s tumor)。在另一个实施方案中，癌症为白血病。在另一个实施方案中，癌症为淋巴瘤。在另一个实施方案中，癌症为促纤维增生性小圆细胞肿瘤。在另一个实施方案中，癌症为间皮瘤(如恶性间皮瘤)。在另一个实施方案中，癌症为胃癌。在另一个实施方案中，癌症为结肠癌。在另一个实施方案中，癌症为肺癌。在另一个实施方案中，癌症为乳腺癌。在另一个实施方案中，癌症为生殖细胞瘤。在另一个实施方案中，癌症为卵巢癌。在另一个实施方案中，癌症为子宫癌。在另一个实施方案中，癌症为甲状腺癌。在另一个实施方案中，癌症为肝细胞癌。在另一个实施方案中，癌症为甲状腺癌。在另一个实施方案中，癌症为肝癌。在另一个实施方案中，癌症为肾癌。在另一个实施方案中，癌症为Kaposis肉瘤。在另一个实施方案中，癌症为肉瘤。在另一个实施方案中，癌症为另一恶性肿瘤或肉瘤。
在另一个实施方案中，肿瘤为本领域已知的任何其它类型的肿瘤。每一可能性代表了本发明独立的实施方案。在另一个实施方案中，本发明提供了确定对象中癫痫病因的方法，其包括步骤测试所述对象的体液中的针对GABAB受体的抗体，从而确定该对象中所述癫痫的病因。在另一个实施方案中，抗体代表在对象中存在肿瘤。在另一个实施方案中，肿瘤是癫痫的病因。每一可能性代表了本发明独立的实施方案。在另一个实施方案中，本发明的方法和组合物的癫痫为原发性癫痫。在另一个实施方案中，癫痫响应IgG消除疗法。在另一个实施方案中，癫痫与部分性发作相关。在另一个实施方案中，癫痫与简单部分性发作相关。在另一个实施方案中，癫痫与复杂部分性发作相关。在另一个实施方案中，癫痫与全身性发作相关。在另一个实施方案中，癫痫与失神发作(小发作)相关。在另一个实施方案中，癫痫与肌阵挛性发作相关。在另一个实施方案中，癫痫与强直阵挛发作(大发作)相关。在另一个实施方案中，癫痫与West综合征相关。在另一个实施方案中，癫痫与Lennox-Gastaut综合征相关。在另一个实施方案中,癫痫与本领域已知的任何其它综合征相关。在另一个实施方案中，癫痫无已知病因。在另一个实施方案中，癫痫为本领域已知的任何其它类型的癫痫。每一类型的癫痫代表了本发明独立的实施方案。在另一个实施方案中，自身免疫性脑炎、癫痫等的“病因”，是指所述疾病的主要病因。在另一个实施方案中，该术语是指对所述疾病有贡献的病因。在另一个实施方案中，该术语是指间接的病因。在另一个实施方案中，该术语是指通过肿瘤诱导的免疫应答形成的病因。在另一个实施方案中，该术语是指所述疾病显著的病因。每一可能性代表了本发明独立的实施方案。在另一个实施方案中，本发明提供了用于诊断患有脑炎的对象中的肿瘤的方法，其包括步骤在所述测试对象的体液中针对GABAb受体的抗体，从而诊断所述患有脑炎的对象中的肿瘤。在另一个实施方案中，在对象中存在所述抗体代表存在肿瘤。每一可能性代表了本发明独立的实施方案。在另一个实施方案中，本发明提供了用于检测患有脑炎的对象中的肿瘤的方法，其包括步骤测试所述对象的体液中的针对GABAb受体的抗体，从而检测所述患有脑炎的对象中的所述肿瘤。在另一个实施方案中，在对象中存在所述抗体代表存在肿瘤。每一可能性代表了本发明独立的实施方案。
在一个实施方案中，本发明提供了用于诊断患有癫痫的对象中的肿瘤的方法，其包括步骤测试所述对象的体液中的针对GABAb受体的抗体，从而诊断所述患有癫痫的对象中的所述肿瘤。在另一个实施方案中，在对象中存在所述抗体代表存在肿瘤。每一可能性代表了本发明独立的实施方案。在一个实施方案中，本发明提供了用于检测患有癫痫的对象中的肿瘤的方法，其包括步骤测试所述对象的体液中的针对GABAb受体的抗体，从而检测所述患有癫痫的对象中的所述肿瘤。在另一个实施方案中，在对象中存在所述抗体代表存在肿瘤。每一可能性代表了本发明独立的实施方案。在一个实施方案中，本发明提供了诊断或检测对象中的GABAb介导的疾病的方法，其包括步骤测试所述对象的体液中的针对GABAB受体的抗体的抗体，从而诊断或检测所述对象中的所述GABAb介导的疾病。GABAb受体通过两种机制介导突触前抑制激活G蛋白质偶联的内向整流型钾离子通道(GIRK)和抑制钙离子通道。它们还减少突触前放电频率。在突触后，GABAb受体通 过相似的机制和通过诱导慢抑制性突触后电位(IPSP)介导抑制。在神经元网络水平，GABAb受体通过限制网络高活性状态的持续时间、预防过度的神经元同步化和允许新刺激打破同步活性来调节其活性。GABAb受体广泛地分布于脑和脊髓，但在海马、丘脑和小脑尤其丰富，其为用患者的抗体免疫标记大鼠脑更深色的区域。患者的抗体主要的自身抗原，GABAbi亚基，对结合GABA (和受体功能)是必须的，而GABAb2亚基是将该受体定位于细胞膜适当的区域和与G蛋白偶联所需要的。在转基因小鼠中GABAbi缺失导致显著的癫痫发作、记忆障碍和焦虑行为增加。遗传学和药物学证据都支持GABAb受体在控制焦虑和调节情绪中的重要作用。在一个实施方案中，本发明提供了治疗对象中自身免疫性脑炎的方法。在一个实施方案中，所述方法包括步骤通过测试来自所述对象的体液中的针对GABAb受体的抗体来检测与自身免疫性脑炎相关的肿瘤，其中在所述对象中存在所述抗体代表存在所述肿瘤，并且该所述肿瘤是所述自身免疫性脑炎的病因。在另一个实施方案中，所述方法包括治疗所述肿瘤的步骤。在另一个实施方案中，在早期阶段期间治疗所述肿瘤。在另一个实施方案中，在与自身免疫性脑炎相关的症状发病的4个月内治疗肿瘤。在另一个实施方案中，在与自身免疫性脑炎相关的症状发病的3个月内治疗肿瘤。在另一个实施方案中，在与自身免疫性脑炎相关的症状发病的2个月内治疗肿瘤。在另一个实施方案中，在与自身免疫性脑炎相关的症状发病的I个月内治疗肿瘤。在一个实施方案中，治疗所述肿瘤的步骤包括去除该肿瘤。在另一个实施方案中，治疗所述肿瘤的步骤包括免疫治疗。在另一个实施方案中，治疗所述肿瘤的步骤包括联合免疫治疗去除该肿瘤。在另一个实施方案中，治疗所述肿瘤的步骤包括化学治疗。在另一个实施方案中，治疗所述肿瘤的步骤包括联合化学治疗去除该肿瘤组合。在一个实施方案中，GABAb受体包括亚基。在另一个实施方案中，GABAb受体由BI和B2亚基的异聚体形成。在另一个实施方案中，需要两种亚基来产生功能性的受体，其包含BI和B2亚基。在另一个实施方案中，本发明的方法和组合物的BI亚基为Bl-a亚基。在另一个实施方案中，受体以BI亚基和B2亚基的异聚体存在。在一个实施方案中，BI与B2组合以形成具有不同药物学特性、定位和与胞内信使相互作用的能力的受体亚型。