用于制备3-羟基丙酸和其它产物的方法

专利名称：用于制备3-羟基丙酸和其它产物的方法
技术领域：
本发明涉及经代谢工程改造的微生物，如细菌菌株，其中 对用于化学产品制备的丙二酰-CoA具有提高的利用率，所述化学产品可包括化学品3-羟基丙酸(3-HP)和由3-HP制备的产品。所述经代谢工程改造的微生物可适应于表现出对3-HP提高的耐受性。另外，进行遗传修饰以提供一种或多种3-HP生物合成途径，如包含被鉴定为3-HP耐受发生复合体(toleragenic complex)的复合体的一种或多种遗传修饰的微生物。序列表本申请包含已经通过EFS-Web以ASCII格式提交的序列表并且其全文特此以引用的方式并入本文。创建于2010年9月24日的所述ASCII文件被命名为34246744. txt并且大小为2，228, 808字节。
背景技术：
随着石油烃产品供给下降并且其成本最终上升的情势日益为人所接受，开发和改善工业微生物系统导致化学品和燃料生产的兴趣有所增加。这些工业微生物系统可完全地或部分地取代石油烃产品对于某些化学品生产的应用。许多化学品通过这样的方式进行制备，其范围从抗生素和抗疟疾药品到精细化学品到燃料如乙醇。微生物发酵的商业目标包括目标化学产物滴度、生产速度和产率的提高。当发酵事件中的整体单位生产率提高之时，除了生产速度和其它经济因素如资金成本以外，这还可以对产率有积极影响。用于这类制备的一个候选化学品是3-轻基丙酸(“3-HP”, CAS第503_66_2号),其可被转化为广泛用于工业品和消费品的聚合物的大量基本构造模块。遗憾的是，以前用微生物合成3-HP来实现商业上可行滴度的尝试显示所使用的微生物被远低于已测定的商业可行滴度的3-HP浓度所抑制。尽管存在对通过提高特定化学产品的产量和/或生产率来改善微生物发酵的经济性的强烈兴趣，对于使用商业上可行的发酵方法在发酵微生物细胞中提高向所需目标化学产品的净转化率仍然存在着需求。更特别地，有待解决的问题包括如何在经修饰的微生物中提高单位生产率和容积生产率，例如提高至有重要经济意义的水平，所述经修饰的微生物适应于在化学产品如3-羟基丙酸(3-HP)的微生物制备路径中以丙二酰-CoA作为底物制备该化学产品
发明内容
根据一个实施方案，本发明涉及制备基于丙烯酸的消费品的方法，所述方法包括
i)将碳源与微生物细胞培养物结合以制备3-羟基丙酸，其中a)所述细胞培养物包含脂肪酸合成酶的抑制剂或所述微生物经遗传修饰导致所述生物体脂肪酸合成酶途径中降低的酶活性；或《其中所述微生物通过引入编码具有单功能丙二酰-CoA还原酶活性的多肽的外源核酸序列进行遗传修饰导致所述生物体的丙二酰-CoA还原酶(mcr)途径中提高酶活性；或c)以高于O. 05克每克微生物细胞干重每小时的单位生产率或以高于O. 50克每升每小时的容积生产率制备所述3-羟基丙酸；ii)将所述3-羟基丙酸转化成为丙烯酸；以及iii)将所述丙烯酸加工成为消费产品。在各个方面，所述碳源具有约1.0X 10_14或更高的碳14与碳12比率。根据本发明的所述碳源可以主要为葡萄糖、蔗糖、果糖、右旋糖、乳糖或其组合。或者，所述碳源是甘油。 在特定的实施方案中，所述细胞培养物包含脂肪酸合成酶的抑制剂或所述微生物经遗传修饰导致所述生物体脂肪酸合成酶途径中降低的酶活性。例如，脂肪酸合成酶的抑制剂可选自硫乳霉素、三氯生、浅蓝菌素、噻吩并二氮杂硼杂因(thienodiazaborine)、异烟肼及其类似物。本发明的微生物可通过引入编码具有单功能丙二酰-CoA还原酶活性的多肽的异源核酸序列而进行遗传修饰以用于该生物体的丙二酰-CoA还原酶(mcr)途径中提高的酶活性。在各个实施方案中，所述单功能丙二酰-Cok还原酶是非NADPH依赖的。在各个实施方案中，根据本发明，所述3-羟基丙酸以高于0.05克每克微生物干重每小时的单位生产率或以高于O. 05克每升每小时的容积生产率进行制备。本发明包括其中所述细胞培养物包含经遗传修饰的微生物的实施方案。所述经遗传修饰的微生物可经修饰以具有选自以下的性状所述生物体的脂肪酸合成酶途径中降低的酶活性、所述生物体的丙二酰-CoA还原酶途径中具有提高的酶活性、对3-羟基丙酸升高的耐受性、所述生物体的NADPH依赖性转氢酶途径中升高的酶活性、提高的细胞内重碳酸盐水平、所述生物体的乙酰CoA羧化酶途径中提高的酶活性及其组合。例如，所述经遗传修饰的微生物可经修饰以在所述生物体的脂肪酸合成酶途径中具有降低的酶活性。或者，所述降低的酶活性是选自下列的酶的酶活性降低β -酮脂酰基-ACP还原酶、3-羟脂酰-CoA脱水酶、烯酰基-ACP还原酶和硫酯酶。在各个不同方面，所述生物体的脂肪酸合成酶途径中降低的酶活性通过引入编码诱导型启动子的异源核酸序列而产生，所述启动子可操作地连接于编码所述脂肪酸合成酶途径中的酶或其同源物的序列，或者通过引入编码所述脂肪酸合成酶途径中具有降低活性的酶或其同源物的异源核酸序列而产生。在各个不同方面，所述脂肪酸合成酶途径中的酶或其同源物是具有温度敏感性β -酮脂酰基-ACP还原酶活性或温度敏感性烯酰基-ACP还原酶活性的多肽。在多种情况下，所述经遗传修饰的微生物经修饰以用于所述生物体的丙二酰-Cok还原酶途径中提高的酶活性。在特定的实施方案中，丙二酰-CoA还原酶(mcr)途径中的酶活性的提高通过引入异源核酸序列而产生，所述异源核酸序列编码具有双功能丙二酰-CoA还原酶活性或单功能丙二酰-CoA还原酶活性的多肽。所述异源核酸序列可选自与选自SEQ ID NO. 780-789的序列具有至少70%同源性的序列。在各个实施方案中，所述遗传修饰的微生物经修饰以对3-羟基丙酸具有提高的耐受性。对3-羟基丙酸耐受性的提高可发生于所述3-HP耐受发生复合体(3HPTGC)复合物的一种或多种成分中，或者其中所述3-羟基丙酸耐受性的提高是由提供所述3HPTGC的A组和B组各自的至少一种遗传修饰而导致的。所述一种或多种成分可选自CynS、CynT>AroG、SpeD、SpeE、SpeF、ThrA、Asd、CysM、IroK、IlvA及其同源物。在各个实施方案中，所述修饰是一种或多种3HPTGC阻遏基因的破坏。所述阻遏基因可选自tyrR、trpR、metJ、purR、lysR、nrdR及其同源物。所述生物体的NADPH依赖性转氢酶途径中酶活性的提高可通过引入编码多肽的异源核酸序列而产生，所述多肽与选自SEQ ID NO. 776或778的序列具有至少70%的同源性。在各个实施方案中，所述提高的细胞内重碳酸盐水平通过引入编码具有氰酸酶和/或碳酸酐酶活性的多肽的异源核酸序列而产生。所述异源核酸序列可选自与选自SEQ IDNO. 337的序列具有至少70%同源性的序列。所述生物体的乙酰CoA羧化酶途径中酶活性的提高通过引入编码多肽的异源核 酸序列而产生，所述多肽与选自SEQ ID NO. 768-775的序列具有至少70%的同源性。所述经遗传修饰的细菌可被进一步修饰以降低乳酸脱氢酶、磷酸乙酰转移酶、丙酮酸氧化酶或丙酮酸-甲酸裂解酶及其组合的活性。本发明的方法可进一步包括通过在存在叔胺的情况下将3-羟基丙酸从所述培养物中提取而将3-羟基丙酸从所述细胞培养物中分离和/或纯化。在各种情况下，3-羟基丙酸以高于O. 05克每克微生物细胞干重每小时的单位生产率或以高于O. 50克每升每小时的容积生产率进行制备。本发明的方法可包括生产消费产品，诸如尿布、地毯、涂料、粘合剂和丙烯酸玻璃。本发明包括生物制备的3-羟基丙酸，其中所述3-羟基丙酸根据本发明的方法制备。这些3-羟基丙酸可基本上不含化学催化剂(包括基于钥和/或钒的催化剂)。所述3-羟基丙酸根据本发明的方法进行制备，其可具有约I. OX 10_14或更高的碳-14与碳-12比率。在各个方面，所述3-羟基丙酸包含低于约10 %的源自石油的碳。另外，本发明的3-羟基丙酸可包含与其制备方法相关的残留量的有机物质。在各个实施方案中，所述3-羟基丙酸包含残留量的有机物质，其量介于所述3-羟基丙酸的百万分之I与百万分之1，000之间。丙烯酸和由丙烯酸制备的聚合物(在根据本发明的方法进行生产的情况下)也包括在本发明之内。本发明还涵盖了由所述聚合物获得的产品，其包括商业产品和消费产品。例如，包括尿布、地毯、涂料、粘合剂和丙烯酸玻璃。另外，本发明涵盖了用于生物生产根据权利要求40所述的丙烯酸的系统，所述系统包括对生物质进行糖化的储罐；用于将糖化产物送至发酵罐的管线(任选地经过预发酵罐)；适用于微生物细胞培养的发酵罐；用于从所述发酵罐将内容物排放至提取和/或分离容器的管线；适用于将3-羟基丙酸从细胞培养物废料中移除的提取和/或分离容器；用于将3-羟基丙酸转移至脱水容器的管线；以及适用于将3-羟基丙酸转化成为丙烯酸的脱水容器。在各个实施方案中，所述系统进一步包括一个或多个预发酵罐、蒸馏塔、离心容器、反萃取柱、混合容器或其组合。在各个实施方案中，所述系统具有每年至少I吨丙烯酸的最低产能。经遗传修饰的微生物在本发明的范围之内，其中所述微生物能够以选自高于O. 05g/gDCff-hr,0. 08g/gDCff-hr,高于 O. lg/gDCff-hr,高于 O. 13g/gDCW_hr、高于 O. 15g/gDCW-hr、高于 0. 175g/gDCW-hr、高于 O. 2g/gDCW_hr、高于 O. 25g/gDCW_hr、高于 O. 3g/gDCff-hr> 高于 0. 35g/gDCff-hr> 高于 0. 4g/gDCff-hr> 高于 0. 45g/gDCff-hr 或高于 0. 5g/gDCff-hr的速度的比速度产生3-羟基丙酸。所述经遗传修饰的微生物可包含遗传修饰以提高丙二酰-CoA还原酶活性和乙酰CoA羧化酶活性，并且包含遗传修饰以降低烯酰基-ACP还原酶活性、乳酸脱氢酶活性和乙酸激酶活性。在各种情况下，所述微生物包含遗传修饰以提高丙二酰-CoA还原酶活性和乙酰CoA羧化酶活性，并且包含遗传修饰以降低烯酰基-ACP还原酶活性、乳酸脱氢酶活性和磷酸乙酰转移酶活性。另外，所述微生物可包含遗传修饰以提高丙二酰-CoA还原酶活性和乙酰CoA羧化酶活性，并且包含遗传修饰以降低烯酰基-ACP还原酶活性、乳酸脱氢酶活性、乙酸激酶活性和磷酸乙酰转移酶活性。在各个不同方面，所述微生物包含遗传修饰以提高丙二酰-Cok还原酶活性和乙酰CoA羧化酶活性，并且包含遗传修饰以降低烯酰基-ACP还原酶活性、乳酸脱氢酶活性和丙酮酸甲酸裂解酶活性。在各个实施方案中，所述微生物包含遗传修饰以提高丙二酰-CoA还原酶活性和乙酰CoA羧化酶活性，并且包含遗传修饰以降低烯酰基-ACP还原酶活性、乳酸脱氢酶活性和丙酮酸氧化酶活性。还包括包含遗传修饰以提 高丙二酰-CoA还原酶活性和乙酰CoA羧化酶活性和包含遗传修饰以降低烯酰基-ACP还原酶活性、乳酸脱氢酶活性和甲基乙二醛合成酶活性的微生物。另外，本发明的微生物可包含遗传修饰以提高丙二酰-CoA还原酶活性和乙酰CoA羧化酶活性，并且包含遗传修饰以提高β -酮脂酰基-ACP合成酶活性以及降低乳酸脱氢酶活性和甲基乙二醛合成酶活性，和/或所述微生物可包含遗传修饰以提高丙二酰-Cok还原酶活性和乙酰CoA羧化酶活性，并且包含遗传修饰以降低烯酰基-ACP还原酶活性、鸟苷3' - 二磷酸5'-三磷酸合成酶活性以及鸟苷3' - 二磷酸5' - 二磷酸合成酶活性。此外，在某些微生物中烯酰基-CoA还原酶活性被降低以替代附加于烯酰基-ACP还原酶活性的降低。在各个实施方案中，进行进一步的遗传修饰，该修饰提高了 NADH/NADPH转氢酶活性。例如，所述转氢酶活性可以是可溶的、可以是膜结合的、可以具有用于提高氰酸酶活性的进一步的遗传修饰、可以包含提高碳酸酐酶活性的进一步的遗传修饰和/或可以包含提高丙酮酸脱氢酶活性的进一步的遗传修饰。在各个实施方案中，进行进一步的遗传修饰，该修饰降低鸟苷:T - 二磷酸5'-三磷酸合成酶活性和鸟苷3' - 二磷酸5' -二磷酸合成酶活性。进行通气环境中提高NADH/NAD+比率的遗传修饰的情况也包括在内。此外，可进行遗传修饰，所述遗传修饰降低β -酮脂酰基-ACP合成酶活性、降低3-羟基丙酸脱氢酶活性、降低NAD+依赖性3-羟基丙酸脱氢酶活性、降低NAD+依赖性3-羟基丙酸脱氢酶活性、提高对3-羟基丙酸的耐受性、提高3-ΗΡ耐受发生复合体中任何酶的活性、提高丙酮酸脱氢酶活性、提高氰酸酶活性、提高碳酸酐酶活性、提高天冬氨酸激酶活性、提高苏氨酸脱水酶活性、提高2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶活性、提高半胱氨酸合成酶活性、提高核糖磷酸二磷酸激酶活性、提高核糖核苷二磷酸还原酶活性、提高L-半胱氨酸脱巯基酶活性、提高赖氨酸脱羧酶活性、提高同型半胱氨酸甲基转移酶活性、提高二氢叶酸还原酶活性、提高N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶活性、提高乙酰谷氨酸激酶活性、提高精氨基琥珀酸裂解酶活性、提高乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶活性、提高分支酸变位酶活性、提高预苯酸脱水酶活性、提高预苯酸脱氢酶活性、提高2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶活性和/或提高D-3-磷酸甘油酸脱氢酶活性。
在各个实施方案中，本发明包括培养系统，所述培养系统包含处于水性介质中的碳源以及根据权利要求48-92中任意一项所述的遗传修饰的微生物，其中所述遗传修饰的生物体存在的量选自高于O. 05gDCW/L、0. lgDCW/L、高于lgDCW/L、高于5gDCW/L、高于10gDCW/L、高于15gDCW/L或高于20gDCW/L，如当所述水性介质的体积选自高于5mL、高于IOOmL,高于O. 5L、高于1L、高于2L、高于10L、高于250L、高于1000L、高于10，000L、高于50，000L、高于100，000L或高于200，000L时，以及如当所述水性介质的体积高于250L并且容纳于钢质容器中时。在各种情况下，用于这种培养系统的碳源选自右旋糖、蔗糖、戊糖、多元醇、己糖、己糖和戊糖两者以及以上的组合，所述水性介质的PH低于7. 5，所述培养系统是通气的，如以选自以下的氧转移速度进行通气i)高于5毫摩尔/L-hr氧和低于200毫摩尔/L-hr氧；
ii)高于5毫摩尔/L-hr氧和低于100毫摩尔/L_hr氧；iii)高于5毫摩尔/L_hr氧和低于80毫摩尔/L-hr氧气；以及iv)高于5毫摩尔/L-hr氧和低于50毫摩尔/L_hr氧。