在另一个实施方案中，BI亚基是GABAb受体多聚体的单体。在另一个实施方案中，多聚体为包含两或多个亚基的同聚体。在另一个实施方案中，多聚体为包含两个BI亚基的同二聚体。在另一个实施方案中，多聚体为包含BI亚基的异聚体。在另一个实施方案中，多聚体为包含BI亚基和B2亚基的异聚体。在另一个实施方案中，多聚体为包含Bl-a亚基和B2亚基的异聚体。在另一个实施方案中，多聚体为包含Bl-b亚基和B2亚基的异聚体。在另一个实施方案中，多聚体为包含Bl-c亚基和B2亚基的异聚体。在一个实施方案中，GABAb受体的BI亚基具有如下所示的序列MLLLLLLAPL FLRPPGAGGA QTPNATSEGC QIIHPPWEGG IRYRGLTRDQ VKAINFLPVD60YEIEYVCRGE REVVGPKVRK CLANGSffTDM DTPSRCVRIC SKSYLTLENG KVFLTGGDLP120ALDGARVDFR CDPDFHLVGS SRSICSQGQff STPKPHCQVN RTPHSERRAV YIGALFPMSG180 GWPGGQACQP AVEMALEDVN SRRDILPDYE LKLIHHDSKC DPGQATKYLY ELLYNDPIKI240ILMPGCSSVS TLVAEMRMW NLIVLSYGSS SPALSNRQRF PTFFRTHPSA TLHNPTRVKL300FEKffGWKKIA TIQQTTEVFT STLDDLEERV KEAGIEITFR QSFFSDPAVP VKNLKRQDAR360IIVGLFYETE ARKVFCEVYK ERLFGKKYVff FLIGffYADNff FKIYDPSINC TVDEMTEAVE420GHITTEIVML NPANTRSISN MTSQEFVEKL TKRLKRHPEE TGGFQEAPLA YDAIffALALA480LNKTSGGGGR SGVRLEDFNY NNQTITDQIY RAMNSSSFEG VSGHVVFDAS GSRMAffTLIE540QLQGGSYKKI GYYDSTKDDL SffSKTDKffIG GSPPADQTLV IKTFRFLSQK LFISVSVLSS600LGIVLAVVCL SFNIYNSHVR YIQNSQPNLN NLTAVGCSLA LMVFPLGLD GYHIGRNQFP660FVCQARLffLL GLGFSLGYGS MFTKIWffVHT VFTKKEEKKE WRKTLEPWKL YATVGLLVGM720DVLTLAIffQI VDPLHRTIET FAKEEPKEDI DVSILPQLEH CSSRKMNTffL GIFYGYKGLL780LLLGIFLAYE TKSVSTEKIN DHRAVGMAIY NVAVLCLITA PVTMILSSQQ DMFAFASLA840IVFSSYITLV VLFVPKMRRL ITRGEffQSEA QDTMKTGSST NNNEEEKSRL LEKENRELEK900IIAEKEERVS ELRHQLQSRQ QLRSRRHPPT PPEPSGGLPR GPPEPPDRLS CDGSRVHLLY960K961(SEQIDN0:1)在另一个实施方案中，GABAb受体的BI亚基具有如下所示的序列MGPGAPFARV GWPLPLLVVM MGVAPVffAS HSPHLPRPHS RVPPHPSSER RAVYIGALFP60MSGGWPGGQA CQPAVEMALE DVNSRRDILP DYELKLIHHD SKCDPGQATK YLYELLYNDP120IKIILMPGCS SVSTLVAEM RMWNLIVLSY GSSSPALSNR QRFPTFFRTH PSATLHNPTR180VKLFEKffGWK KIATIQQTTE VFTSTLDDLE ERVKEAGIEI TFRQSFFSDP AVPVKNLKRQ240DARIIVGLFY ETEARKVFCE VYKERLFGKK YVWFLIGffYA DNWFKIYDPS INCTVDEMTE300AVEGHITTEI VMLNPANTRS ISNMTSQEFV EKLTKRLKRH PEETGGFQEA PLAYDAIffAL360ALALNKTSGG GGRSGVRLED FNYNNQTITD QIYRAMNSSS FEGVSGHVVF DASGSRMAffT420LIEQLQGGSY KKIGYYDSTK DDLSffSKTDK WIGGSPPADQ TLVIKTFRFL SQKLFISVSV480LSSLGIVLAV VCLSFNIYNS HVRYIQNSQP NLNNLTAVGC SLALMVFPL GLDGYHIGRN540QFPFVCQARL WLLGLGFSLG YGSMFTKIWff VHTVFTKKEE KKEffRKTLEP WKLYATVGLL600VGMDVLTLAI WQIVDPLHRT IETFAKEEPK EDIDVSILPQ LEHCSSRKMN TffLGIFYGYK660GLLLLLGIFL AYETKSVSTE KINDHRAVGM AIYNVAVLCL ITAPVTMILS SQQDMFAFA720
SLAIVFSSYI TLVVLFVPKM RRLITRGEffQ SEAQDTMKTG SSTNNNEEEK SRLLEKENRE780LEKIIAEKEE RVSELRHQLQ SRQQLRSRRH PPTPPEPSGG LPRGPPEPPD RLSCDGSRVH840LLYK844(SEQ ID NO 2)在另一个实施方案中，GABAb受:体的BI亚基具有如下所不的序列MLLLLLLAPL FLRPPGAGGA QTPNATSEGC QIIHPPWEGG IRYRGLTRDQ VKAINFLPVD60YEIEYVCRGE REVVGPKVRK CLANGSffTDM DTPSRCVNRT PHSERRAVYI GALFPMSGGff120PGGQACQPAV EMALEDVNSR RDILPDYELK LIHHDSKCDP GQATKYLYEL LYNDPIKIIL180 MPGCSSVSTL VAEMRMWNL IVLSYGSSSP ALSNRQRFPT FFRTHPSATL HNPTRVKLFE240KffGWKKIATI QQTTEVFTST LDDLEERVKE AGIEITFRQS FFSDPAVPVK NLKRQDARII300VGLFYETEAR KVFCEVYKER LFGKKYVWFL IGffYADNWFK IYDPSINCTV DEMTEAVEGH360ITTEIVMLNP ANTRSISNMT SQEFVEKLTK RLKRHPEETG GFQEAPLAYD AIffALALALN420KTSGGGGRSG VRLEDFNYNN QTITDQIYRA MNSSSFEGVS GHVVFDASGS RMAffTLIEQL480QGGSYKKIGY YDSTKDDLSff SKTDKffIGGS PPADQTLVIK TFRFLSQKLF ISVSVLSSLG540IVLAVVCLSF NIYNSHVRYI QNSQPNLNNL TAVGCSLALA AVFPLGLDGY HIGRNQFPFV600CQARLffLLGL GFSLGYGSMF TKIWffVHTVF TKKEEKKEffR KTLEPWKLYA TVGLLVGMDV660LTLAIffQIVD PLHRTIETFA KEEPKEDIDV SILPQLEHCS SRKMNTffLGI FYGYKGLLLL720LGIFLAYETK SVSTEKINDH RAVGMAIYNV AVLCLITAPV TMILSSQQDA AFAFASLAIV780FSSYITLVVL FVPKMRRLIT RGEffQSEAQD TMKTGSSTNN NEEEKSRLLE KENRELEKII840AEKEERVSEL RHQLQSRQQL RSRRHPPTPP EPSGGLPRGP PEPPDRLSCD GSRVHLLYK899(SEQ ID NO :3)在另一个实施方案中，BI亚基是SEQ ID NO :1、2或3的同源物。在另一个实施方案中，BI亚基是SEQ ID N0:l、2或3的变体。在另一个实施方案中，BI亚基是SEQ ID NO:
1、2或3的异构体。在另一个实施方案中，BI亚基是SEQ ID N0:l、2或3的片段。在另一个实施方案中，BI亚基包含SEQ ID N0:l、2或3。每一可能性代表了本发明独立的实施方案。在另一个实施方案中，GABAb受体的BI亚基由具有如下序列的核苷酸序列编码ccctctcttc cccccgccct gccttccctt gcaccctcct tcttccctcc gcccgggagc60tctccctggt ccccggcgcc gcctccttcc ctcccggctc cccgctcccc gctcccgtgg120ctgccgccgc cccggggaag aagagacagg ggtggggttt gggggaagcg agagaggagg180ggagagaccc tggccaggct ggagcctgga ttcgagggga ggagggacgg gaggaggaga240aaggtggagg agaagggagg ggggagcggg gaggagcggc cgggcctggg gccttgaggc300ccggggagag ccggggagcc gggcccgcgc gccgagatgt tgctgctgct gctactggcg360ccactcttcc tccgcccccc gggcgcgggc ggggcgcaga cccccaacgc cacctcagaa420ggttgccaga tcatacaccc gccctgggaa gggggcatca ggtaccgggg cctgactcgg480gaccaggtga aggctatcaa cttcctgcca gtggactatg agattgagta tgtgtgccgg540ggggagcgcg aggtggtggg gcccaaggtc cgcaagtgcc tggccaacgg ctcctggaca600gatatggaca cacccagccg ctgtgtccga atctgctcca agtcttattt gaccctggaa660aatgggaagg ttttcctgac gggtggggac ctcccagctc tggacggagc ccgggtggat720
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agctcatcca ccacgacagc aagtgtgatc caggccaagc caccaagtac ctatatgagc780tgctctacaa cgaccctatc aagatcatcc ttatgcctgg ctgcagctct gtctccacgc840tggtggctga ggctgctagg atgtggaacc tcattgtgct ttcctatggc tccagctcac900cagccctgtc aaaccggcag cgtttcccca ctttcttccg aacgcaccca tcagccacac960tccacaaccc tacccgcgtg aaactctttg aaaagtgggg ctggaagaag attgctacca1020tccagcagac cactgaggtc ttcacttcga ctctggacga cctggaggaa cgagtgaagg1080aggctggaat tgagattact ttccgccaga gtttcttctc agatccagct gtgcccgtca1140aaaacctgaa gcgccaggat gcccgaatca tcgtgggact tttctatgag actgaagccc1 200ggaaagtttt ttgtgaggtg tacaaggagc gtctctttgg gaagaagtac gtctggttcc1260tcattgggtg gtatgctgac aattggttca agatctacga cccttctatc aactgcacag1320tggatgagat gactgaggcg gtggagggcc acatcacaac tgagattgtc atgctgaatc1380ctgccaatac ccgcagcatt tccaacatga catcccagga atttgtggag aaactaacca1440agcgactgaa aagacaccct gaggagacag gaggcttcca ggaggcaccg ctggcctatg1500atgccatctg ggccttggca ctggccctga