在各个实施方案中，本发明是从根据权利要求93-99中任意一项所述的培养系统获得的水性培养液，其中所述水性培养液包含i)选自高于5g/L、高于10g/L、高于15g/L、闻于20g/L、闻于25g/L、闻于30g/L、闻于35g/L、闻于40g/L、闻于50g/L、闻于60g/L、闻于70g/L、高于80g/L、高于90g/L或高于100g/L的3-羟基丙酸的3-羟基丙酸某种浓度；以及 )选自低于30g/L、低于20g/L、低于10g/L、低于5g/L、低于lg/L或低于0. 5g/L的1，3-丙二醇浓度。在一些方面，所述水性培养液包含选自低于20gDCW/L生物质、低于15gDCW/L生物质、低于10gDCW/L生物质、低于5gDCW/L生物质或低于lgDCW/L生物质的生物质量。或者，本发明的水性培养液使得3-HP/琥珀酸比率(g 3-HP/g琥珀酸)高于3、高于10、高于30、高于60、高于100、高于150或高于200。在各个方面，3-HP/延胡索酸比率(g 3-HP/g延胡索酸)高于3、高于10、高于30、高于60、高于100、高于150或高于200，或3-HP/甘油比率(g 3-HP/g甘油)高于3、高于10、高于30、高于60、高于100、高于150或高于200，或3-HP/乙酸比率(g 3-HP/g乙酸)高于I. 5、高于3、高于10、高于30、高于60、高于100、高于150或高于200，或3-HP/丙氨酸比率(g 3-HP/g丙氨酸)高于3、高于10、高于30、高于60、高于100、高于150或高于200，或3-ΗΡ/β-丙氨酸比率(g 3-HP/g β -丙氨酸)高于I. 5、高于3、高于10、高于30、高于60、高于100、高于150或高于200，或3-ΗΡ/谷氨酸比率(g 3-HP/g谷氣酸)闻于3、闻于10、闻于30、闻于60、闻于100、闻于150或闻于200,或3-HP/谷氨酰胺比率(g 3-HP/g谷氨酰胺)高于3、高于10、高于30、高于60、高于100、高于150或高于200，或3-HP/3-羟基丙醛比率(g 3-HP/g 3-羟基丙醛)高于I. 5、高于3、高于10、高于30、高于60、高于100、高于150或高于200，或3-HP/1，3-丙二醇比率(g3_HP/g1，3_丙_■醇)闻于1.5、闻于3、闻于10、闻于30、闻于60、闻于100、闻于150或闻于200，和/或3-HP/乳酸比率(g 3-HP/g乳酸)高于3、高于10、高于30、高于60、高于100、高于150或高于200。附图简要说明本发明的新特征在权利要求中进行详细陈述。对本发明的特征和优点的更好了解可通过参考下文示例性实施方案的详细描述和附图而获得，这些实施方案应用了本发明的原理。附图如下图I描述了涉及本发明方面的微生物代谢途径，更具体来说涉及3-HP生产的微生物代谢途径，特定酶学步骤中标出了大肠杆菌的基因名称，后者是用于示例而非意在进行限定。图2A描述了涉及本发明方面的微生物代谢途径，特定酶学步骤中标出了大肠杆菌的基因名，后者是用于示例而非意在进行限定。图2B提供了所述脂肪酸合成酶系统的典型酶学转化以及示例性大肠杆菌基因的更为详尽的描述，其在图2A中进行了更概括的描述。图3提供了示例性的多序列比对，其比较了碳酸酐酶多肽(碳酸酐酶多肽的CLUSTAL 2. O. 12多序列比对)。图4A提供了示例性的序列比对fabIts(JPllll(SEQ ID No. :769))与野生型(BW25113(SEQ ID No. :827))大肠杆菌fabl基因DNA突变体C722T的DNA序列的比较。图4B提供了示例性的序列比对fabIts(JPllll(SEQ ID No. :770))与野生型(BW25113(SEQ ID No. :828))大肠杆菌fabl基因氨基酸-S241F的蛋白质序列的比较。图5、6和7提供了来自实施例11的数据和结果。图8描述了涉及本发明方面的具有多个遗传修饰的微生物的代谢途径，更具体来说涉及3-HP生产，特定酶学步骤中标出了大肠杆菌的基因名，后者是用于示例而非意在进行限定。图9A，表单1-7是对代谢途径中的部分的多表单描述，其显示了途径产物和酶，所述诸部分合在一起组成了大肠杆菌中的3-HP耐受发生复合体(3HPTGC)。表单I提供了对其余表单排列设置的总体图示性描述。图9B，表单1-7提供了枯草杆菌(Bacillus subtilis)的3HPTGC的多表单描述。表单I提供了对其余表单排列设置的总体图示性描述。图9C,表单 1-7 提供了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的 3HPTGC 的多表单描述。表单I提供了对其余表单排列设置的总体图示性描述。图9D,表单1-7提供了钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)(先前称真氧产碱杆菌(Ralstonia eutropha))的3HPTGC的多表单描述。表单I提供了对其余表单排列设置的总体图示性描述。

图10提供了甘氨酸裂解途径的图示。图11提供了来自现有技术参考文献的从葡萄糖到丙酮酸到乙酰CoA到丙二酰-CoA到3-HP的已知3-HP产生途径的概述。图12提供了来自现有技术参考文献的从葡萄糖到磷酸烯醇丙酮酸(PEP)(直接或通过丙酮酸)到草酰乙酸到天冬氨酸到β -丙氨酸到丙二酸半醛到3-ΗΡ的已知3-ΗΡ产生途径的概述。图13提供了来自现有技术参考文献的已知3-ΗΡ产生途径的概述。图14Α和B提供了大肠杆菌中的天然混合发酵途径的示意图。图15Α-0提供了对于3-ΗΡ的对照微生物反应的图示数据，并且图15Ρ提供了与3HPTGC的一种遗传修饰的比较。图16描述了由来自结核分枝杆菌(Μ. tuberculosis)的kgd基因所编码的α-酮戊二酸盐催化的已知化学反应。图17描述了新的酶学功能，草酰乙酸到丙二酸半醛的脱羧化，其通过kgd基因的、修饰实现。图18显示对kgd突变体的建议选择方法。图19显示涉及到图18所述的建议选择方法的筛选方案。图20提供了涉及IroK肽序列的比较。图21提供了使用HPLC获得的3-HP的校准曲线。图22提供了使用GC/MS获得的3_HP的校准曲线。图23提供了用于3-HP的酶学分析的典型标准曲线。图24A、B和C以及图25A和B显示将生物质转化成为最终产物如尿布的全过程示意图。 本文还提供了表格并且其为本说明书的一部分。
具体实施例方式本发明涉及具有进行各种化学产品的发酵生产的效用的各种生产方法和/或遗传修饰的微生物，涉及利用这些微生物群体在容器中制备这些化学产品的方法，并且涉及利用这些微生物和方法进行化学生产的系统。本发明的益处包括当这些微生物在发酵事件或循环中产生化学产品时提高的单位生产率。本发明提供了生产技术和/或遗传修饰的微生物以利用一种或多种调控丙二酰-CoA向脂酰分子(其随后可被转化成为脂肪酸，例如脂酰基-ACP分子)的转化的手段产生如3-羟基丙酸(3-HP)的目标化学产物，其中所述的生产途径包括使用丙二酰-CoA作为底物的酶促转化步骤。用于调控丙二酰-CoA向脂酰分子如脂酰基-ACP分子的转化的手段有效地平衡向微生物生物质的碳流和向化学产物的碳流，并且出人意料地获得了升高的单位生产率。正如本文所指出的，本发明的各个方面涉及微生物细胞(其包含从丙二酰-CoA到3-HP的代谢途径)，和用于调控丙二酰-CoA向脂酰分子(其随后可被转化成为脂肪酸)的转化的手段。随后，当所述调控手段进行调控以降低这种转化的时候，按比例地较大量的丙二酰-CoA分子被I)产生和/或2)通过所述代谢途径从丙二酰-CoA转化成为3-HP。在各个实施方案中，可进行另外的遗传修饰，以例如，I)提高细胞内重碳酸盐水平，例如通过提高碳酸酐酶，2)提高乙酰CoA羧化酶和NADPH依赖性转氢酶的酶活性。通过遗传修饰的微生物群体获得的预料不到的单位生产率的提高可以在其中该微生物具有从丙二酰-CoA到被选择的化学产物的微生物产生途径以及所述微生物的脂肪酸合成酶系统的选定酶(更特别是其脂肪酸延伸酶)的酶活性降低的方法和系统实现。在各个实施方案中，还可向包含这些微生物群体的生物反应器容器提供特定补充物以进一步改善所述方法和系统。此外，对于一种化学产品-3-羟基丙酸(3-HP)，提供了对产生途径的遗传修饰，并且描述了可对其进行遗传修饰和/或培养系统改进以提高微生物对3-HP的耐受性的耐受发生复合体。此外，用于提高碳酸酐酶和/或氰酸酶的表达和/或酶活性的遗传修饰可提供双重功能以有利地同时改善3-HP产生和3-HP耐受。本文公开了用于各个实施方案的其它额外的遗传修饰。
本说明书和权利要求中所使用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括了复数指代，除非上下文明确指明其它含义。因此，例如，一种“表达载体”的提法包含了单个表达载体以及多个表达载体，其为相同(如，相同的操纵子)或不同的；微生物的提法包括了单一微生物以及多个微生物；等等。本文所使用的大肠杆菌菌株的细胞干重(DCW)计算为测定的0D_值的O. 33倍，基于OD6tltl测定的基线DCW。本文所使用的“降低的酶活性”、“降低酶活性”等意在表明微生物细胞的酶或分离的酶与同物种的可比较细胞中或其天然酶所测定的活性相比表现出较低的活性水平。即，在已知的标准条件下该酶的所示底物向所示产物的酶促转化比天然(未修饰)的酶在标准的指定条件下的相同生化转化的酶活性低至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80或至少90%。该术语还包括该酶活性的消除。可通过 本领域中任何已知的方法鉴定具有酶的降低酶活性的细胞。例如，酶活性分析可被用于鉴定具有降低的酶活性的细胞。例如，参见 Enzyme Nomenclature, Academic Press, Inc. , New York 2007。本文所使用的术语“异源DNA”、“异源核酸序列”等指的是其中存在至少以下一种情况的核酸序列(a)所述核酸序列对于给定宿主微生物是外源的(即，非宿主微生物中天然存在的)；(b)所述序列在给定的宿主微生物是天然存在的，但以非天然的量(例如，高于预期)存在；或(C)所述核酸序列包含两个或更多个非以天然情况下相同的相互关系存在的子序列。例如，关于情况(C)，重组产生的异源核酸序列具有两种或更多种来自非相关基因的序列，其经排列以产生新的功能核酸。术语“异源”意在包含术语“外源”，后者在通常在本领域中使用。对于引入异源核酸序列之前的宿主微生物的基因组，编码所述酶的核酸序列是异源的(无论所述异源核酸序列是否被引入该基因组中)。本文所使用的术语“基因破坏”或其语法上的等同词语(并包括“破坏酶功能”、“酶功能的破坏”等等)意指对微生物的遗传修饰，该修饰是被编码的基因产物与存在于或来自于未如此修饰的微生物细胞的多肽相比具有降低的多肽活性。遗传修饰可以是，例如，该完整基因的缺失、转录或翻译所需的调控序列的缺失或其它修饰、导致截短的基因产物(例如，酶)的部分基因的缺失或通过多种降低所编码基因产物活性的各种突变策略中的任何一种而进行。破坏可广义地包括编码酶的核酸序列的全部或部分的缺失，并且还包括但不限于其它类型的遗传修饰，例如引入终止密码子、移码突变、引入或去除基因的部分和引入降解信号、影响mRNA转录水平和/或稳定性的遗传修饰，以及改变编码酶的基因上游的启动子或阻遏物。在各种情况中，基因破坏被用于指对DNA、所述DNA所编码的mRNA以及对应的氨基酸序列的任意遗传修饰，该修饰导致降低的多肽活性。多种不同的方法可被用于产生具有降低的多肽活性的细胞。例如，细胞可使用常规诱变或敲除技术进行工程改造以具有被破坏的调控序列或多肽编码序列。例如，参见Methods in Yeast Genetics (1997版)，Adams等，Cold Spring Harbor Press (1998)。一种特别有用的基因破坏方法是全基因删除，因为其在本发明的遗传修饰的微生物中减少或消除遗传回复变异的出现。因此，对于其产物是酶的基因的破坏由此扰乱了酶学功能。或者，反义技术可被用于降低特定多肽的活性。例如，细胞可进行工程改造以包含编码反义分子的cDNA，该反义分子防止多肽被翻译。此外，基因沉默技术可被用于降低特定多肽的活性。
本文所使用的术语“反义分子”涵盖了包含对应于内源多肽编码链的序列的任何核酸分子或核酸类似物(如，肽核酸)。反义分子还可具有侧翼序列(如，调控序列)。因此，反义分子可以是核酶或反义寡核苷酸。本文所使用的核酶可具有任意通用结构，，包括但不限于，发夹、锤头或斧头结构，只要所述分子切割RNA。术语“降低”或“以降低”当以该用法或其语法上的等价物形式使用的时候意在包含这些转化的完全消除。本文所使用的生物产生可以是需氧的、微需氧的或厌氧的。本文所使用的语言“充分同源的”指的是蛋白质或其部分，其氨基酸序列包含了当与本申请中所提供的氨基酸序列(包括SEQ ID No./序列表)的某一氨基酸序列相比较时最低数目的相同或等同的氨基酸残基，如此以使所述蛋白质或其部分能够实现相应的酶学反应和/或其它功能。为测定是否特定的蛋白质或其部分充分同源，其可通过酶活性的分 析进行测定，如本领域中公认的分析方法。对于序列同一性和同源性的描述和方法用意是示例性的，并且应当了解这些概念在本领域中是众所周知的。此外，应当了解核酸序列可发生变化而仍然编码表现出所需功能性的酶或其它多肽，并且这样的变异处于本发明的范围内。关于核酸序列，“杂交”指的是两条单链多核苷酸进行非共价结合以形成稳定的双链多核苷酸的过程。所述术语“杂交”还可指三链杂交。(通常情况下)所产生的双链多核苷酸是“杂合体”或“双链体”。“杂交条件”通常包括低于约IM的盐浓度，更通常低于约500mM以及低于约200mM。杂交温度可以低至5°C，但通常高于22°C，更通常高于约30°C并且通常超过约37°C。杂交通常在严格条件下进行，即在探针与靶亚序列杂交的条件。严格条件是序列依赖性的并且在不同情况下有所不同。对于特异性杂交，较大片段可能需要较高的杂交温度。由于其它因素可影响杂交的严格性，包括碱基组成和互补链长度、有机溶剂的存在和碱基错配的程度，参数的组合比任一单独参数的绝对测量值更为重要。一般，严格条件选择为比特异性序列在给定离子强度和PH下的Tm低约5°C。示例性的严格条件包括，至少
O.OlM到不超过IM Na离子浓度(或其它盐类)的盐浓度，从7. O到8. 3的pH并且至少为25°C 的温度。例如，5XSSPE(750mM NaCl，50mM 磷酸钠，5mM EDTA，pH 7.4)和 25_30°C 的温度的条件适用于等位基因特异性探针杂交。对于严格条件，参见，例如Sambrook和Russell和 Anderson “Nucleic Acid Hybridization” 第一版，BIOS Scientific PublishersLimited(1999年)，其以杂交方案通过引用的方式并入本文。“特异地杂交”或“与其特异性地杂交”等表述指的是在一种或多种特定的核苷酸序列处于复合混合物(如，总细胞)DNA或RNA中时分子在严格条件下基本上与或仅与该序列结合、双链化或杂交。术语“确认的酶学功能变异体”指的是被测定拥有目标酶的酶活性以及特异性但是具有与该目标酶不同的氨基酸序列的多肽。可构建相应的“变体核酸序列”，其被测定为编码该确认的酶功能变异体。出于特定的目的，如通过提高微生物的3HPTGC的一种或多种酶促转化步骤中的酶促转化的遗传修饰而产生对3-HP的提高耐受性，可进行一种或多种遗传修饰以提供编码一种或多种确认的3HPTGC酶功能变异体的一种或多种异源核酸序列。即，这些核酸序列各自编码并非恰好是所述3HPTGC的某种酶的已知多肽的多肽，但是尽管如此，所述多肽表现出该酶的酶活性。这种核酸序列及其所编码的多肽可能不符合同源性或同一性的特定限制，尽管如此，其在细胞中的存在提供了所需的酶活性和特异性。获得这样的变异核酸序列和确认的酶功能变异体的能力得到在生物信息学和蛋白质工程和设计的现有技术中的最新进展的支持，其包括在计算、预测和高通量方法学上的进展。功能性变异体在更通常包括酶功能变异体以及编码它们的核酸序列，以及非酶多肽的变异体，其中所述变异体表现出源(目标)序列的功能。短语“目的片段”的使用意在包括目的基因及任何其它目的核酸序列。用于获得目的片段的方法的一个实例是获得微生物的培养物，其中所述微生物的基因组包含该目的基因或目的核酸序列片段。当本文中(包括权利要求)提及基因产物(即酶)的遗传修饰时，应当理解所述遗传修饰是通常编码基因产物(即酶)的核酸序列(例如或包括基因)的修饰。在一些实施方案中，被截短的相应多肽具有编码相应原始酶的核酸序列所编码的 多肽全长的至少约90%，且更特别地具有编码相应原始酶的核酸所编码的多肽全长的至少约95%。