acaagacatc tggaggaggc ggccgttctg1560gtgtgcgcct ggaggacttc aactacaaca accagaccat taccgaccaa atctaccggg1620caatgaactc ttcgtccttt gagggtgtct ctggccatgt ggtgtttgat gccagcggct1680ctcggatggc atggacgctt atcgagcagc ttcagggtgg cagctacaag aagattggct1740actatgacag caccaaggat gatctttcct ggtccaaaac agataaatgg attggagggt1800cccccccagc tgaccagacc ctggtcatca agacattccg cttcctgtca cagaaactct1860ttatctccgt ctcagttctc tccagcctgg gcattgtcct agctgttgtc tgtctgtcct1920ttaacatcta caactcacat gtccgttata tccagaactc acagcccaac ctgaacaacc1980tgactgctgt gggctgctca ctggctttag ctgctgtctt ccccctgggg ctcgatggtt2040accacattgg gaggaaccag tttcctttcg tctgccaggc ccgcctctgg ctcctgggcc2100tgggctttag tctgggctac ggttccatgt tcaccaagat ttggtgggtc cacacggtct2160tcacaaagaa ggaagaaaag aaggagtgga ggaagactct ggaaccctgg aagctgtatg2220ccacagtggg cctgctggtg ggcatggatg tcctcactct cgccatctgg cagatcgtgg2280accctctgca ccggaccatt gagacatttg ccaaggagga acctaaggaa gatattgacg2340tctctattct gccccagctg gagcattgca gctccaggaa gatgaataca tggcttggca2400ttttctatgg ttacaagggg ctgctgctgc tgctgggaat cttccttgct tatgagacca2460agagtgtgtc cactgagaag atcaatgatc accgggctgt gggcatggct atctacaatg2520tggcagtcct gtgcctcatc actgctcctg tcaccatgat tctgtccagc cagcaggatg2580cagcctttgc ctttgcctct cttgccatag ttttctcctc ctatatcact cttgttgtgc2640tctttgtgcc caagatgcgc aggctgatca cccgagggga atggcagtcg gaggcgcagg2700acaccatgaa gacagggtca tcgaccaaca acaacgagga ggagaagtcc cggctgttgg2760agaaggagaa ccgtgaactg gaaaagatca ttgctgagaa agaggagcgt gtctctgaac2820tgcgccatca actccagtct cggcagcagc tccgctcccg gcgccaccca ccgacacccc2880cagaaccctc tgggggcctg cccaggggac cccctgagcc ccccgaccgg cttagctgtg2940atgggagtcg agtgcatttg ctttataagt gagggtaggg tgagggagga caggccagta3000gggggaggga aagggagagg ggaagggcag gggactcagg aagcaggggg tccccatccc3060
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Brain 2005;128:1764-1777)和 Vitaliani 等人(Paraneoplastic encephalitis, psychiatric symptoms, and hypoventilation inovarian teratoma. Ann Neurol 2005;58:594-604·)。每一可能性代表了本发明独立的实施方案。用于诊断边缘叶脑炎(LE)的方法是本领域众所周知的。在另一个实施方案中，患有LE的患者发展出亚急性的精神错乱、易怒、抑郁、睡眠障碍、癫痫发作、短期记忆丧失和/或痴呆。在另一个实施方案中，LE的病理学基础为主要涉及边缘性系统(海马、杏仁核和扣带回)的炎症性疾病。在另一个实施方案中，活检和尸检研究证实了 T细胞和较低频率B细胞的间质和外周血管浸润，以及小胶质细胞活化、神经元退化和/或神经胶质增生。在另一个实施方案中，在远离边缘性系统的区域发现了炎症性浸润。在另一个实施方案中，浸润保持为轻度的和临床沉默的。在另一个实施方案中，浸润变得显著并发展成为称作脑脊髓炎的疾病。另外的诊断LE的方法在,例如，Gultekin SH等人(Paraneoplasticlimbic encephalitis !neurological symptoms, immunological findings and tumourassociation in 50 patients. Brain 2000 ；123 :1481-1494)中描述。每一可能性代表了本发明独立的实施方案。在另一个实施方案中，本发明的抗原与本文公开的肽是同源的。当涉及任何蛋白 质或肽时，在一个实施方案中，术语“同源性”、“同源的”等是指，在将序列比对并引入缺口(如果需要的话)以实现同源性最大百分比，并不将任何保守取代考虑为序列相同性的部分之后，候选序列与对应的天然多肽的残基为相同的氨基酸残基的百分比。用于比对的方法和计算机程序是本领域众所周知的。在另一个实施方案中，通过用于序列比对的计算机算法确定同源性，该算法通过本领域已很好描述的方法建立。例如，核酸序列同源性的计算机算法分析可包括对任何数量的可用的软件包，如，例如，BLAST、DOMAIN、BEAUTY (BLAST增强的比对应用程序)、GENPEPT和TREMBL包的利用。在另一个实施方案中，“同源性”是指与选自SEQ ID NO :1_6的序列具有超过70%的相同性。在另一个实施方案中，“同源性”是指与选自SEQ ID NO :1-6的序列具有超过72%的相同性。在另一个实施方案中，“同源性”是指与SEQ ID NO :1-6之一具有超过75%的相同性。在另一个实施方案中，“同源性”是指与选自SEQ ID NO :1-6的序列具有超过78%的相同性。在另一个实施方案中，“同源性”是指与SEQ ID NO :1-6之一具有超过80%的相同性。在另一个实施方案中，“同源性”是指与SEQ ID NO :1-6之一具有超过82%的相同性。在另一个实施方案中，“同源性”是指与选自SEQ ID NO :1-6的序列具有超过83%的相同性。在另一个实施方案中，“同源性”是指与SEQ ID NO :1-6之一具有超过85%的相同性。在另一个实施方案中，“同源性”是指与SEQ ID NO :1-6之一具有超过87%的相同性。在另一个实施方案中，“同源性”是指与选自SEQ ID NO :1-6的序列具有超过88%的相同性。在另一个实施方案中，“同源性”是指与SEQ ID NO :1-6之一具有超过90%的相同性。在另一个实施方案中，“同源性”是指与SEQ ID NO :1-6之一具有超过92%的相同性。在另一个实施方案中，“同源性”是指与选自SEQ ID NO :1-6的序列具有超过93%的相同性。在另一个实施方案中，“同源性”是指与SEQ ID NO :1-6之一具有超过95%的相同性。在另一个实施方案中，“同源性”是指与选自SEQ ID NO :1-6的序列具有超过96%的相同性。在另一个实施方案中，“同源性”是指与SEQ ID NO :1-6之一具有超过97%的相同性。在另一个实施方案中，“同源性”是指与SEQ ID NO :1-6之一具有超过98%的相同性。在另一个实施方案中，“同源性”是指与SEQ ID NO :1-6之一具有超过99%的相同性。在另一个实施方案中，“同源性”是指与SEQ ID NO :1-6之一具有100%的相同性。每一可能性代表了本发明独立的实施方案。
在另一个实施方案中，通过确定候选序列杂交来确定同源性，其方法在本领域已很好描述(见，例如，“Nucleic Acid Hybridization” Hames, B. D.和 Higgins S. J. , Eds.(1985) ;Sambrook 等人，2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Press, N. Y.;和 Ausubel 等人，1989, Current Protocols in Molecular Biology,Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N. Y)。在其它实施方案中，在对于编码天然半胱氨酸天冬氨酸酶(caspase)肽的DNA的互补而言中度至严格的条件下实施杂交方法。杂交条件为，例如，在包含10-20%甲酰胺、5XSSC (150mM氯化钠，15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH 7. 6)、5XDenhardt' s溶液、10%硫酸葡聚糖和20 μ g/ml已变性剪切的鲑鱼精DNA的溶液中于42°C孵育过夜。在另一个实施方案中，通过本领域已很好描述的方法确定本文中列出的任何氨基酸(AA)序列的蛋白质和/或肽同源性，该方法包括免疫印迹分析，或通过计算机算法分析AA序列，其通过已建立的方法，利用许多可用的软件包中的任何一个。例如,一些这种包包括FASTA、BLAST、MPsrch或Scanps包，以及在另一个实施方案中，利用Smith和Waterman算法和/或全局/局部或BLOCKS算法用于分析的用途。每一确定同源性的方法代表了本发明独立的实施方案。 在本发明的另一个实施方案中，“核酸”或“核苷酸”是指一串至少2个碱基-糖-磷酸的组合。在一个实施方案中，该术语包括DNA和RNA。在一个实施方案中，“核苷酸”是指核酸多聚物的单体单位。在一个实施方案中，RNA处于tRNA (转运RNA)、snRNA (小核RNA)、rRNA(核糖体 RNA)、mRNA(信使 RNA)、反义 RNA、小抑制 RNA(siRNA)、微 RNA(miRNA)和核酶(ribozymes)的形式。已经描述了 siRNA和miRNA 的用途(CaudyAA等人,Genes & Devell6 2491-96和其中引用的参考文献)。在其它实施方案中，DNA可以处于质粒DNA、病毒DNA、线性DNA或染色体DNA，或这些组的衍生物的形式。此外,这些形式的DNA和RNA可为单、双、三或四链的。在另一个实施方案中，所述术语还包括含有其它形式的骨架但相同碱基的人工核酸。在一个实施方案中，所述人工核酸为PNA (肽核酸)。在一个实施方案中，PNA含有肽骨架和核苷酸碱基，并且能与DNA和RNA分子相结合。在另一个实施方案中，核苷酸为环氧丙烷修饰的。在另一个实施方案中，通过将一或多个磷酸二酯键替换为硫代磷酸酯键来修改核苷酸。在另一个实施方案中，人工核酸含有本领域已知的天然核酸磷酸骨架的任何其它变体。硫代磷酸酯核酸和PNA的用途为本领域技术人员已知的，并且已在，例如，Neilsen PE, Curr Opin Struct Biol 9 :353-57 ;和 Raz NK 等人，Biochem Biophys ResCommun. 297 :1075-84中描述。核酸的产生和用途为本领域技术人员已知的，并且已在,例如，Molecular Cloning, (2001),Sambrook和 Russell, eds. and Methods in Enzymology Methods for molecular cloning in eukaryotic cells (2003)Purchio and G. C. Fareed中描述。每一核酸衍生物代表了本发明独立的实施方案。