具有与多肽的参比氨基酸序列至少例如95% “同一”的氨基酸序列的多肽意指所述的多肽的氨基酸序列与所述参比序列一致，只是所述的多肽序列在所述多肽的参比氨基酸中的每100个氨基酸中可包括最多5个氨基酸改变。换言之，为获得具有与多肽的参比氨基酸序列至少具95% “同一”的氨基酸序列的多肽，所述参比序列中最多5%的氨基酸残基可被删除或以另一氨基酸替换，或者最多达所述参比序列的总氨基酸残基的5%的多个氨基酸可被插入所述参比序列中。对所述参比序列的这些改变可存在于所述参比氨基酸序列的氨基或羧基末端位置或这两个末端位置之间的任意位置，或者单个地散布于所述参比序列的残基之间或以一个或多个连续的组处于所述参比序列中。在其它实施方案中，根据本文它处所描述的，截短可能更为重要。物种以及其它种系发生的标识是根据微生物领域中的技术人员已知的分类方法。在本文所述的方法和步骤表示为以特定顺序发生的特定事件的情况中，本领域的技术人员应认识到特定步骤的顺序可被改变并且这样的改变与本发明的变化一致的。此夕卜，特定的步骤在可能的情况下可以平行的进程同时进行，以及顺序进行。本文提供的预测实施例意在具有广泛的示例作用并且不进行任何方式的限定。这适用于关于3-HP的分离和纯化以及3-HP向下游化合物的转化的实施例，因为这些步骤和转化存在大量的可能途径，包括本文所引用和并入的参考文献中公开的那些。缩略语的含义如下“C”指的是摄氏或摄氏度，如从其用法清楚地看出的。DCW指的是细胞干重，“s”指的是秒，“min”指的是分钟，“h”、“hr”或“hrs”指的是小时，“psi”指的是磅每平方英寸，“rnn”指的是纳米，“d”指的是天，“ μ L”、“uL”或“ul”指的是微升，“mL”指的是毫升，“L”指的是升，“mm”指的是毫米，“nm”指的是纳米，“mM”指的是毫摩，“μ Μ”或“ uM ”指的是微摩，“ M ”指的是摩，“ mmo I ”指的是毫摩尔，“ μ mo I ”或“ uMo I ”指的是微摩尔，“g”指的是克，“ μ g”或“ug”指的是微克，“ng”指的是纳克，“PCR”指的是聚合酶链反应，“0D”指的是光密度，“0D_”指的是在600nm光子波长下测量的光密度，“kDa”指的是千道尔顿，“g”指的是重力加速常数，“bp”指的是碱基对，“kbp”指的是千碱基对，“％W/v”指的是重量/体积百分比，“ % v/v”指的是体积/体积百分比，“IPTG”指的是异丙基-μ -D-硫代半乳糖吡喃糖苷，“RBS”指的是核糖体结合位点，“rpm”指的是每分钟转数，“HPLC”指的是高效液相色谱，“GC”指的是气相色谱。如本文所公开使用的，“3-HP”指的是3-羟基丙酸并且“3HPTGC”指的是3-HP耐受发生复合体。另外，10~5及类似用法用于指IO5等。I.碳源在本发明中与具有3-HP的生物合成途径的重组微生物一起使用的生物生产培养基必须包含适用于所预期的代谢途径的碳源或底物。适当的底物可包括但不限于，单糖如葡萄糖和果糖、寡糖如乳糖或蔗糖、多糖如淀粉或纤维素或其混合物以及来自可再生原料的未纯化混合物，如奶酪乳清渗透物(cheese whey permeate)、玉米衆、甜菜糖衆和大麦芽。此外，所述碳底物还可以是已经证明代谢转化为关键生化中间体的单碳底物，如二氧化碳、一氧化碳或甲醇。除单碳和双碳底物之外，还已知甲基营养生物体利用多种其它含碳化合物，如甲胺、葡糖胺以及多种用于代谢活性的氨基酸。尽管设想所有上述碳底物及其混合物作为碳源适用于本发明中，但用作碳源的常见碳底物是葡萄糖、果糖和蔗糖，以及任何这些糖的混合物。其它适合的底物包括木糖、阿拉伯糖、其它基于纤维素的C-5糖、高果糖玉米糖浆以及市售的各种其它糖类和糖混合物。 蔗糖可获自如甘蔗、甜菜、木薯、香蕉或其它水果以及甜高粱的原料。葡萄糖和右旋糖可通过对基于淀粉的原料进行的糖化而获得，所述原料包括谷物，如玉米、小麦、黑麦、大麦和燕麦。另外，在一些实施方案中全部或部分碳源可以是甘油。或者，甘油可排除作为添加的碳源。在一个实施方案中，碳源选自葡萄糖、果糖、蔗糖、右旋糖、乳糖、甘油及其混合物。在各种情况下，碳源中的这些组分的量可高于碳源的约50%、高于约60%、高于约70%、高于约80%、高于约90%或更高，最高达碳源的100%或基本为100%。此外，已知甲基营养生物利用多种其它含碳化合物，如甲胺、葡糖胺以及多种用于代谢活性的氨基酸。例如，已知甲基营养酵母利用来自甲胺的碳以形成海藻糖或甘油(Bellion 等,Microb. Growth Cl Compd. (Int. Symp.),第 7 版(1993 年)，415-32 页。编辑Murrell, J. Collin ；Kelly, Don P.出版商!Intercept, Andover, UK)。类似地，各种假丝酵母(Candida)种代谢丙氨酸或油酸(Suiter 等，Arch. Microbiol. 153 :485-489 页(1990年))。因此，设想本发明的实施方案中使用的碳源可涵盖多种多样的含碳底物。此外，可发酵糖类可通过例如，美国专利申请第2007/0031918A1号(其以引用的方式并入本文)中描述的预处理和糖化的过程获自纤维素和木质纤维素生物质。生物质指的是任何纤维素或木质纤维素材料并且包括包含纤维素并且任选地进一步包含半纤维素、木质素、淀粉、寡聚糖和/或单糖的材料。生物质还可包含另外的成分，如蛋白质和/或脂质。生物质可源自单一来源,或者生物质可包含源自超过一种来源的混合物；例如，生物质可包含玉米芯和玉米秸的混合物，或草和叶的混合物。生物质包括但不限于，生物能源作物、农业废物、城市固体废物、工业固体废物、造纸厂废渣、庭院垃圾、木材或林业废料。生物质的实例包括但不限于，玉米谷物、玉米芯、农作物废料如玉米苞皮、玉米秸、草料、小麦、小麦稻、大麦、大麦稻，干草、稻杆、柳枝、废纸、甘鹿洛、高粱、大豆、获自谷物磨坊的成分、树木、枝、根、叶、木屑、锯末、灌木和灌木丛、蔬菜、水果、花和动物粪便。任何这些生物质可被用于生物生产方法或系统中以提供碳源。用于将纤维素生物质降解成为更可得和可利用的碳分子(包括糖)的混合物的各种方法包括在存在浓酸或稀酸(如，< 1%的硫酸)的情况下进行加热；使用氨水进行处理；使用离子盐类进行处理；酶促降解；以及这些方法的组合。这些方法一般在机械分离和碾磨之后进行，并继之以适当的分离过程。
在各个实施方案中，多种糖类(包括但不限于蔗糖、葡萄糖、木糖、纤维素或半纤维素)中的任何糖被提供给微生物，诸如在包含反应器容器的工业系统中的微生物，所述反应器中可将确定的培养基(诸如最低盐培养基，包括但不限于M9基本培养基、硫酸钾基本培养基、酵母合成基本培养基和众多其它培养基或其变体)、提供一种或多种3-HP生物合成替代途径的微生物接种物以及碳源进行组合。所述碳源进入细胞并且通过众所周知的和常见的代谢途径进行分解代谢以产生包括磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的常见代谢中间体(参见 Molecular Biology of the Cell,第三版，B. Alberts 等，Garland Publishing,New York，1994年，42-45页，66-74页，其关于糖类的基础分解代谢途径的教导以引用的方式并入本文；Principles of Biochemistry,第三版，D. L. Nelson 与 Μ· M. Cox, WorthPublishers, New York，2000年，527-658页，其关于主要代谢途径的教导以引用的方式并入本文；以及 Biochemistry,第四版，L. Stryer, W. H. Freeman and Co. , New York, 1995 年，463-650页，其关于主要代谢途径的教导也以引用的方式并入本文。)根据多种方法可将基于生物的碳与基于石油的碳区分开来，所述方法包括但不限于ASTM D6866，或各种其它技术。例如，碳-14和碳-14比率在基于生物的碳源与基于石油的碳源中有所不同，其中较高的碳-14比率见于基于生物的碳源中。在各个实施方案中，所述碳源不是基于石油的，或不是主要基于石油的。在各个实施方案中，所述碳源高于约50 %是非基于石油的、高于约60%是非基于石油的、高于约70%是非基于石油的、高于约80%是非基于石油的、高于约90 %或更高是非基于石油的。在各个实施方案中，所述碳源具有约
I.OxlO-14或更高的碳14与碳12比率。各种组分可被排除于所述碳源之外。例如，在一些实施方案中，丙烯酸、I，4- 丁二醇和/或甘油被从碳源中排除或基本排除。如此，根据本发明的一些实施方案的碳源可以是低于约50%甘油、低于约40%甘油、低于约30%甘油、低于约20%甘油、低于约10%甘油、低于约5%甘油、低于约1%甘油或更低。例如，碳源可基本上是不含甘油的。基本不含甘油指的是可能以残存在的任何甘油基本上不对目标化学化合物的产生做出贡献。II.微牛物本文所述和所要求的特征可在选自本文列表的微生物中提供或在也包含一种或多种天然的、被引入的或增强的3-HP生物生产途径的其它适当微生物中提供。因此，在一些实施方案中，所述微生物包含内源3-HP产生途径(其在某些这样的实施方案中被增强)，而在其它的实施方案中所述微生物不包含内源的3-HP产生途径。多种这样的这些遗传修饰的微生物可包含遗传修饰和/或其它系统改变，其可能描述于一位或多位本发明人的其它专利申请中和/或转让给本专利申请的所有者的其它专利申请中。实施例描述了对特定细菌和酵母微生物的具体修饰和评估。本发明的范围并非意在限于这些物种，而是一般适用于广泛的适当微生物。一般情况下，本发明所使用的微生物可选自细菌、蓝细菌、丝状真菌和酵母。对于某些实施方案，最初选择用于3-HP耐受性生物产生的微生物宿主还应以高速率利用糖(包括葡萄糖)。大多数微生物能够利用碳水化合物。但是，特定的环境微生物 无法高效地利用碳水化合物，并且因此对于这些计划以葡萄糖或其它碳水化合物作为主要添加碳源的实施方案不是适当的宿主。
由于各个物种的基因组已为人所知，本发明可容易地被应用于范围不断扩大的适当微生物。此外，考虑到相对低成本的基因测序，目的物种的基因序列可易于测定以使对本发明方面的应用更易达成(基于将遗传修饰应用于具有已知基因组序列的生物体的方便性)。更特别地，根据本文所述的各种标准，用于包含本文提供的耐受性方面的3-HP生物产生的适当微生物宿主可包括但不限于，任何革兰氏阴性生物体，更特别地肠杆菌科的成员，如大肠杆菌，或食羧寡养菌(Oligotropha carboxidovorans),或假单胞菌属(Pseudomononas sp);任何革兰氏阳性微生物，如枯草杆菌、乳酸杆菌属(Lactobaccilussp.)或乳球菌属(Lactococcus sp.);酵母，例如酿酒酵母、毕赤酵母(Pichia pastoris)或树干毕赤酵母(pichia stipitis);以及其它群或微生物种。更为特别的情况下，用于3-HP的生物产生的适当微生物宿主一般包括但不限于以下属的成员，梭状芽胞杆菌属(Clostridium)、发酵单孢菌属(Zymomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽抱杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、产喊菌属(Alcaligenes)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、节杆菌属 (Arthrobacter)、棒杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属、汉逊酵母属(Hansenula)以及酵母属(Saccharomyces)。特别感兴趣的宿主包括食羧寡养菌(如菌株0M5)、大肠杆菌、真养产碱菌(钩虫贪铜菌)、地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis)、浸麻类芽抱杆菌(Paenibacillus macerans)、红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、鹁鸡肠球菌(Enterococcus gallinarium)、幾肠球菌(Enterococcus faecalis)、枯草杆菌和酿酒酵母。更为特别的情况下，用于3-HP生产物生的适当微生物宿主一般包括但不限于，梭状芽胞杆菌属、发酵单孢菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属、红球菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属、乳杆菌属、肠球菌属、产碱菌属、克雷伯氏菌属、类芽孢杆菌属、节杆菌属、棒杆菌属、短杆菌属、毕赤酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属以及酵母属的成员。特别感兴趣的宿主包括食羧寡养菌(如菌株0M5T)、大肠杆菌、真养产碱菌(钩虫贪铜菌)、地衣芽孢杆菌、浸麻类芽孢杆菌、红平红球菌、恶臭假单胞菌、植物乳杆菌、屎肠球菌、鹑鸡肠球菌、粪肠球菌、枯草杆菌和酿酒酵母。另外，这些菌种中的任意已知菌株可被用作为起始微生物，下列菌种包括其各自的菌种也可被使用Cupriavidus basilensis、Cupriavidus campinensis、Cupriavidus gilardi、Cupriavidus laharsis、耐金属贪铜菌(Cupriavidus metal I idurans)、Cupriavidus oxalaticus、Cupriavidus pauculus、Cupriavidus pinatubonensis、Cupriavidus respiraculi 和台湾贪铜菌(Cupriavidustaiwanensis)。在一些实施方案中，所述重组微生物是革兰氏阴性菌。在一些实施方案中，所述重组微生物选自发酵单孢菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属、产碱菌属以及克雷伯氏菌属。在一些实施方案中，所述重组微生物选自大肠杆菌、钩虫贪铜菌、食羧寡养菌和恶臭假单胞菌种。在一些实施方案中，所述重组微生物是大肠杆菌菌株。
在一些实施方案中，所述重组微生物是革兰氏阳性菌。在一些实施方案中，所述重组微生物选自梭状芽胞杆菌属、沙门氏菌属、红球菌属、芽孢杆菌属、乳杆菌属、肠球菌属、类芽孢杆菌属、节杆菌属、棒杆菌属和短杆菌属。在一些实施方案中，所述重组微生物选自菌种地衣芽孢杆菌、浸麻类芽孢杆菌、红平红球菌、植物乳杆菌、粪肠球菌、鹑鸡肠球菌、粪肠球菌和枯草杆菌。在特定的实施方案中，所述重组微生物是枯草杆菌菌株。在一些实施方案中，所述重组微生物是酵母。所述重组微生物选自毕赤酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属以及酵母属。在特定的实施方案中，所述重组微生物是酿酒酵母。进一步了解的是，根据本公开，上述的任何微生物中可被用于3-HP以外的其它化学产物的生产。对所述宿主进行遗传修饰的能力对于任何重组微生物的产生都是关键的。基因转 移技术的模式可以是通过电穿孔、接合、转导或自然转化。可获得广泛的宿主接合质粒和药物抗性标记物。针对可在宿主中发挥作用的抗生素抗性标记物的特性而对生物体进行克隆载体的改造。III.培养某和培养备件除适当的碳源例如诸如选自本文公开的类型之一以外，生物生产培养基必须包含本领域的技术人员所知适用于所述培养物的生长以及促进对3-HP生产和本发明所制备的其它产物所必需的酶学途径的适当矿物质、盐类、辅因子、缓冲剂和其它组分。本发明的另一个方面涉及培养基和培养条件，其包含本发明的遗传修饰的微生物并且任选地包含补充物。细胞一般情况下在约25°C到约40°C的温度范围内生长于适当的培养基中，并且对于嗜热性微生物温度最高达70°C。本发明中的适当生长培养基是常见的商业制备的培养基，如Luria Bertani (LB)液体培养基、M9基本培养基、沙氏葡萄糖(SD)液体培养基、酵母培养基(YM)液体培养基、(Ymin)酵母合成基本培养基以及本文所述的基本培养基如M9最低培养基。还可使用其它确定或合成生长培养基，并且用于所述特定微生物的生长的适当培养基应为微生物或者生物生产科学领域中的技术人员所知的。在各个实施方案中，可开发并使用不包含或者具有低水平的各种成分添加，例如低于10、5、2或lg/L的复合氮源(其包括但不限于酵母提取物、蛋白胨、胰蛋白胨、大豆粉、玉米浆或酪胨)，的基本培养基。这些基本培养基还可具有有限的维生素混合物的补充，其包括生物素、维生素B12及维生素B12衍生物、硫胺、泛酸酯及其它维生素。基本培养基还可具有有限的简单无机营养源，其包含低于28、17或2. 5mM的磷酸盐、低于25或4mM的硫酸盐，以及低于130或50mM的总氮。在本发明的实施方案中与遗传修饰的微生物一起使用的生物生产培养基必须包含适用于预期的代谢途径的碳源。根据上文所述，适当的碳源包含一氧化碳、二氧化碳和各种单体和寡聚糖类。用于所述生物生产的适当pH范围介于pH 3. O与pH 10. O之间，其中pH 6. O到pH8. O是初始条件的典型pH范围。但是，用于特定实施方案的实际培养条件并不应受这些pH范围的限制。生物生产可在需氧的、微需氧的或厌氧的条件下通过搅拌或不通过搅拌而进行。3-HP或在生物生产培养基中生产的其它产物的量可以使用本领域已知的多种方法进行测定，例如，高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)或GC/质谱(MS)。本文中提供了用于特定实施例的特定HPLC方法。IV.牛物牛产反应器和系统利用了本发明的方法和/或组合物的发酵系统也在本发明的范围之内。
本文所述和/或所指的任何重组微生物可被引入工业生物生产系统之中,其中所述微生物在可商业实施的运行过程中将碳源转化成为3-HP。所述生物生产系统包含将这种重组微生物与碳源底物和适于所述重组微生物生长的生物生产培养基一起引入生物反应器容器中，以及将所述生物生产系统维持于适当的温度范围(以及，在所述反应是需氧的或微需氧的情况下，溶解氧浓度范围)内适当的时间以获得所需的部分所述底物分子向3-HP的转化。工业生物生产系统和及它们的运行为化学工程和生物过程工程领域的技术人员所熟知的。生物生产可在需氧的、微需氧的或厌氧的条件下在搅拌或不搅拌条件下进行。为实现需氧的、微需氧的或厌氧的条件而对培养物和微生物群体进行的操作在本领域中是已知的，且包含营养培养基和这些微生物群体的液体培养基的溶解氧水平可进行监测以维持或证实所需的需氧、微需氧或厌氧条件。当使用合成气作为进料的时候，可使用需氧、微量需氧或厌氧条件。当使用糖类的时候，在各个实施方案中可以实施厌氧、需氧或微需氧条件。本文所述和/或所指的任何重组微生物可被引入工业生物生产系统之中，其中所述微生物在可商业实施的运行过程中将碳源转化成为3-HP，并且还在各个实施方案中任选地转化成为3-HP的一种或多种下游化合物。所述生物生产系统包含将这种重组微生物与碳源底物和适于所述重组微生物生长的生物生产培养基一起引入生物反应器容器中，以及将所述生物生产系统维持于适当的温度范围(以及，在所述反应是需氧的或微量需氧的情况下，溶解氧浓度范围)之内适当的时间以获得所需的部分所述底物分子向3-HP的转化。在各个实施方案中，合成气组分或糖类被提供给微生物，诸如包含反应器容器的工业系统中的微生物，所述反应器容器中将限定培养基(诸如最低盐类培养基，其包括但不限于M9基本培养基、硫酸钾基本培养基、酵母合成基本培养基和众多其它培养基或其变体)、提供本文所教导的生物合成途径的实施方案的微生物接种物以及碳源进行了组合。所述碳源进入细胞并且通过众所周知的和常见的代谢途径进行分解代谢以产生包含磷酸烯酉享式丙酮酸(PEP)在内的常见代谢中间体(参见Molecular Biology of the Cell,第三版，B. Alberts 等，Garland Publishing, New York, 1994 年，42-45 页，66-74 页，其关于糖基础分解代谢途径的教导以引用的方式并入本文；Principles of Biochemistry,第三版，D. L. Nelson 与 Μ. M. Cox, Worth Publishers, New York, 2000 年，527-658 页，其关于主要代谢途径的教导以引用的方式并入本文；以及Biochemistry,第四版，L. Stryer, W. H. Freemanand Co.，New York，1995年，463-650页，其关于主要代谢途径的教导也以引用的方式并入本文)。除工业生物生产的类型以外，本发明的各个实施方案可使用批类型的工业生物反应器。经典的批式生物反应器系统被认为是“封闭”的，意为培养基的成分在各自生物生产事件开始之前被确定并且在生物生产事件基本结束止的时间段内不进行人工的改动和添力口。因此，在生物生产事件开始之时以所需的一种或多种生物体对所述培养基进行接种，并且使生物生产得以在不对该系统进行任何添加的情况下进行。然而，一般情况下，“批式”类型的生物生产事件对于碳源添加是成批进行的并且通常在诸如PH和氧浓度的因素控制下进行尝试。在批式系统中，系统的代谢物和生物质组成平稳地变化直至所述生物生产事件被终止。在批培养物中，细胞和缓通过静止停滞期(static lag phase)直至高生长对数期，并最终达到静止期，该期之中生长速率消退或停止上升。在不进行处理的情况下，静止期的细胞将最终死亡。处于对数期的细胞通常负责产生大部分所需终产物或中间体。在标准批式系统上进行的改变是补料分批系统。补料分批生物生产过程也适用于本发明并且其包含典型的批式系统，其不同之处在于营养物(包括底物)在生物生产进程之中按增量加入。当代谢物阻遏倾向于抑制所述细胞的代谢时和期望在所述培养基中含有限量的底物的情况下，补料分批系统是有用的。补料分批系统中的实际营养物浓度的度量可被直接进行测量，例如通过不同时间的样品分析，或者可根据诸如pH、溶解氧和废气(如CO2)的分压的可测量因素的变化而估测。分批和补料分批方法是常见的并且在本 领域是为人所熟知的，其实例可见于Thomas D. Brock在Biotechnology :A Textbook ofIndustrial Microbiology,第二版(1989 年)Sinauer Associates, Inc. , Sunderland,Mass.，Deshpande, Mukund V.，Appl. Biochem. Biotechnol. ,36 :227, (1992 年)，以及Biochemical Engineering Fundamentals,第二版，J. E. Bailey and D. F. Ollis, McGrawHill,New York，1986年，其关于生物生产的一般指导以引用的方式并入本文。尽管本发明的实施方案可以批式或补料分批模式进行实施，应了解本发明可经适应于连续的生物生产方法。连续生物生产被认为是“开放”系统，其中为限定的生物生产培养基被连续地向生物反应器添加并且同时除去等量的条件化培养基以用于加工。连续的生物生产通常将培养物维持于受控的密度范围内，其中细胞主要处于对数期生长之中。两种类型的连续生物反应器运行包括恒化器，其中新鲜的培养基被补入容器中并同步除去等比率的容器内容物。该方法的限制在于细胞受损失并且高细胞密度通常是不可得的。实际上，一般情况下使用补料分批过程可获得高得多的细胞密度。另一种连续生物反应器利用了灌注培养，其类似物恒化器方法，不同之处在于从容器中除去的流被用于将活细胞重循环到所述容器的分离工艺。已经显示该类型的连续生物反应器产生比补料分批显著提高的细胞密度并且可连续地运行。连续的生物生产对于工业运行特别有利，因为其具有与为进行下一生物生产事件而对该设备排空、清洗和预备相关的更短停机时间。进一步，连续运行如分馏这样的下游单元操作一般比在分批模式下运行更为经济。连续生物生产允许对影响细胞生长或终产物浓度的一种因素或多种因素的调控。例如，一种方法将限制性营养物(如碳源或氮水平)维持于固定比率并且允许所有其它参数适度。在其它的系统中，影响生长的多种因素可被连续地改变而根据培养物浊度测定的细胞浓度保持恒定。调控营养物和生长因素以用于连续生物生产过程的方法以及用于最大化产物形成速度的技术在工业微生物领域中是为人所熟知的，并且在上述Brock的文献中详细描述了多种方法。据预期本发明的实施方案可使用分批、补料分批或连续过程中的任意方法而实施，并且任何已知的生物生产模式都是适合的。据预期细胞可被固定于作为全细胞催化剂的惰性支架上并且被用于适用于3-HP生产的生物生产条件或者在诸如培养器的容器内被培养于液体培养基中。因此，用于这些过程的以及利用这些过程的生物生产系统中的实施方案包括本发明的遗传修饰的微生物群体、包含处于包含用于该群体的营养物的培养基中的该群体的培养系统以及制备3-HP和因此制备3-HP的下游产物的方法。本发明的实施方案包括在生物生产系统中制备3-HP的方法，所述方法中的一些可包括在该生物生产事件之后获取3-HP。例如，制备3-HP的方法可包括向培养容器提供包含适当营养物的培养基；向该培养容器提供遗传修饰的微生物的接种物，所述微生物包含本文所述的遗传修饰，例如从合成气和/或糖分子产生3-HP的微生物；以及将所述培养 容器维持于适用于所述遗传修饰的微生物生产3-HP的条件下。处于本发明的范围之内的是产生重组微生物和用于生物生产方法和系统(包括用于3-HP生产的工业生物生产系统)中，所述微生物经基因工程改造以改变一种或多种多个方面，以与缺乏所述一种或多种修饰的对照微生物相比有效地提高对3-HP的耐受性(以及在一些实施方案中提高3-HP的生物生产)至少20%。在各个实施方案中，本发明针对根据本文所述用于丙烯酸生物生产的系统，所述系统包括对生物质进行糖化的储罐；用于将糖化产物送至发酵罐的管线，其任选地经过预发酵罐；适用于微生物细胞培养的发酵罐；用于从所述发酵罐将内容物排放至提取和/或分离容器的管线；适用于将3-羟基丙酸从细胞培养物废料中移除的提取和/或分离容器；用于将3-羟基丙酸转移至脱水容器的管线；以及适用于将3-羟基丙酸转化成为丙烯酸的脱水容器。在各个实施方案中，所述系统包括一个或多个预发酵罐、蒸馏塔、离心容器、反萃取柱、混合容器或其组合。下列公开资源以引用的方式并入本文，其相应教导表明其各自领域中的技术水平，并且根据需要支持教导如何形成和利用从糖源工业生物生产3-HP或本发明产生的其它产物的方法，以及可被用于通过本发明的任意重组微生物获得该转化的工业系统的公开(Biochemical Engineering Fundamentals,第二版，J. E. Bailey 和 D. F. Ollis, McGrawHill, New York，1986年，全书用于所指明的用途并且第9章特别用于生物反应器设计；Unit Operations of Chemical Engineering,第 5 版，W.L. McCabe 等，McGraw Hill, NewYork 1993年,全书用于所指明的用途并且特别用于加工和分离技术分析EquilibriumStaged Separations,P. C. ffankat,Prentice Hall,Englewood Cliffs,NJ USA,1988 年，全书用于分离技术指导)。基本上，进一步了解的是，根据本公开，任意上述方法和系统可被用于3-HP以外的化学产物的生产。V.遗传修饰、核酸序列和氨基酸序列本发明的实施方案可源自表达载体向宿主微生物中的引入，其中所述表达载体包含编码酶的核酸序列，该酶正常情况下存在或不存在于宿主微生物中。对宿主进行遗传修饰的能力对于任何遗传修饰(重组)的微生物的产生都是关键的。基因转移技术的模式可以是电穿孔、接合、转导或自然转化。存在广泛的宿主接合质粒和药物抗性标记物。根据可在宿主中发挥作用的抗生素抗性标记物的性质针对宿主生物体进行克隆载体的改造。此外，根据本文公开，遗传修饰(重组)的微生物可包含由质粒引入的以外的修饰，包括对其基因组DNA的修饰。本领域中早已认识到，可对氨基酸序列中的某些氨基酸进行改变而对该蛋白质结构或功能无显著影响。包括的变异体可由缺失、插入、倒置、重复和类型置换组成，只要所表示的酶活性未受到显著的不良影响。关于哪种氨基酸变化很可能为表型沉默的指导可见于特别是，Bowie，J. U.等，“Deciphering the Message in Protein S equences Toleranceto Amino Acid Substitutions，” Science 247 :1306-1310 页(1990 年)。该文献关于这些教导以引用的方式并入本文，但其通常也是为本领域的技术人员所知的。在各个实施方案中，通过本发明的寡聚核苷酸分子的表达而获得的多肽可具有与本文关于3-HP耐受性相关的和生物合成的途径的描述中的基因和/或核酸序列所编码的一种或多种氨基酸序列至少约 50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的一致性。作为实际的问题，无论任意特定的多肽与本文所述的任何多肽(其可对应于本文所述的特定核酸序列)的任何参照氨基酸序列是否具有至少