实施例实施例I :GABAB受体是具有显著癫痫发作的严重边缘叶脑炎的新自身抗原材料与方法患者和对照。本申请的发明人研究了 410个怀疑为副肿瘤脑炎或针对神经元细胞表面抗原的免疫介导的脑炎的患者。在357个中鉴定到抗体257个具有针对NMDAR的NRl亚基的抗体，27个具针对电压门控钾离子通道(VGKC)的抗体，19个具针对谷氨酸脱羧酶(GAD)的抗体，15个具针对AMPAR的GluRl/2亚基的抗体，11个具针对Ma2的抗体，8个具针对HuD的抗体和2个具针对CRMP5的抗体。在剩下的53个患者中，15个具有针对主要在大鼠脑神经毡可见的神经元细胞表面抗原的血清或CSF抗体，全部显示了相似的免疫染色。指示病例(#1患者)的这些特征和其对治疗的剧烈响应将目前的研究集中于这15个患者。信息由作者获得或由咨询医师提供。来自104个患者的CSF或血清,包括从上述随机选取的91个和作为对照的患有GAD-抗体相关的综合征的13个。
动物组织、抗体和大鼠脑免疫组织化学。对雌性Wistar大鼠实施安乐死并移除脑，进行矢状切片，浸入4%的多聚甲醛中于4°C 2小时，在40%蔗糖中冷冻保护(cryoprotected) 24小时，并且在冷冻的异戍烧中速冻。大鼠脑和人体组织的免疫组织化学。将石蜡包埋的组织脱蜡并恢复抗原。将7微米厚的冷冻(或4 μ m的石蜡)组织切片连续地与O. 3% H2O2孵育20分钟，与10%山羊血清孵育I小时，并与患者或对照的血清(I 250)、CSF(1 10)或针对GABAb受体的胞内表位的豚鼠多克隆抗体(I : 200 ;Invitrogen,Carlsbad,CA)4°C孵育过夜。在使用适当的二抗(全部I : 2000)后，用抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶方法显影反应。在荧光显微镜下使用Zeiss Axiovision软件(Zeiss, Thornwood, NY)拍摄结果。利用从患者的血清纯化并使用生物素标记的IgG对人体组织(SCLC肿瘤)进行免疫组织化学。这些研究中不需要二抗，避免了由存在于所述组织中的无关的人IgG引起的
进旦
同ο用患者或对照的血清(I 250),CSF (I 10)或GABAbi抗体对大鼠脑冷冻切片进行免疫组织化学，其使用标准的抗生物素蛋白-生物素过氧化物酶方法，或随后使用适当的Alexa Fluor 二抗将患者的血清(或CSF)和GABAbi抗体双重免疫标记。神经元培养物和KEK293细胞的免疫组织化学。制备大鼠海马神经元培养物。生长于细胞培养玻片上的活的神经元与患者或对照的血清(最终稀释度I : 200)或CSF(1 10)于37°C孵育I小时。去除培养基并用大量磷酸缓冲盐水(PBS)清洗后，用 4%多聚甲醛固定神经元，用O. 1% Triton X-100透明化，并且用豚鼠多克隆GABAbi受体抗体(I : 200),随后用 I : 2000 稀释的对应的 Alexa Fluor 二抗(Molecular Probes,Eugene, OR)单独或双重免疫标记。在突光显微镜下使用Zeiss Axiovision软件(Zeiss,Thornwood, NY)拍摄结果。用含有啮齿动物GABAb受体的GABAbi或GABAb2亚基的质粒或不含插入的质粒(对照)转染HEK293细胞，其使用先前报道的方法。在其它实验中，以等摩尔比的GABAm和GABAb2共转染细胞。转染后，细胞在评估前生长24小时。在4%多聚甲醛中固定转染的细胞，用0.1% Triton X-100透明化，然后与患者的血清(I 250)或CSF(1 10)孵育，并与所指出的豚鼠多克隆GABAbi受体抗体(I 20000)或多克隆GABAb2受体抗体(I 10000，由Dr. Moss生产)于4°C孵育过夜，在PBS中洗涤，并且与适当的Alexa Fluor二抗(I : 2000 !Molecular Probes)孵育。在突光显微镜下使用Zeiss Axiovision软件(Zeiss, Thornwood, NY)拍摄结果。使用表达GABAbvb2的HEK293细胞与梯度稀释的血清和CSF (从1/2稀释开始)孵育来确定抗体滴度。
如所报告的，使用所指出的转染的HEK293细胞，和针对IgGl、IgG2、IgG3和IgG4(全部I : 200稀释；Sigma, St. Louis, MO)的抗人二抗确定患者血清或CSF中的抗体IgG亚型。免疫沉淀和免疫印迹。如上述获得生长于IOOmm孔中(密度IO6神经元/孔)的活的神经元，并且与过滤后的患者血清(I 500)于37°C孵育I小时。然后用PBS洗涤神经元，用含蛋白酶抑制剂(P8340 ；Sigma Labs)的缓冲液(150mM氯化钠，ImM EDTA，IOOmM三(轻甲基)氨基甲烧盐酸([Tris]-HCL), O. 5%脱氧胆酸，I % Triton X-100 [Sigma Labs,St. Louis, MO], pH 7.5)裂解，并于4°C以16. I X 103g离心20分钟。保留上清并与蛋白质A/G琼脂糖珠(20423 ；Pierce, Rockford, IL)4°C孵育过夜，离心，然后用PBS洗涤包含珠与结合靶细胞表面抗原的患者的抗体的沉淀，分装，并保存在_80°C。此沉底的分装物重悬于Laemmli缓冲液，煮沸10分钟，在4_15 %的十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离，并且用EZBlue凝胶染色剂(G1041 ;Sigma Labs)可视化蛋白质。从凝胶上切下由患者血清沉淀的不同的蛋白质条带并在宾夕法尼亚大学的蛋白质组学部门使用质谱分析。鉴定抗原后，如前所述在十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离所指出的冷冻分装的沉淀，转移至硝酸纤维素膜(162-0115 ;Bio-Rad，Hercules，CA)，并用指出的针对GABAbi (I ，