100%的同一性，这样的特定多肽序列可使用已知的计算机程序(如 Bestfit 程序)常规地确定(Wisconsin Sequence Analysis Package,用于 Unix 的版本 8, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive,Madison，Wis. 53711)。当使用Bestfit或任何其它序列比对程序以确定特定序列与本发明的参照序列是否具有，例如，95%的同一性的时候，对参数进行设定以使同一性百分比根据所述参照氨基酸序列的全长进行计算并且允许同源性间隙(gaps in homology)最高达该参照序列的氨基酸残基总数的5%。例如，在特定的实施方案中，参照序列(查询序列，即本发明的序列)和受指序列之间的同一性，亦称为全局序列比对(global sequence alignment),可使用基于Brutlag等(Comp. App. Biosci. 6 :237-245(1990年))的算法的FASTDB计算机程序进行确定。对同一性进行狭义理解的特定实施方案所优选的用于FASTDB氨基酸比对的参数是评分方案=PAM(百分接受突变)0, k-tuple = 2,错配罚分=I,接合罚分(Joining Penalty)=20,随机化组长度=O,截止罚分(Cutoff Score) = I,窗口大小=序列长度,空位罚分=5,空位大小罚分=0. 05，窗口大小=500或被比对氨基酸序列长度，取二者之较小值。根据该实施方案，如果所述序列由于N-或C-末端缺失而非由于内部缺失短于所述查询序列，则考虑到FASTDB在计算全局百分同一性的时候不计入N-或C-末端缺失的事实而对所述结果进行人工校正。对于相对于查询序列在N-和C-末端截短的所述序列，通过计算侧向于所述序列的N-和C-末端的残基(其不与对应的比对残基匹配/对准)的数目占该查询序列总碱基的百分比而校正百分同一性。对残基是否匹配/对准的确定可根据FASTDB序列比对的结果而进行。随后将该百分比从通过FASTDB程序使用指定的参数而计算的百分同一性减去而获得最终百分同一性。该最终百分同一性得分是用于本实施方案的目的。只有与所比对序列的N-和C-末端的残基(其不与所对比序列匹配/对准)被考虑用于人工调整百分同一性得分的目的。即，只有在所比对序列的N-和C-最末端残基之外的查询残基位置被考虑用于该人工校正。例如，将90个氨基酸残基的比对序列与100个残基的查询序列进行比对以测定百分同一性。缺失发生在比对序列的N-末端，因此FASTDB比对不显示N-末端前10个残基的匹配/比对。这10个未配对残基占该序列的10% (N-和C-末端不匹配残基数/查询序列的总残基数)，因此从FASTDB程序所计算出的百分同一性得分中减去10%。如果剩下的90个残基被完美匹配，则最终百分同一性应为90%。在另一个实例中，将90个残基的对比序列与100个残基的查询序列进行对比。这一次缺失是内部缺失，因此在比对序列的N-或C-末端不存在与查询序列不匹配/对准的残基。在此情况下，不对通过FASTDB计算出的百分同一性进行人工校正。再次重申，如FASTDB比对中显示的，仅仅对比对序列的N-和C-末端之外的与查询序列不匹配/对准的残基位置进行人工校正。更一般的情况下，可制备包含编码具有酶活性的多肽的分离多聚核苷酸的核酸构建体，该分离多聚核苷酸可操作地连接于一种或多种(数种)控制序列，所述控制序列在处于适合该控制序列的条件下在诸如大肠杆菌的微生物中指导所述编码序列的表达。可对所述分离的多聚核苷酸进行操作以提供所述多肽的表达。所述多聚核苷酸序列在其插入载体之前所进行的操作可以是有利的或者必要的，这取决于表达载体。使用重组DNA方法修饰多核苷酸序列的技术在本领域中已被充分确立。所述控制序列可以是适当的启动子序列，为被宿主细胞识别以用于编码本发明多肽的多核苷酸表达的核苷酸序列。所述启动子序列包含转录控制序列，其介导所述多肽的表达。所述启动子可以是在选择的宿主细胞内显示转录活性的任何核苷酸序列，其包括突变、截短和杂合启动子，并且其可获自与宿主细胞同源或者异源的编码细胞外或细胞内多肽的基因。适用于指导所述核酸构建体转录的启动子，尤其是在大肠杆菌宿主细胞内，的 实例是，Iac 启动子(Gronenborn, 1976 年，MoI. Gen. Genet. 148 :243-250 页)、tac 启动子(DeBoer 等，1983 年，Proceedings ofthe National Academy of Sciences USA 80 :21-25页)、trc 启动子(Brosius 等，1985 年，J. Biol. Chem. 260 :3539-3541 页)、T7RNA 聚合酶启动子(Studier 和Moffatt，1986 年，J. MoI. Biol. 189 :113-130 页)、噬菌体启动子pL(Elvin等，1990 年，Gene 87 :123-126 页)、tetA 启动子(Skerra，1994 年，Gene 151 :131-135 页)、araBAD 启动子(Guzman 等，1995 年，J. Bacteriol. 177 :4121-4130 页)和 rhaPBAD 启动子(Haldimann 等，1998 年，J. Bacteriol. 180 :1277-1286 页)。其它启动子在 ScientificAmerican 的“Useful proteins from recombinant bacteria，，，1980 年，242 :74-94 ;和在Sambrook 与 Russell 的“Molecular Cloning A Laboratory Manual, ”2001 年第三版(1-3卷)，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.中均有描述。所述控制序列还可以是适当的转录终止子序列，其是宿主细胞所识别以终止转录的序列。所述终止子序列可操作地连接于编码多肽的核苷酸序列的3'-末端。本发明中可使用在大肠杆菌细胞中具功能性的任意终止子。也可能希望添加允许相对于宿主细胞生长调控多肽表达的调控序列。调控系统的实例是导致所述基因的表达响应于化学或物理刺激而开启或关闭的系统，所述刺激包括调控性化合物的存在。原核系统中的调控系统包括lac、tac和trp操纵子系统。对于本发明的各个实施方案，基因操作可被描述为包括各种基因操作，其包括改变任何相应途径中鉴定的酶或酶活性的调控并因此改变其最终活性的基因操作。这些遗传修饰可针对导致选定和/或鉴定的培养条件下的酶活性和/或选择性的变化的转录、翻译或翻译后修饰，和/或针对提供另外的核酸序列，例如，以增加3-HP生产相关的酶的拷贝数目和/或突变体。实施这类遗传修饰的具体方法学和途径为本领域的技术人员所公知的，并且包括但不限于提高内源基因元件的表达；降低阻遏基因的功能性；引入外源基因元件；提高编码对产生3-HP的酶学转化步骤进行催化的多肽的核酸序列的拷贝数；对基因元件进行突变以提供突变蛋白质从而提高特定的酶活性；过表达；低表达；过表达分子伴侣；敲除蛋白酶；改变或修饰反馈抑制；提供包含一种或多种受损的抑制子和/或竞争性抑制剂结合位点的酶变异体；敲除阻遏基因；进化、选择和/或其它用于提高mRNA稳定性的途径，以及对具有实现有效改善水平的有效拷贝数和启动子的质粒的使用。可进行随机诱变发生以提供遗传修饰，所述遗传修饰可属于这些或另外所述的任何途径。所述遗传修饰进一步广泛地属于在目的核酸中的一个或多个核酸的添加(包括插入)、缺失(如，通过突变)以及置换。在各个实施方案中，遗传修饰产生了酶的改善酶的比活性和/或周转数。非进行限制，该变化可通过以下的一种或多种进行测量KM ；Kcat和Kgn。在各个实施方案中，为更有效地发挥功能，微生物可包含一种或多种基因删除。例如，在大肠杆菌中，可对编码乳酸脱氢酶(IdhA)、磷酸乙酰转移酶(pta)、丙酮酸氧化酶(poxB)和丙酮酸-甲酸裂解酶(pflB)进行破坏(包括删除)。这些基因破坏(包括删除)并非是限制性的，而是可以在各个实施方案中以各种组合进行实施。基因删除可通过突变性基因删除途径而获得，和/或从具有一种或多种这些酶的表达降低或无表达的突变体菌株开始而获得，和/或通过本领域的技术人员所知的其它方法而获得。基因删除可通过多种已知的特定方法中的任意方法而完成，其包括但不限于使用Gene Bridges (Gene BridgesGmbH, Dresden, Germany, www. genebridges. com )所销售的试剂盒和其它试剂进行的RED/ET 方法。特别地有关后一方法，Red/ET重组的使用为本领域的普通技术人员所知并且在Stewart等的美国专利第6，355,412号和第6，509，156号中有所描述，其对于该方法的教导以引用的方式并入本文。这些方法的材料和试剂盒可来自Gene Bridges (Gene BridgesGmbH, Dresden, Germany, www. genebridges. com ),并且所述方法可遵循制造商的说明而进行。所述方法涉及可选择标记物通过以来自λ-噬菌体的重组酶实施的同源重组而对靶基因的替换。表达λ-red重组酶的宿主生物体使用编码可选择标记物的线性DNA产物进行转化，所述可选择标记物侧邻与所述靶基因同源的末端区域(一般 50bp，或者最高达约 300bp)。所述标记物可随后通过另一重组步骤而去除，该步骤通过携带FPL-重组酶或诸如Cre这样的另一重组酶的质粒而进行。可进行微生物染色体DNA的靶向删除或外源基因物质向微生物染色体的添加用以改变宿主细胞的代谢，从而降低或者消除不良代谢产物的产生。这可结合其它遗传修饰使用，诸如本文在该基本实例中所描述的遗传修饰。在本详述中，参考了多个实施方案以及附图，其中可实施本发明的特定示例性实施方案以示例性的方式给出。这些实施方案以充分的细节进行了描述以使本领域的技术人员得以实施本发明，应当了解技术人员可对多种公开的实施方案加以调整。另外，为进行3-HP的生产，这些遗传修饰可被选定和/或被筛选以实现相应酶学转化步骤中相应3-HP生产途径中通过特定酶学转化步骤的高流速，并且因此可以影响基础或主要途径中的一般细胞代谢。应当了解氨基酸“同源性”包括保守置换，即，以具有类似特性的另一种氨基酸对多肽中的给定氨基酸进行的替换。下列置换一般被视为保守置换以如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的脂肪族氨基酸替代另一脂肪族氨基酸；以苏氨酸替代丝氨酸或相反；以如天冬氨酸和谷氨酸的酸性残基替代另一酸性残基；以如天冬酰胺和谷氨酰胺的携带酰胺基团的残基替代另一携带酰胺基团的残基；如赖氨酸和精氨酸的碱性残基替代另一碱性残基；和如苯丙氨酸和酪氨酸的芳香残基替代另一芳香残基。对于本文提供的所有核酸和氨基酸序列，应当了解包括这些序列的保守修饰的变、异体并且在本发明的各个实施方案中处于本发明的范围之内。功能上等同的核酸和氨基酸序列(功能变异体)(其可包含保守修饰的变异体以及处于本领域普通技术人员的技能范围内的更为广泛地变化的序列)及包含这些序列的微生物也处于本发明的各个实施方案的范围之内，同样处于本发明的各个实施方案的范围之内的还有包含这些序列和/或微生物的方法和系统。在各个实施方案中，编码充分同源的蛋白质或其部分的核酸处于本发明的范围之内。更一般的情况下，编码本发明所使用的特定氨基酸序列的核酸序列可由于遗传密码的简并性而有所变化，而且尽管如此其仍属于本发明的范围之内。下表提供了氨基酸之间的相似性的总结，保守性和较低保守性的置换可基于该氨基酸之间的相似性，下表还提供了反映这种简并性的各种密码子冗余性。表I
氨基酸相关性DNA密码子
丙氨酸N, AliGCT，GCC，GCA，GCG
脯氨酸NCCT，CCC，CCA，CCG
缬氨酸N, AliGTT, GTC, GTA, GTG
亮氨酸N, AliCTT，CTC，CTA，CTG，TTA，TTG
异亮氨酸N, AliATT，ATC，ATA
甲硫氨酸NATG
苯丙氨酸N, AroTTT，TTC
色氨酸NTGG
甘氨酸PUGGT，GGC，GGA，GGG
丝氨酸PUTCT，TCC，TCA，TCG，AGT，AGC
苏氨酸PUACT, ACC，ACA，ACG
天冬酰胺PU, AmiAAT，AAC
谷氨酰胺PU, AmiCAA，CAG
半胱氨酸PUTGT，TGC
天冬氨酸NEG, AGAT，GAC
谷氨酸NEG, AGAA，GAG精氨酸~POS，BCGT，CGC，CGA，CGG，AGA，AGG
赖氨酸P0S, BMA, MG
组氨酸POSCAT, CAC
酪氨酸TAT，TAC
终止密码子TAA，TAG, TGA說明侧基及其它相关属性A =酸性；B =碱性；Ali =脂族；Ami =胺；Aro =芳香族；N =非极性-’PU =极性不带电；NEG =带负电；P0S =带正电。此外，本文提及的特定核酸序列的变异体和部分以及相应的编码的氨基酸序 列在这些核酸序列变异体和/或部分包含与本文提及的核酸序列中的任何15个核苷酸的序列(包括但不限于，始于第I号核苷酸并终于第15号核苷酸的序列、始于第2号酸核苷并终于第16号核苷酸的序列、始于第3号核苷酸并终于第17号核苷酸的序列，以此类推)一致的15个核苷酸的序列时可表现出所需的功能性，例如选定水平的酶活性。应当了解本发明还提供了分离的核酸，其包含长度超过15个核苷酸(如，16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多核苷酸)并且与本文提及的核酸序列中的序列任意部分一致的核苷酸序列。例如，本发明提供了包含与本文提及的任何一种或多种(包括任意组合的)核酸序列中给出的任意25个核苷酸的序列(其包括但不限于，始于第I号核苷酸并终于第25号核苷酸的序列、始于第2号核苷酸并终于第26号核苷酸的序列、始于第3号核苷酸并终于第27号核苷酸的序列，以此类推)一致的25个核苷酸的序列的分离核酸。另外的实例包括但不限于，包含长为50或更多核苷酸(如，100、150、200、250、300或更多核苷酸)并且与本文公开的任意序列的任何部分一致的核苷酸序列的分离核酸。这些分离的核酸可包括但不限于，包含在讨论和/或实施例中的任一部分中所示的核酸序列的那些分离的核酸，例如，涉及3-HP产生途径，编码所述脂肪酸合成酶系统的酶或3-HP耐受性的核酸序列。例如，本发明提供了包含本文所列的核酸序列的分离的核酸，该序列包单个插入、单个缺失、单个置换、多个插入、多个缺失、多个置换或其任意组合(例如单个缺失与多个插入)。这些分离的核酸分子可以与本文所列(即，序列表中)的核酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、97%、98%或 99% 的序列同一性。另外的实例包括但不限于，包含编码长为50或更多个氨基酸残基(如，100、150、200、250、300或更多个氨基酸残基)并且与本文所列或其它方式公开的氨基酸序列的任意部分一致的氨基酸序列的核酸序列的分离核酸。另外，本发明提供了分离的核酸，其包含编码具有对本文所列或其它方式公开的氨基酸序列的变异的氨基酸序列的核酸序列。例如，本发明提供了分离的核酸，其包含编码含有单个插入、单个缺失、单个置换、多个插入、多个缺失、多个置换或其任意组合(例如单个缺失与多个插入)的本文所列或其它方式公开的氨基酸序列的核酸序列。这些分离的核酸分子可包含编码与本文所列或其它方式公开的氨基酸序列具有至少6075%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%的序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。提供了保守性或其它氨基酸置换基础的特性的实例被示例于表I中。因此，本领域的技术人员可进行大量替换以获得表现出所需功能性的氨基酸序列变异体。可使用BLASTP, CLUSTALP和其它比对和比较工具以评估高度保守的区域，该区域可进行较少的置换(除非意图将活性改变至选定水平，这可能需要多个置换)。更多的置换可在被公认为或据信为不参与活性位点或其它结合或结构基序的区域中进行。根据表1，例如，可以以一种极性不带电(PU)氨基酸替换所列的序列中的极性不带电氨基酸，任选地对大小/分子量加以考虑(即，以丝氨酸替换苏氨酸)。关于哪种氨基酸改变有可能为表型沉默的指导可特别地见于，Bowie, J. U.等,“Deciphering the Message in Protein Sequences Tolerance toAmino Acid Substitutions,’’Science 247 :1306-1310页(1990年)中。该文献关于这些教导以引用的方式并入本文，但其通常也是为本领域的技术人员所知的。公认的保守性氨基酸置换包括(可替换氨基酸遵循密码子组中的各个密码子)丙氨酸丝氨酸；精氨酸赖氨酸；天冬酰胺谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸谷氨酸；半胱氨酸丝氨酸；谷氨酰胺:天冬酰胺；谷氨酸天冬氨酸；甘氨酸脯氨酸；组氨酸天冬酰胺或谷氨酰胺异亮氨酸；亮氨酸或缬氨酸亮氨酸；异亮氨酸或缬氨酸；赖氨酸精氨酸或谷氨酰胺或谷氨酸；甲硫氨酸亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸甲硫氨酸或亮氨酸或酪氨酸；丝氨酸苏氨酸；苏氨酸丝氨酸；色氨酸酪氨酸；酪氨酸色氨酸眼或苯丙氨酸；缬氨酸异亮氨酸或亮氨酸。应注意特定物种的密码子偏倚性和密码子使用表可被用于对分离核酸分子进行工程改造，其利用了该特定物种的密码子使用偏倚性。例如，本文提供的分离核酸可被设计以具有特定目的生物体所偏好使用的密码子。有多种软件和测序服务可用于这种序列的密码子优化。本发明提供了包含本文所列或其它方式公开的氨基酸序列的整个氨基酸序列的多肽。此外，本发明提供了包含本文所列或其它方式公开的氨基酸序列的一部分的多肽。例如，本发明提供了包含15个氨基酸的序列的多肽，该序列与本文所列或其它方式公开的氨基酸序列的任意15个氨基酸的序列(包括但不限于，始于第I号氨基酸残基并终于第15号氨基酸残基的序列、始于第2号氨基酸残基并终于第16号氨基酸残基的序列、始于第3号氨基酸残基并终于第17号氨基酸残基的序列，以此类推)相一致。应当了解，本发明还提供了包含长度超过 15 个氨基酸残基(如，16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个氨基酸残基)并且与本文所列或其它方式公开的氨基酸序列中的任意部分一致的氨基酸序列的多肽，例如，本发明提供了包含与本文所列或其它方式公开的氨基酸序列的任意25个氨基酸的序列(包括但不限于，始于第I号氨基酸残基并终于第25号氨基 酸残基的序列、始于第2号氨基酸残基并终于第26号氨基酸残基的序列、始于第3号氨基酸残基并终于第27号氨基酸残基的序列，以此类推)相一致的25个氨基酸的序列的多肽。另外的实例包括但不限于，包含长度为50或更多个氨基酸残基(如，100、150、200、250、300或更多个氨基酸残基)并且与本文所列或其它方式公开的氨基酸序列的任意部分一致的氨基酸序列的多肽。另外应当了解，根据上文，15个核苷酸的序列提供5个氨基酸的序列，因此，之后的并且更长的氨基酸序列可通过具有与本文提供的序列的同一性的上述核苷酸序列长度进行定义。此外，本发明提供了其氨基酸序列具有对本文所列或其它方式公开的氨基酸序列的变异的多肽。例如，本发明提供了包含含有单个插入、单个缺失、单个置换、多个插入、多 个缺失、多个置换或其任意组合(例如单个缺失与多个插入)的本文所列或其它方式公开的氨基酸序列的多肽。这些多肽可包含与本文所列或其它方式公开的氨基酸序列具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或 99% 的序列同一性的氨基酸序列。特定的变异体氨基酸序列可包含多个变异以及变异类型的任意组合。在各个实施方案中，本发明包括具有对本文公开的任意多核苷酸或多肽序列的变异的氨基酸序列。例如，对SEQ ID NO :544中所示的碳酸酐酶(大肠杆菌cynT)氨基酸序列的变异作为示例被提出。图3提供了所述大肠杆菌碳酸酐酶与其它11个物种的碳酸酐酶之间的CLUSTAL多序列比对，该11个物种的碳酸酐酶根据低E值在BLASTP比较中具有相对高同源性。SEQ ID NO :544是所显示的第五个序列。多同源性和低同源性置换被示出(即，分别通过“”和”标记)，其可导致本领域技术人员进行的额外的修饰。因此，SEQID NO :544中所示的序列变异的实例包括但不限于，图3中所示的任意序列变异。这些变异提供于图3中，其中SEQ ID NO :544中所示序列的特定位置处氨基酸残基(或其缺失)与在图3中的其它i^一个氨基酸序列中的任意一个的相同比对位置处的氨基酸残基(或其缺 失)的比较提供了 SEQ ID NO :544所示的序列的特定变异的列表。例如，根据图3所示位于SEQ ID NO :544的第14位的“E”谷氨酸可被替换为“D”天冬氨酸或“N”天冬酰胺。应当了解，SEQ ID NO :544所示的序列可包含多种变异以及变异类型的任意组合。应注意到，图3中提供的氨基酸序列可以是具有碳酸酐酶活性的多肽。根据本文所示，具有变异氨基酸序列的多肽可保持酶活性。这些多肽可使用诸如定点诱变或各种PCR技术的标准方法通过对编码多肽的核酸序列进行操作而产生。根据本文所述，一种类型的修饰包括了一个或多个氨基酸残基对具有类似化学和/或生化特性的氨基酸残基的置换。例如，多肽可具有本文所列或以其它方式公开的氨基酸序列中的氨基酸序列，其包含一个或多个保守置换。更实质的改变可通过选择具较低保守性的置换和/或处于更为关键性的序列区域中而获得，例如选择更为明显地不同于保持以下特性的效应的残基(a)在该置换区域内的多肽骨架的结构，例如，作为折叠片和螺旋构象；(b)多肽在靶位点的电荷或疏水性；或(C)侧链主体。通常预期在多肽功能上产生最大变化的置换是以下那些情况(a)亲水残基如丝氨酸或苏氨酸置换(或被置换为)疏水残基如亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸或丙氨酸；(b)半胱氨酸或脯氨酸置换(或被置换为)任何其它残基；(C)具有电正性侧链的残基如赖氨酸、精氨酸或组氨酸置换(或被置换为)电负性残基如谷氨酸或天冬氨酸；或(d)具有大侧链的残基如苯丙氨酸置换(或被置换为)不具侧链的残基，如甘氨酸。可评估这些氨基酸置换(或其它的缺失或添加)对具有酶活性的多肽的效果，该评估通过分析所述多肽催化与相关天然多肽相同的底物转化为与相关天然多肽相同的产物的能力而进行。因此，本发明提供了具有5、10、20、30、40、50或更少保守置换的多肽。多肽和编码多肽的核酸可通过标准的DNA诱变技术而产生，例如，M13引物诱变。这些技术的细节提供于Sambrook和Russell, 2001年中。核酸分子可包含编码区域的变化以适合于分子将引入其中的特定生物体的密码子使用偏倚性。或者，可利用遗传密码的简并性改变编码区域以改变所述编码序列而使得尽管所述核酸序列发生较大改变，但其仍然编码具有与天然氨基酸序列相同或者基本类似的氨基酸序列的多肽。例如，在该开放读码框架中丙氨酸由核苷酸密码子三联体GCT所编码。由于遗传密码的简并性，三种另外的核苷酸密码子三联体-GCA、GCC和GCG-也编码丙氨酸。因此，开放读码框架的核酸序列可在该位置被改变成这三种密码子中的任意一个而不影响被编码多肽的氨基酸序列或该多肽的特征。根据遗传密码的简并性，可根据本文所述使用标准的DNA诱变技术从本发明所公开的核酸序列产生核酸变异体，或通过核酸序列的合成而产生。因此，对于各个实施方案，本发明涵盖了编码相同多肽但由于遗传密码的简并性而在核酸序列上有所变化的核酸分子。本发明还提供了分离的核酸分子，其至少长约12个碱基(如，至少长约13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、100、250、500、750、1000、1500、2000、3000、4000 或 5000
个碱基)并且在杂交条件下与具有本文所列或以其它方式公开的序列的核酸正义链或反义链杂交。所述杂交条件可以是中度 或高度严格杂交条件。此外，在一些实施方案中微生物包含内源3-HP产生途径(其可在一些这样的实施方案中被增强)，而在其它实施方案中微生物不包含3-HP产生途径但被提供编码具有ー种或多种完成本文所述途径的酶活性的多肽的ー种或多种核酸序列，从而导致3-HP的产生。在一些实施方案中，本文所公开的特定序列或其保守修饰变异体被提供给选择的微生物，诸如选自本文所列的一种或多种物种或物种群体或者其它分类学组。VI.丙ニ酰-CoA从脂肪酸合成向3-HP的重定向本发明的组合物，诸如遗传修饰的微生物，包含其中丙ニ酰-CoA作为底物的化学产物产生途径，并且还可包含ー种或多种遗传修饰以降低由ー种或多种脂肪酸合成酶系统基因所编码的酶的活性。所述组合物可用于本发明的方法和系统中。对于多种化学产物在众多商业发酵用途的微生物中的微生物发酵，丙ニ酰-CoA是在正常的生长条件下被转化成为随后被用于细胞膜和其它关键细胞功能的脂肪酸及其衍生物(如磷脂)的代谢中间体。例如，在大肠杆菌中，所述脂肪酸合成酶系统是II型或解离的脂肪酸合成酶系统。在该系统中，脂肪酸产生途径的酶由不同基因所编码，并且与众多关键代谢途径一祥，其受到良好调控，包括下游产物抑制上游酶。在各个实施方案中，代谢中间体丙ニ酰-CoA通过脂肪酸合成系统(即，途径或复合体)向脂肪酸的转化是丙ニ酰-CoA的唯一或主要用途。经测定，当在微生物中存在指向替代化学产物的产生途径时，丙ニ酰-CoA向脂肪酸的这种转化的降低可改善该替代化学产物(如，3-HP)产生的量度。例如，在多种微生物细胞中所述脂肪酸合成酶系统包含具有下列酶活性的多肽丙ニ酰-CoA-酰基载体蛋白(ACP)酰基转移酶；β -酮脂酰基-ACP合成酶；β -酮脂酰基-ACP还原酶；β -羟酰基-ACP脱水酶；3_羟酰基-(ACP)脱水酶；以及烯酰基-酰基载体蛋白还原酶(烯酰基-ACP还原酶)。在各个实施方案中，编码这些多肽的温度敏感形式的核酸序列可被引入以替换天然酶，并且当这样的经遗传修饰的微生物在提高的温度下(在该温度下这些不耐热的多肽由于蛋白质结构的改变或完全变性而部分地或完全地失活)进行培养的时候，观察到了诸如3-ΗΡ这样的产物的増加。在其它实施方案中，可进行其它类型的遗传修饰以另外地调控(如降低)这些多肽的ー种或多种的酶活性。在各个实施方案中，这样的遗传修饰的结果是变换了丙ニ酰-CoA的利用以使得存在丙ニ酰-CoA向脂肪酸的转化、总体生物质的减少以及按比例地增加碳源向如3-ΗΡ这样的化学产物的转化。在各个实施方案中，通过微生物产生的化学产物的比生产率高得出人意料。此外，对于特定的实施方案可进行另外的遗传修饰，诸如用于提高丙ニ酰-CoA产生的遗传修饰。
一种酶，烯酰基(酰基载体蛋白)还原酶(EC No. I. 3. I. 9，亦称为烯酰基-ACP还原酶)，是用于由丙ニ酰-CoA生物合成脂肪酸的关键酶。在大肠杆菌中该酶(FabI)由基因fabl 所编码(參见，“Enoyl-Acyl Carrier Protein (fabl) Plays a Determinant Role inCompleting Cycles of Fatty Acid Elongation in Escherichia coli，，, Richard J. Heath和 Charles 0. Rock, J. Biol. Chem. 270 44, 26538-26543 页(1995 年)，其关于 fabl 和脂肪酸合成酶系统的讨论以引用的形式并入本文)。本发明可利用具有编码多肽的核酸序列(多核苷酸)的微生物，所述多肽具有可在发酵事件中受到调控的烯酰基-ACP还原酶活性。例如，编码温度敏感型烯酰基-ACP还原酶的核酸序列可被提供以取代天然烯酰基-ACP还原酶，从而使得提高的培养温度导致降低的酶活性，这随后引起丙ニ酰-CoA的利用转向所需化学产物的产生。在这种提高的温度下，酶被认为就该温度而言是不容许的。一种这样的序列是大肠杆菌的突变温度敏感性fabl (fabIts)，对于 DNA 为 SEQ ID NO :769，对于蛋白质为 SEQ ID NO :770。应当了解大肠杆菌以外的物种中烯酰基-ACP还原酶的核酸和氨基酸序列可通过在已知基因组数据库中进行的同源性捜索(如BLASTN和BLASTP)而容易地获得。获得其它物种中的同源物和功能等同序列的途径在本文中有所描述。因此，应当了解本领域的技术人员可将本发明实施于具有商业价值的多种微生物物种。可根据本领域的技术人员所知使用除温度敏感型的烯酰基-ACP还原酶之外的其它方法，例如但不限于，将天然烯酰基-ACP或烯酰基-CoA还原酶替换成包含用于该酶的诱导型启动子的核酸序列，从而可在初始诱导后继之以无诱导，由此在达到选定的细胞密度之后降低烯酰基-ACP或烯酰基-CoA还原酶的酶活性。在ー些方面，本发明的组合物、方法和系统在遗传修饰的微生物中变换了丙ニ酰-CoA的利用，该微生物包含脂肪酸合成酶系统的至少ー种酶，诸如烯酰基-酰基载体蛋白还原酶(烯酰基-ACP还原酶)或烯酰基辅酶A还原酶(烯酰基-CoA还原酶)、β -酮脂酰基-ACP合成酶或β -酮脂酰基-Cok合成酶，丙ニ酰-CoA-ACP，并且可进ー步包含编码碳酸酐酶的核酸序列的至少ー种遗传修饰以提高微生物细胞中的重碳酸盐水平和/或对其培养基的重碳酸盐和/或碳酸盐的补充，并且可进ー步包含一种或多种遗传修饰以提高こ酰CoA羧化酶和NADPH依赖性转氢酶中的ー种或多种酶的酶活性。更一般的情况下，碳酸盐和/或重碳酸盐的添加可被用于提高发酵液体培养基中的重碳酸盐水平。在ー些方面，本发明包含了遗传修饰的微生物，所述微生物包含至少ー种提供、完成或者增强有效地将丙ニ酰-CoA转化成为3-HP的3-HP产生途径的遗传修饰，且进ー步包含碳酸酐酶的遗传修饰以提高微生物细胞内的重碳酸盐水平或对其培养基的重碳酸盐和/或碳酸盐补充，并且可进ー步包含ー种或多种遗传修饰以提高こ酰CoA羧化酶和NADPH依赖性转氢酶中的ー种或多种酶的酶活性。相关的方法和系统使用了这些遗传修饰的微生物。
在ー些方面，本发明包含遗传修饰的微生物，所述微生物包含至少ー种提供、完成或者增强有效地将丙ニ酰-CoA转化成为3-HP的3-HP产生途径的遗传修饰，并且进ー步包含脂肪酸合成酶系统的至少ー种酶的遗传修饰，如烯酰基-酰基载体蛋白还原酶(烯酰基-ACP还原酶)或烯酰基-辅酶A还原酶(烯酰基-CoA还原酶)、β -酮脂酰基-ACP合成酶或β -酮脂酰基-CoA合成酶、丙ニ酰-CoA-ACP，并且可进ー步包含碳酸酐酶的遗传修饰以提高微生物细胞内的重碳酸盐水平或对其培养基的重碳酸盐和/或碳酸盐补充，并且可进ー步包含ー种或多种遗传修饰以提高こ酰CoA羧化酶和NADPH依赖性转氢酶中的ー种或多种酶的酶活性。相关的方法和系统使用了这些遗传修饰的微生物。在各个实施方案中，本发明涉及制备化学产物的方法，其包括在容器中提供遗传修饰的微生物群体的选定细胞密度，其中所述遗传修饰的微生物包含用于从丙ニ酰-CoA产生化学产物的产生途径；以及降低所述经遗传修饰的微生物的脂肪酸合成酶途径中的至少ー种酶的酶活性。在各个实施方案中，降低微生物宿主细胞中的烯酰基-ACP还原酶的酶活性导致3-HP以提高的単位生产率和容积生产率产生。在再另外的实施方案中，降低微生物宿主细胞中的烯酰基-CoA还原酶的酶活性导致3-HP以提高的单位和容积生产率产生。进行遗传修饰以降低这些酶的酶活性的另ー种方法是提供对ー种这样的酶如烯酰基-ACP还原酶(如，大肠杆菌中的fabl)进行转录启动的诱导型启动子。在这样的实例中，该启动子可以在本文方法的第一阶段被诱导(如使用异丙基-μ -D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG))，且在IPTG被耗尽、去除或稀释之后，可开始进行降低烯酰基-ACP还原酶酶活性的第二歩。其它方法可被应用于控制酶的表达和活性，诸如本文所述的方法和/或本领域技术人员所知的方法。尽管烯酰基-CoA还原酶被认为是脂肪酸合成酶系统的重要的酶，遗传修饰还可对于编码表现出该系统的酶活性的多肽(如本文所列的)的多核苷酸(核酸序列)的任意组合进行。例如，FabB，β-酮脂酰基-酰基载体蛋白合成酶I，是大肠杆菌中对于生长以及饱和和不饱和脂肪酸的生物合成关键的酶。FabB的失活导致脂肪酸延伸的抑制和减慢的细胞生长，以及消除将丙ニ酰基-ACP的丙ニ酸部分重循环至こ酰-Cok的无效循环。FabF，β -酮脂酰基-酰基载体蛋白合成酶II，在细胞中是饱和脂肪酸合成和控制膜流动性所需要的。