000)或GABAB2(1 1000)受体亚基的多克隆抗体印迹。使用适当的生物素标记的二抗(I 2000)和抗生物素蛋白-生物素过氧化物酶，二氨基联苯胺法显影反应。使用共聚焦显微镜定量分析GABAb受体簇。14_21天的活的体外(div)大鼠海马神经元与患者CSF(1 30稀释于Neuro-Basal B27介质中；GIBC0，Carlsbad，CA)孵育24小时，洗涤，在多聚甲醛(含4%多聚甲醛，4%蔗糖的PBS中)中固定5分钟，用0. 25%Triton X-100透化处理10分钟，用5%正常山羊血清封闭I小时。然后将神经元与针对GABAb受体表位的豚鼠多克隆抗体(I 1000 ；Invitrogen)和针对突触前标记物巴松管蛋白的小鼠单克隆抗体(I : 200 ；Stressgen, Victoria, British Columbia, Canada)孵育，洗漆，并与适当的突光素缀合的二抗(I : 1000, Molecular Probes)孵育。使用激光扫描共聚焦显微镜获得图像(Leica TCS SP2 ;Leica，Deerfield，IL)。对每一图像，调整激光光水平和检测器增益和偏移使得没有像素值是饱和的。将标记后的神经元的图像数字化存储以供后续分析。将图像阈值化，选择包含树突的感兴趣的区域，并使用交互式软件(ImageJ ；Research Services Branch, National Institute of MentalHealth, Bethesda, MD)沿神经元树突确定独立的簇的数目。在ImageJ中实施软件宏来定量标记有患者的抗体、商业化GABAb抗体和突触标记物巴松管蛋白的共定位的簇结果指示患者(表中的#1病例):一名60岁的女性由于精神错乱、记忆问题和新发作的难以治愈的全身性强直阵挛和复杂部分发作而住院。在检查中，她对地点和时间均无判断力，并具有极差的注意力和短期记忆。除了侧向注视的扫视性眼球追踪，没有注意到颅神经异常。力量、感觉、反射和协调性正常。脑MRI显示了与边缘叶脑炎相一致的双侧内侧颞叶液体衰减反转恢复(FLAIR)信号增强(图la)。脑电图(EEG)显示弥漫性慢波和双侧周期性单侧癫痫样放电(PLEDS)。CSF表明9个白血细胞(WBC) / μ 1，总蛋白浓度35mg/dL，葡萄糖71mg/dL，以及寡克隆条带和细胞学阴性。单纯疱疹病毒、西尼罗河病毒和圣路易斯脑炎的PCR结果均为阴性。注意到了由抗利尿激素分泌不当综合征(SIADH)引起的低钠血症(119mEq/L)。血清和CSF的副肿瘤抗体分析为阴性。结合CT和氟代脱氧葡萄糖(FDG)-PET发现纵膈淋巴结肿大，经活检证实为小细胞肺癌(SCLC)。用抗癫痫药物(左乙拉西坦、丙戊酸、苯妥英)和免疫疗法(静脉注射免疫球蛋白[IVIg]，皮质类固醇)，立即跟着使用顺钼(cisplatin)和依托泊苷(etoposide)的化学疗法来治疗所述患者。短期记忆和认知出现了快速和剧烈的改善，并且完全解决了癫痫发作。完成这些治疗后，患者接受了标准的预防性全脑放射治疗。症状表现I个月后重复脑MRI显示了改善的异常FLAIR信号(图Ib);接下来的3和9个月后的MRI保持不变，除了很可能继发于放射治疗的逐步的全身萎缩(图lc, d)。症状表现一年后，该患者仅有轻度记忆和认知障碍并且独立生活。针对新神经元细胞表面自身抗原的抗体的检测。对指示病例和另外来自所指出选择病例的14个患者的血清和CSF的分析显示了与大鼠脑神经毡的反应性，其模式不同于报告的NMDAR的NRl亚基、AMPAR的GluRl/2亚基或VGKC抗体的反应性。为确定抗体是否与胞外表位反应，将未固定的和非透化处理的大鼠海马神经元培养物与患者的血清或CSF孵育，其显示了与细胞表面强烈的反应性(图3a)。神经元细胞表面抗原是促代谢型受体。为鉴定细胞表面抗原，将活的大鼠海马神 经元与患者的抗体孵育，免疫沉淀靶抗原。这些研究产生了 2条大约105和90kDa的蛋白质条带(图3b)，通过质谱分析证实其为源自促代谢型GABAb受体的BI亚基的序列。因为GABAb受体为包含具有相似分子量的两种亚基BI和B2的异二聚体，下一步发明人用免疫印迹和特异性针对每一亚基的多克隆抗体检验确定了患者的抗体是否已将两种亚基都沉淀。这些研究证实了患者抗体与GABAb受体的BI和B2亚基共沉淀(图3c)。如所报告的，通过3重免疫标记(患者抗体；非竞争性的GABAbi受体胞内表位的豚鼠多克隆抗体；和突触前标记物[巴松管蛋白])的培养的神经元确定患者抗体对GABAb受体的特异性，并且通过共聚焦显微镜定量共定位的程度(图4)。分析了 4个独立的细胞培养玻片上的24个神经元树突上的抗体与GABAb受体簇的结合。这显示了 103±0. 8%的患者抗体标记的GABAb受体簇与豚鼠多克隆针对GABAb受体的抗体标记的簇共定位,和107 ± O. 7 %的豚鼠抗体标记的簇与那些用患者抗体标记的共定位(由于少数被患者抗体标记的簇与2个被豚鼠抗体标记的簇重合或相反的情况，出现了略微高于100%的数字)。这些结果代表基本上所有的患者的抗神经元细胞表面抗体都靶向GABAb受体，以及差不多所有神经元GABAb受体都标记有患者的抗体。为确定2种GABAb受体亚基的哪一种包含靶表位，用GABAB1、GABAB2或两种受体亚基转染HEK293细胞并与患者的抗体进行免疫组织化学测试。所有15个患者都具有与GABAm受体亚基特异反应的血清或CSF抗体(图5)，而I个另外具有与GABAb2亚基的反应性。这些发现表明表达GABAB1/B2或GABAbi受体亚基的HEK293细胞为明确的诊断性测试提供了基础。对104个对照病例相似的研究显示了 2个患者(都患有归因于GAD自身免疫的综合征)具有低滴度(CSF中I : 2，血清阴性)的GABAbi受体抗体，在脑免疫组织化学中不可见。在6个随机选择的患者的血清或CSF中进行抗体IgG亚型分析。全部具有IgGlGABAbi抗体；两个具有另外的IgG3和一个具有IgG2抗体。神经系统症状。人口学信息、临床特征、治疗和预后示于表I和2。在具有高滴度GABAbi受体抗体并患有边缘叶脑炎(#1-15病例)的15个患者中，平均年龄为62岁(范围，24-75) ;8个为男性。13个患者表现出亚急性癫痫发作、精神错乱和严重的记忆损伤，在两个(#3和13)中记忆障碍和精神错乱先于癫痫发作数周。大多数癫痫发作具有继发性全身发作的颞叶发病，3个患者具有癫痫持续状态。10个患者具有与边缘叶脑炎相一致的单或双侧颞叶内侧FLAIR/T2信号增强，I个在胼胝体具有小区域的FLAIR信号增强，4个具有正常的脑MRI。10个数据可得的患者中的9个为CSF异常的。最常见的异常为在8个患者中的淋巴球增多。可得到来自12个患者的EEG研究；9个显示了颞叶癫痫发作、癫痫样放电或颞叶慢波；2个具有广泛性慢波和I个正常。在EGG上注意到了若干类型的癫痫发作，包括复杂部分性发作(通常是颞叶发病)、癫痫持续状态和亚临床癫痫发作。具有低滴度GABAbi抗体的2个对照病例(表I和2中的#16和17病例)发展出不同的与血清和CSF中高滴度GAD抗体相关的综合征。这2个患者都没有发展出癫痫发作或边缘性机能失调。一个具有进行性小脑共济失调，而另一个步态不稳、肌肉僵硬、强直、肌阵挛和口齿不清，归类为强直性脑脊髓炎。表I :人口学特征和症状