这两种酶均被浅蓝菌素所抑制。据报道FabF的过表达导致减少的脂肪酸生物合成。FabF被认为超过FabB而与丙ニ酰-CoA = ACPこ酰转移酶FabD竞争结合。FabB与FabD的结合是起动脂肪酸延伸的缩合反应所需的(參见Microbiological Reviews, 1993年9月，57卷522-542页，No. 3 ；K.Magnuson 等，“Regulation of Fatty Acid Biosynthesis in Escherichiacol i,，，American Society for Microbiology ；ff. Zha 等，“ Improving cellularmaIonyI-CoA level in Escherichia coli via metabolic engineering,，，MetabolicEngineering 11 (2009年)192-198页)。ー种降低这类脂肪酸合成酶的遗传修饰的替代方法是向培养系统中提供一种或多种这些酶的适当抑制剂。该方法可独立实施或与遗传修饰方法进行组合实施。诸如浅蓝菌素、硫乳霉素和三氯生(本列表不是限制性的)的抑制剂或用于降低由ー种或多种脂肪酸合成酶系统基因所编码的酶的活性的遗传修饰可单独或组合使用。不期望受限于特定的理论，据认为在微生物中降低烯酰基-ACP还原酶(和/或脂肪酸合成酶系统的其它酶)的酶活性导致了该酶的上游代谢中间体丙ニ酰-CoA的累积和/ 或分流，并且该丙ニ酰-CoA可随后被转化成为微生物细胞包含利用了丙ニ酰-CoA的针对其的代谢途径的化学产物。在本发明的特定的组合物、方法和系统中，使得烯酰基-ACP还原酶的(或在更一般的情况下，脂肪酸合成酶系统的)酶活性的降低在遗传修饰的微生物达到充分的细胞密度之后发生。这ー两阶段培养方法获得了支持特定生产率的细胞生物质中的理想催化剂量与产率之间的平衡，这可部分地归因于在所述烯酰基-ACP还原酶活性(和/或脂肪酸合成酶系统的其它酶的活性)被降低之后更少的碳被导向细胞物质。这导致了丙ニ酰-CoA净利用的转向，由此提供朝向所需化学产物的更高碳流。在本发明的各个实施方案中，単位生产率提高并且这产生了整体上迅速而有效的微生物发酵方法和系统。在各个实施方案中，容积生产率也显著地提高。在各个实施方案中，遗传修饰的微生物包含包括丙ニ酰-CoA向所需化学产物3_羟基丙酸(3-HP)的转化的代谢途径。这被认为对于商业3-HP生产经济是颇为有利的，并且被认为是具有明显经济效益的进步。本文还公开了其它化学产物。在単位生产率和容积生产率參数上的改善是出人意料的并且属于本领域的进步。 根据本文的讨论，烯酰基-ACP还原酶活性和/或脂肪酸合成酶系统的其它酶的降低可通过多种方式实现。丙ニ酰-CoA向脂酰基-ACP或脂酰-CoA分子或向脂肪酸分子转化的“调控手段”指的是下列任何ー种1)在微生物细胞中提供至少ー种多核苷酸，其编码至少ー种具有脂肪酸合成酶系统(如本文所述的)中的一种酶的活性的多肽，其中如此编码的多肽具有(诸如通过突变和/或启动子替换等等以降低酶活性)或可经调控而具有(诸如通过温度敏感性、诱导型启动子等)降低的酶活性；2)向包含微生物细胞或群体的容器提供抑制剂，所述抑制剂抑制一种或多种脂肪酸合成酶系统的酶(如本文所述的)的酶活性，其剂量有效地降低这些酶的一种或多种的酶活性。这些手段可互相组合提供。当用于调控的手段涉及在发酵事件过程中从脂肪酸合成酶系统的较高活性向较低活性的转化时，例如通过提高包含遗传修饰的微生物群体(其包含温度敏感性脂肪酸合成酶系统多肽(如烯酰基-ACP还原酶))的培养器的温度或通过添加抑制剂，设想存在两种模式一一种模式期间这种脂肪酸合成酶系统具有较高活性，而第二种模式期间其具有较低活性。在较低活性模式过程中，可发生丙ニ酰-CoA的较大利用向选定的化学产物的转向。一旦所述调控有效地降低所述的ー种或多种酶活性，与天然的未调控酶活性(如在细胞中或分离的)相比，如此调控的各相应酶活性可減少至少百分之10、至少百分之20、至少百分之30、至少百分之40、至少百分之50、至少百分之60、至少百分之70、至少百分之80或至少百分之90。类似地，与在非调控的细胞中或其它系统中的这种转化相比，丙ニ酰-Cok向脂酰基-ACP或脂酰基-Cok分子的转化可減少至少百分之10、至少百分之20、至少百分之30、至少百分之40、至少百分之50、至少百分之60、至少百分之70、至少百分之80或至少百分之90。同样地，与在非调控的细胞或其它系统中的这种转化相比，丙ニ酰-CoA向脂肪酸分子的转化可減少至少百分之10、至少百分之20、至少百分之30、至少百分之40、至少百分之50、至少百分之60、至少百分之70、至少百分之80或至少百分之90。VII.从丙ニ酿-CoA至3-HP的产牛涂径在各个实施方案中，本发明的组合物、方法和系统涉及包括将丙ニ酰-CoA转化成为目的化学产物的代谢产生途径。作为ー个实例，3-HP被选择作为所述目的化学产物。进ー步关于3-HP产生途径的具体序列，对来自橙色绿屈挠菌(C. aurantiacus)的丙ニ酰-CoA还原酶(mcr)进行了基因合成并通过DNA 2. O的服务进行密码子优化。FASTA序列显示于 SEQ ID NO :783 中(gi | 42561982 | gb | AAS20429. I 丙ニ酰-CoA 还原酶(橙色绿曲挠菌))。Mcr在NCBI数据库中有非常少的序列同源物。当对全蛋白质进行检索时，Blast检索找到了 8种不同的序列。因此，预期垛叠序列比较的进行只产生有限的信息。但是，尽管如此本发明的实施方案可包含这八种序列(其在本文出示并标识为SEQ ID No :784至791)中的任一序列，其预计对于该酶活性是双功能的，但未经证实。其它的实施方案可包含SEQ ID No :784至791中任一序列的突变的或其它变异体形式，以及多核苷酸(包括具有保守或其它置换的变异体形式)，如被引入选定微生物以在其中提供或提高3-HP产生的那些。 如下表所示，CLUSTAL 2. O. 11多序列比对将这八个序列标为相应的SEQ ID No:783-791。表2
参考编号_ Seq ID No. _属种_
gi|42561982|gb|AAS20429.1_ 783 _ 橙色绿屈挠菌 _
gi|163848165IrefjYP 001636209__784 _橙色绿屈挠菌 J-10-fl _
gi|219848167 |ref| YP_002462600 785Chloroflexus aggregans
__DSM 9485 _
gi| 156742880|ref|YP_001433009 786Roseiflexus castenholzii
__DSM 13941 _
gi|148657307|reflYP_001277512 787玫瑰弯菌(Roseiflexus ) sp.
__RS-I _
gi|85708113|reflZP_01039179.1 788赤杆菌(Erythrobacter) sp.
__NAPl_
gi|254282228|reflZP_04957196.1 789γ 变形菌(proteobacteriu )
__N0R51-B _
gi|254513883|reflZP 05125944.1 790 _γ 变形菌 NOR5-3 _
gi|119504313IreflZP 01626393.1 \ l9\ _| 3 海洋 γ 变形菌 HTCC208 _丙ニ酰-CoA在包含下列ー种或多种的微生物中可被转化成为3-ΗΡ 双功能丙ニ酰-CoA还原酶，如，可获自橙色绿屈挠菌和其它微生物种。与此相关的双功能指的是丙ニ酰-CoA还原酶催化丙ニ酰CoA向丙ニ酸半醛的转化和丙ニ酸半醛向3-ΗΡ的转化。单功能丙ニ酰-CoA还原酶与3-ΗΡ脱氢酶组合。单功能指的是丙ニ酰-CoA还原酶催化丙ニ酰-CoA向丙ニ酸半醛的转化。
上述多肽中任ー种可以是NADH-或NADPH依赖的，并且本领域已知的方法可被用于将特定的酶转化为任一形式。更特别地，如在W02002/042418中指出的，“可使用任意方法将以NADPH用作辅因子的多肽转化成以NADH作为辅因子的多肽，诸如其它文献所描述的方法(Eppink 等，J Mol. Biol. , 292 (I) :87-96 页(1999 年)，Hall 和 Tomsett,Microbiology,146 (Pt 6) :1399-406 页(2000 年)，以及 Dohr 等，Proc. Natl. Acad. Sci.，98 (I) :81-86 页(2001 年))，，并非进行限制，双功能丙ニ酰-CoA还原酶可选自橙色绿屈挠菌(如来自ATCC29365)的丙ニ酰-CoA还原酶以及其它序列。同样并非进行限制，单功能丙ニ酰-CoA还原酶可选自Sulfolobus tokodaii的丙ニ酰-CoA 还原酶(SEQ ID NO :826)。关于橙色绿屈挠菌的丙ニ酰-CoA还原酶，该序列以及其它种的序列对于此酶活性也可以是双功能的。当在微生物细胞中提供单功能丙ニ酰-CoA还原酶吋，还可提供3-HP脱氢酶酶活性以将丙ニ酸半醛转化成为3-HP。根据实施例中所显示的，可通过对双功能单功能丙ニ酰-CoA进行截短并在具有将丙ニ酸半醛转化成为3-HP的酶的菌株中进行结合而获得单功能丙ニ酰-CoA还原酶。另外，注意到在勤奋金属球菌(Metallosphaera sedula)中已知有另一种丙ニ酰-CoA还原酶(Msed_709，鉴定为丙ニ酰-CoA还原酶/琥珀酰-CoA还原酶)。通过提供编码具有上述酶活性的多肽的核酸序列，根据本发明的实施方案遗传修饰的微生物可包含有效的3-HP途径以将丙ニ酰-CoA转化成为3-HP。其它的3-HP途径，如包含转氨酶的3-HP途径(參见，例如，公开于2010年I月28日的WO 2010/011874)，也可在本发明的遗传修饰微生物的实施方案中提供。并入本部分的是，本发明提供了针对选定化学产物如3-羟基丙酸(3-HP)的提高的単位生产率和容积生产率量度。在各个实施方案中，化学产物如3-HP的产生不与生长相关联。在各个实施方案中，例如通过使用本文所公开的ー种方法，3-HP的产生或替代情况下它的ー种下游产物(如本文所述)的产生可达到至少I、至少2、至少5、至少10、至少20、至少30、至少40和至少50g/升的滴度。通过了解本文所公开的关于选定化学产物的商业发酵的进展可认识到，本发明的实施方案可结合其它的遗传修饰和/或方法或系统调控，从而获得有效产生至少10、至少20、至少30、至少40、至少45、至少50、至少80、至少100或至少120克化学产物(如3-HP)每升最終(如，用过的)发酵液体培养基而同时以本文公开的单位和/或容积生产率实现这种产生的微生物(及相应方法)。在一些实施方案中，微生物化学生产事件(即，使用培养的微生物群体进行的发酵事件)使用根据本文所述的遗传修饰的微生物进行，其中单位生产率介于每小时每克微生物细胞干重O. 01至O. 60克产生的3-HP(g 3-HP/g DCW_hr)之间。在各个实施方案中，单位生产率高于O. 01、高于O. 05、高于O. 10、高于O. 15、高于O. 20、高于O. 25、高于O. 30、高于O. 35、高于O. 40、高于O. 45或高于O. 50g 3-HP/g DCW_hr。在特定的微生物化学生产事件中可在2、4、6、8、12或24小时期间评估单位生产率。更特别的情况下，3-HP或其它化学产物的单位生产率介于 O. 05 与 O. IOg 3-HP/g DCW-hr 之间、O. 10 与 O. 15g 3-HP/g DCW_hr 之间、O. 15 与 O. 20g 3-HP/g DCW-hr 之间、O. 20 与 O. 25g 3-HP/g DCff-hr 之间、0· 25 与 O. 30g3-HP/g DCW-hr 之间、(λ 30 与(λ 35g 3-HP/g DCW-hr 之间、(λ 35 与(λ 40g 3-HP/g DCff-hr之间、0. 40 与 0. 45g 3-HP/g DCW-hr 之间，或 0. 45 与 0. 50g 3-HP/g DCW-hr 之间，0. 50 与0. 55g 3-HP/g DCW-hr之间，或0. 55与0. 60g 3-HP/g DCW-hr之间。各个实施方案包括了
表现出这样的生产率的培养系统。另外，在本发明的各个实施方案中，获得的容积生产率可为O. 25g 3-HP (或其它化学产物)每升每小时(g (化学产物)/L-hr)、可高于O. 25g 3-HP (或其它化学产物)/L-hr、可高于O. 50g 3-HP(或其它化学产物)/L-hr、可高于I. Og 3-HP(或其它化学产物)/L-hr、可高于I. 50g 3-HP (或其它化学产物)/L-hr、可高于2. Og 3-HP (或其它化学产物)/L-hr、可高于2. 50g 3-HP (或其它化学产物)/L-hr、可高于3. Og 3-HP (或其它化学产物)/L-hr、可高于3. 50g 3-HP (或其它化学产物)/L-hr、可高于4. Og 3-HP (或其它化学产物)/L-hr、可高于4. 50g 3-HP (或其它化学产物)/L-hr、可高于5. Og 3-HP (或其它化学产物)/L-hr、可高于5. 50g 3-HP(或其它化学产物)/L-hr、可高于6. Og 3-HP(或其它化学产物)/L-hr、可高于6. 50g 3-HP(或其它化学产物)/L-hr、可高于7. Og 3-HP(或其它化学产物)/L-hr、可高于7. 50g 3-HP (或其它化学产物)/L-hr、可高于8. Og 3-HP (或其它化学产物)/L-hr、可高于8. 50g 3-HP (或其它化学产物)/L-hr、可高于9. Og 3-HP (或其它化学产物)/L-hr、可高于9. 50g 3-HP (或其它化学产物)/L-hr或可高于10. Og 3-HP (或其它化学产物)/L-hr。在一些实施方案中，在24小时发酵(培养)期间测量的単位生产率可高于O. 01、O. 05,0. 10,0. 20,0. 5,1. 0,2. 0,3. 0,4. 0,5. 0,6. 0,7. 0,8. 0,9. 0,10. 0,11. O 或 12. O 克化学产物每克微生物DCW (基于24小时期间结束时的最终DCW)。在本发明的各个方面和实施方案中，在微生物单位生产率上产生了显著提高，其推动了发酵技术和如3-HP(但不限于此)的微生物化学生产的商业经济可行性。換言之，在各个实施方案中，所述单位生产率超过(至少为)0. Olg化学产物/g DCW-hr、超过(至少为)0. 05g化学产物/g DCW-hr、超过(至少为)O. IOg化学产物/g DCW-hr、超过(至少为)0. 15g化学产物/g DCW-hr、超过(至少为)O. 20g化学产物/g DCW-hr、超过(至少为)0. 25g化学产物/g DCW-hr、超过(至少为)O. 30g化学产物/g DCW-hr、超过(至少为)0. 35g化学产物/g DCW-hr、超过(至少为)O. 40g化学产物/g DCW-hr、超过(至少为)O. 45g化学产物/g DCW-hr、超过(至少为)O. 50g化学产物/gDCW-hr、超过(至少为)0. 60g化学产物/g DCW-hr。更一般的情况下，基于本文所述的遗传修饰的各种组合，任选地结合本文所述的补充，3-HP和本文所述的其它化学产物的单位生产率值可超过O. Olg化学产物/g DCff-hr,可超过O. 05g化学产物/g DCW-hr，可超过O. IOg化学产物/g DCW_hr，可超过O. 15g化学产物/g DCW-hr，可超过O. 20g化学产物/g DCW-hr，可超过O. 25g化学产物/g DCW-hr，可超过O. 30g化学产物/g DCW-hr，可超过O. 35g化学产物/g DCW-hr，可超过O. 40g化学产物/g DCW-hr，可超过O. 45g化学产物/g DCW_hr，和可超过O. 50g或O. 60化学产物/g DCW-hr。在特定的微生物化学生产事件中可在2、4、6、8、12或24小时期间内评估该单位生产率。通过本发明的实施方案获得的改善可通过与缺乏本文所教导的特定遗传修饰组合的对照微生物(存在或不存在本文所教导的向包含微生物群体的容器中的补充的情况下)相比较，単位生产率的提高百分比或容积生产率的提高百分比而确定。对于特定的实施方案及其组，这些单位生产率和/或容积生产率提高超过这种适当对照微生物的相应单位生产率和/或容积生产率至少百分之10、至少百分之20、至少百分之30、至少百分之40、至少百分之50、至少百分之100、至少百分之200、至少百分之300、至少百分之400以及至少百分之500。本说明书以及以引用的方式并入的引用文献的具体方法和教导可被引入实施例中。另外，在各个实施方案中，3-HP或它的下游产物之一(如本文所述下游产物)的产生可达到至少I、至少2、至少5、至少10、至少20、至少30、至少40和至少50g/升的滴度。