权利要求
1.用于诊断对象中的脑炎的方法，其包括以下步骤从所述对象获得生物学样品；和测试所述生物学样品以确定针对GABAb受体的抗体的存在，其中在所述生物学样品中存在所述抗体代表自身免疫性脑炎，从而确定所述对象中脑炎的病因。
2.权利要求I的方法，其中所述抗体结合所述GABAb受体的BI亚基。
3.权利要求I的方法，其中所述抗体结合所述GABAb受体的B2亚基。
4.权利要求I的方法，其中所述自身免疫性脑炎为副肿瘤性自身免疫性脑炎。
5.权利要求I的方法，其中所述自身免疫性脑炎为抗GABAb受体脑炎。
6.权利要求I的方法，其中所述自身免疫性脑炎为非副肿瘤性自身免疫性脑炎。
7.权利要求I的方法，其中所述自身免疫性脑炎包括边缘叶脑炎。
8.权利要求I的方法，其中所述自身免疫性脑炎与病理学症状相关。
9.权利要求8的方法，其中所述症状为癫痫发作；精神病学症状；认知和行为异常；运动障碍或运动异常；意识水平下降；肺换气不足；健忘症或记忆障碍；或其组合。
10.权利要求I的方法，其中所述自身免疫性脑炎与肿瘤相关。
11.权利要求10的方法，其中所述肿瘤为小细胞肺癌，或肺或其它器官的神经内分泌肿瘤。
12.权利要求I的方法，其中所述生物学样品为脑脊液(CSF)。
13.权利要求I的方法，其中所述生物学样品为血清或血浆。
14.用于诊断对象中的与自身免疫性脑炎相关的隐匿性肿瘤的方法，其包括以下步骤从所述对象获得生物学样品；和测试所述生物学样品以确定针对GABAb受体的抗体的存在，其中在所述生物学样品中存在所述抗体代表在所述对象中存在所述隐匿性肿瘤，并且所述肿瘤是所述自身免疫性脑炎的病因。
15.权利要求14的方法，其中所述自身免疫性脑炎为副肿瘤自身免疫性脑炎。
16.权利要求14的方法，其中所述自身免疫性脑炎包括边缘叶脑炎。
17.权利要求14的方法，其中所述自身免疫性脑炎与癫痫发作相关。
18.权利要求14的方法，其中所述自身免疫性脑炎与病理学症状相关。
19.权利要求18的方法，其中所述病理学症状为精神病学症状；认知和行为异常；运动障碍；意识水平下降；肺换气不足；健忘症或记忆障碍；或其组合。
20.权利要求14的方法，其中所述体液为脑脊液(CSF)。
21.权利要求14的方法，其中所述体液为血清或血浆。
22.用于诊断对象中的癫痫的方法，其包括以下步骤从所述对象获得生物学样品；和测试所述生物学样品以确定针对GABAb受体的抗体的存在，其中在所述生物学样品中存在所述抗体代表在所述对象中存在肿瘤，并且所述肿瘤是所述癫痫的病因，从而诊断所述对象中的所述癫痫。
23.权利要求22的方法，其中所述体液为脑脊液(CSF)。
24.权利要求22的方法，其中所述体液为血清或血浆。
25.用于诊断患有癫痫的对象中的肿瘤的方法，其包括以下步骤从所述对象获得生物学样品；和测试所述生物学样品以确定针对GABAb的受体抗体的存在，其中在所述生物学样品中存在所述抗体代表在所述对象中存在所述肿瘤，从而诊断所述患有癫痫的对象中的所述肿瘤。
26.用于治疗对象中的自身免疫性脑炎的方法，其包括以下步骤通过测试来自所述对象的体液中的针对GABAb受体的抗体来确定与所述自身免疫性脑炎相关的肿瘤，其中在所述体液中存在所述抗体代表在所述对象中存在所述肿瘤，并且所述肿瘤是所述自身免疫性脑炎的病因；和治疗所述肿瘤。
27.权利要求26的方法，其中所述脑炎与隐匿性肿瘤相关。
28.权利要求26的方法，其中所述肿瘤为小细胞肺癌，或肺或其它器官的神经内分泌肿瘤。
29.权利要求26的方法，其中在与自身免疫性脑炎相关的症状发病的4个月内治疗所述肿瘤。
30.权利要求26的方法，其中治疗所述肿瘤的步骤包括联合免疫治疗或化学治疗去除所述肿瘤。
31.权利要求26的方法，其中所述抗体结合所述GABAb受体的BI亚基。
32.权利要求26的方法，其中所述抗体结合所述GABAb受体的B2亚基。
33.权利要求26的方法，其中所述自身免疫性脑炎为GABAb受体相关的脑炎。
34.权利要求22的方法，其中所述GABAb受体相关的脑炎为抗GABAb受体脑炎。
35.权利要求26的方法，其中所述自身免疫性脑炎为副肿瘤自身免疫性脑炎。
36.权利要求22的方法，其中所述自身免疫性脑炎为非副肿瘤自身免疫性脑炎。
37.权利要求26的方法，其中所述自身免疫性脑炎包括边缘叶脑炎。
38.权利要求26的方法，其中所述自身免疫性脑炎与病理学症状相关。
39.权利要求38的方法，其中所述症状为癫痫发作；精神病学症状；认知和行为异常；运动障碍或运动异常；意识水平下降；肺换气不足；健忘症或记忆障碍；或其组合。
40.治疗对象中的自身免疫性脑炎的方法，其包括以下步骤通过测试来自所述对象的体液中的针对GABAb受体的抗体来检测与所述自身免疫性脑炎相关的肿瘤,其中在所述体液中存在所述抗体代表在所述对象中存在所述肿瘤，并且所述肿瘤是所述自身免疫性脑炎的病因；和在与自身免疫性脑炎相关的症状发病的4个月内治疗所述肿瘤。
41.权利要求40的方法，其中所述脑炎与隐匿性肿瘤相关。
42.权利要求40的方法，其中所述抗体结合所述GABAb受体的BI亚基。
43.权利要求40的方法，其中所述抗体结合所述GABAb受体的B2亚基。
44.权利要求42或43的方法，其中所述亚基为多聚体的单体。
45.权利要求44的方法，其中所述多聚体为受体同聚体。
46.权利要求45的方法，其中所述同聚体为包含2个BI亚基的同二聚体。
47.权利要求44的方法，其中所述多聚体为受体异聚体。
48.权利要求47的方法，其中所述异聚体包含BI亚基和B2亚基。
49.权利要求47的方法，其中所述异聚体包含Bl-a亚基和B2亚基。
50.权利要求47的方法，其中所述异聚体包含Bl-b亚基和B2亚基。
51.权利要求47的方法，其中所述异聚体包含Bl-c亚基和B2亚基。
全文摘要
本发明提供了诊断或确定对象中的自身免疫性脑炎或癫痫的病因和诊断对象中的肿瘤的方法，其包括测试对象的生物学样品中针对GABAB受体的抗体的步骤。本发明还提供了治疗自身免疫性脑炎或癫痫的方法，其包括检测针对GABAB受体的抗体和治疗与所述疾病相关的肿瘤的步骤。
文档编号C12Q1/00GK102803502SQ201080053945
公开日2012年11月28日 申请日期2010年9月29日 优先权日2009年9月29日
发明者J·达尔莫 申请人:宾夕法尼亚大学理事会