所述度量值可适用于利用本文所公开的遗传修饰的微生物和/或方法的任何组合物(如遗传修饰的微生物)、方法(如生产3-HP或其它化学产物的方法)以及系统(如发酵系统)。应当了解，使用本文提供的策略和方法以及根据对所述途径和途径部分之间的相互关系的发现而进行的反复改进可产生甚至更高的3-HP产量和耐受性以及在3-HP生物生产事件完成时进ー步提高的3-HP滴度。多种策略可导致产生适当修饰的适用于3-HP产生途径的酶。关于丙ニ酰-CoA还原酶，可使用或修饰如紧接上文表中的序列所编码的酶以在微生物菌株中获得适当水平的3-HP生产能力。VIII.提高对3-HP的耐等件已经鉴定了包含大量互相关联的代谢途径的全部或一部分的复合体，其中提高名为3-HP耐受发生复合体(“3HPTGC”)的该复合体的酶的酶活性的遗传修饰显示为提高微生物对3-HP暴露的耐受性。所述3HPTGC在公开于2010年I日28日的WO 2010/011874中有所描述，其对于所述3HPTGC以及关于3HP产生的遗传修饰的组合及基于3HPTGC和其中的组的3-HP耐受性的教导以引用的方式并入本申请。根据本文所述以及详细讨论的，本发明广泛地涉及使用遗传修饰进行的改变和/或培养基调控(如，酶促转化产物或其它特定化学品的添加)以在基于微生物的エ业生物生产方法、系统和组合物中获得所需的結果。关于所述耐受性方面，本发明源于发现包含特定的代谢途径部分(其包含提高的活性(基于其中编码的核酸序列的増加的拷贝数)与微生物对3-HP的耐受性提高相关的酶类)的3HPTPC的出人意料的重要性。本文提供了涉及3HPTPC改变的实际数据和/或预测实施例。这些实例意图证明应用的广泛(基干与显示提高的3-HP耐受性的3HPTGC相关的基因组元件的巨大数量)以及用于获得3-HP耐受性提高的ー些特定途径。途径可进行组合以获得3-HP耐受性的额外改善或协同改善，并且可包括遗传性或非遗传性的改变(如，涉及以特定化学品进行的系统补充，或对エ业系统的一般改变)。另外，对具体的产生策略进行了公开和举例说明。因此，除上述的用于提供3-HP产生途径和提供包含和/或控制编码烯酰基-ACP还原酶的基因的核酸序列以实现对该酶的酶活性的控制的遗传修饰和/或如本文描述的脂肪酸合成酶系统的其它修饰之外，在各个实施方案中还对遗传修饰的微生物进行了ー种或多种遗传修饰以提高其对3-HP (或其它化学产物)的耐受性。因此，在本发明的一些实施方案中，遗传修饰的微生物可包含至少ー种遗传修饰以提供、完成或增强ー种或多种3-HP产生途径，至少ー种遗传修饰以提供烯酰基-ACP还原酶和/或可经控制以在所需的细胞密度下降低该活性的脂肪酸合成酶系统的其它修饰，和3HPTGC或其ー个、两个或三个或更多个组的至少ー种遗传修饰以提高所述遗传修饰的微生物对3-HP的耐受性。因此，本发明的ー个方面涉及遗传修饰的微生物，其包含至少ー种有效地提高3_羟基丙酸(“3-HP”)产生的遗传修饰(其中所述提高的3-HP产生水平高于野生型微生物中3-HP产生水平)，和包含本文中鉴定为3-HP耐受发生复合体(“3HPTGC”)的代谢复合体的至少ー种遗传修饰。在特定的条件下，如在基本培养基中的培养，所述3HPTGC遗传修饰使所述遗传修饰的微生物能够在特定的培养条件下产生3-HP，从而使3-HP可积累至相对较高的浓度而不出现在非修饰微生物中所观察到的毒性效应。3-HP产生途径的至少ー种遗传修饰可用于提高3-HP的积累和/或改善野生型微生物中可见的3 -HP产生途径的生产，或用于在正常情况下不合成3-HP的微生物中提供充分的酶促转化因而使3-HP被生物生产。产生这样的遗传修饰的微生物的方法也被描述并且是本发明的该方面的一部分。本发明的另ー个方面涉及遗传修饰的微生物，所述微生物包含至少ー种来自3HPTGC的分支酸、苏氨酸/同型半胱氨酸、多胺合成，赖氨酸合成以及核苷合成部分的两种或更多种的遗传修饰。多种组合的非限制性实施例例示了本发明的该方面的优点。另外的遗传修饰涉及所述3HPTGC的其它部分。通过适当的遗传修饰可向一些遗传修饰的微生物添加生物生产3-HP的能力。鉴定遗传修饰以提供获得提高的3-HP耐受性的微生物的方法以及通过这些方法制备的微生物与本发明的这一方面相关。本发明的另一方面涉及能够产生3-羟基丙酸(“3-HP”)的遗传修饰的微生物，所述微生物包含3HPTGC的至少ー种遗传修饰，该修饰在微生物的3HPTGC的一个或多个酶促转化步骤中提高了酶促转化，并且其中所述至少一种遗传修饰使所述遗传修饰的微生物的3-HP耐受性提高超过缺乏该遗传修饰的对照微生物的3-HP耐受性。产生这样的遗传修饰的微生物的方法也被描述并且是本发明的该方面的一部分。本发明的另一方面涉及遗传修饰的微生物，其包含对3HPTGC的特定遗传修饰的多种核心集(core set)。在各个实施方案中，本方面可另外包含来自于所述3HPTGC的分支酸、苏氨酸/同型半胱氨酸、多胺合成、赖氨酸合成以及核苷酸合成部分中的ー种或多种或者两种或更多种的至少ー种遗传修饰。产生这样的经遗传修饰的微生物的方法也被描述并且是本发明的该方面的一部分。此外，本发明包括了用于改善微生物对3-HP耐受性的方法，其可在具有3-HP生产能力(无论后者能力是天然存在的还是通过遗传修饰而增强和/或引入的)的微生物中。此外，本发明的另一方面涉及向微生物培养中提供了ー种或多种补充物以提高该微生物对3-HP的有效耐受性，所述补充物是3HPTGC的底物(即反应物)和/或产物(本文统称为“产物”，注意除起始步骤之外的所有步骤中的底物亦为3HPTGC的产物)。本发明的另ー个方面涉及用以引入编码本文称为IroK的短多肽的遗传元件的遗传修饰。编码这ー短多肽的遗传元件的引入被显示为在微需氧条件下改善大肠杆菌的3-HP耐受性。该遗传修饰可以与本发明的其它遗传修饰和/或补充物添加进行组合。关于根据本发明的教导而制备3-HP的方法以及制备3-HP的遗传修饰的微生物，可对微生物提供一种或多种遗传修饰以提高对3-HP的耐受性。S卩，SEQ ID NO :001至189被并入本部分，SEQ ID NO :190至603被提供作为核酸序列(基因，DNA)以及编码大肠杆菌3HPTGC的氨基酸序列(蛋白质)，并且SEQ ID NO :604至766被提供作为酿酒酵母3HPTGC的核酸序列的序列。更进一歩，用于提高碳酸酐酶(如，大肠杆菌cynT，DNA为SEQ ID NO :337并且蛋白质序列为SEQ ID NO :544)表达的特定遗传修饰可以以双功能方式发挥作用以有利地同时改善3-HP产生和3-HP耐受。当丙ニ酰-CoA还原酶被提供用于3-HP产生时尤为如此。图I显示了包含双功能丙ニ酰-CoA还原酶的从丙ニ酰-CoA到3-HP的产生途径，以及本文所述的其它酶促转化和途径。碳酸酐酶并不意图是限制性的。例如，在大肠杆菌中被不同地命名为can和yadF的碳酸酐酶2是已知的，并且在本发明的实施方案中的遗传修饰的使用可利用该基因或其它基因以及它们所编码的酶。can的序列被提供为SEQ ID NO767 (EG12319 can" carbonic anhydrase 2 monomer" (comp lement(142670. . 142008))Escherichia coli K-12 substr. MG1655)和 SEQ ID NO :768 (EG12319-M0N0MER carbonicanhydrase 2 monomer(complement(142670. . 142008))Escherichia coli K-12 substr.MG1655)。另外，应当了解用于提高3-HP耐受性的遗传修饰可根据对3HPTGC特定相应部分所进行的遗传修饰而被进ー步分类。例如，可对编码催化所述3HPTGC的特定部分的酶促反应的酶的多核苷酸进行遗传修饰并且该遗传修饰由此预期分别提高芳香氨基酸(酪氨酸和苯丙氨酸)、色氨酸(Trp)、泛醌-8、甲基萘醌、肠菌素、四氢叶酸(參见A组表单(以及其输入信息)的相应酶促转化)、一种或多种极性不带电氨基酸(甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸)、异亮氨酸、甲硫氨酸(參见B组表单(以及其输入信息)的相应酶促转化)、谷氨酰胺、精氨酸、腐胺、亚精胺、氨基丙基尸胺(參见C组表单(以及其输入信息)的相应酶促转化)、尸胺(參见D组表单(以及其输入信息)的酶促转化)、肌醇-5-磷酸、黄苷-5-磷酸、腺苷酸基-琥珀酸、乳清苷-5'-磷酸以及可从此获得的任ー种单_、ニ-和三-磷酸核苷(即，腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷)(參见E组表单(以及其输入信息)的相应酶促转化)、谷氨酸、琥珀酸、琥珀酸半醛、草酰こ酸和天冬氨酸(參见F组表单的相应酶促转化，包括沿虚线显示的反应)的产量，由此而使3-HP耐受性由于这些遗传修饰而提高。可选择任意部分或亚部分用于遗传修饰以在选择的微生物种中提高对3-HP的耐受性。如所说明的，在各个实施方案中，在本部分中所述的遗传修饰的组合结合本发明涉及对脂肪酸合成酶系统的调控的方面而实施。VIIIA. SCLAES 技术根据公开于2010年I月28日的WO 2010/011874中所述，为获得遗传信息，通过使用SCALES技术对来自基因组文库群的克隆的适合度(fitness)进行评估而获得初始3-HP相关适合度数据。这些克隆通过3-HP的升高浓度而施加的选择性环境(其被证明是可靠的3-HP耐受性测试)中生长。更特别地，为获得可用于鉴别与提高的3-HP耐受性相关的遗传元件的数据，通过本领域的技术人员所知的方法产生了五个代表性大肠杆菌K12基因组文库的起始群。这五个文库分别包含大肠杆菌K12遗传物质的500、1000、2000、4000、8000个碱基对(“bp”)的插入序列。基本包含完整大肠杆菌K12基因组的这些文库各自分别地转化进入MACHItm-TI 大肠杆菌细胞中并且培养至与微需氧条件相对应的中指数期(0D_ 0.2)。批转移次数是可变的并且根据所需进行调整以避免营养物受限的选择环境(即，避免培养物进入静止期)。尽管并非意味着限制替代性信息途径，在存在3-HP情况下进行的选择在60小时期间在8个系列转移批次上以3-HP的下降梯度进行。更特别地，所述3-HP浓度对于系列批次I和2为20g 3-HP/L，对于系列批次3和4为15g 3-HP/L，对于系列批次5和6为IOg 3-HP/L,对于系列批次7和8为5g 3-HP/L。对于系列批次7和8，培养基在培养物接近静止期时进行更换以避免营养物限制。在选择中各个批次达到顶峰期间和顶峰处提取样品并且进行识别信号強度的微阵列分析。在阵列和数据分析之前的用于制备文库、转化细胞培养物的各标准实验室方法以及其它用于SCALES技术的标准实验室方法在本领域是为人所熟知的，例如受到Sambrook 和 Russell, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2001 年第三版(第1-3 卷)，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.(此后称为Sambrook和Russell, 2001年)中教导的方法支持。各个方法的方面也被更为详尽地描述于实施例中以及SCALES技术的专利申请，2005年9月20日提交的题为“Mix ed-LibraryParallel Gene Mapping Quantitation Microarray Technique for Genome WideIdentification of Trait Conferring Genes” 的美国专利公开第 2006/0084098A1 号中(此后称为“SCALES技木”)，其以引用的方式并入本文用于教导该技术的额外细节。微阵列技术在该领域中也是为人所熟知的(參见，例如〈〈www. affymetrix.com )。为获得关于在对3-HP的不同暴露期间哪ー克隆更具优势的数据，Affymetrix大肠杆菌反义基因芯片阵列(Affymetrix, Santa Clara, CA)根据来自Affymetrix的大肠杆菌表达方案进行了操作和扫描以生成affymetrix. cel文件。在对3-HP的给定暴露后出现的强微阵列信号表明通过包含基因序列的质粒引入的这一基因序列赋予了 3-HP耐受性。可通过本领域已知的大量微阵列分析而鉴定这些克隆。另外，出于应用于美国的以引用的方式并入的目的，“A genomics approach toimprove the analysis and design of strain selections,，，T. E. Warnecke辜MetabolicEngineering 10(2008) 154-165页中表明SCALES适合度数据与3_HP的耐受性提高相关联并可被用作3-HP的耐受性提高的代表(surrogate)的额外的具体教导被以引用的方式并入本文。这ー结论基于受试者工作特征(ROC)曲线的标准应用。ROC分析在医学诊断领域被常规地用于评估诊断测试与疾病的实际存在与否之间的关联。目前全世界在医疗应用中使用的在ROC分析中表现良好的诊断测试被常规地用于鉴定疾病的存在与否。该分析适应于评估基于不同微生物生长的敏感性和特异性的选择，从而产生作为3-HP耐受性的可靠测试的适合度值。特别地，使用具有趋降水平3-HP的系列批培养物的基于生长的选择被确信认为用于3-HP耐受性的敏感性和特异性测试。因此，在该选择中具有高于声价十倍截止值O的适合度量度的克隆被鉴定为产生对3-HP耐受性的克隆。下表列出ー些显示为具有升高的适合度值的基因，这在本此表示赋予对3-HP的耐受性。表3 =SCALES适合度数据
基因累计适合度I I基因I累计适合度基因累计适合度
aceE 11.2cysM 26.63ilvC2.61aceF8. 39eno6. 98ilvDI. 6
ackA2. 36entAI. 58ilvE0.94
acnA3. 58entB0.93ilvHI. 18
acnB3. 18entC1.26ilvlI. 77
adhE3.68entDIilvM1.0权利要求
1.一种用于制备基于丙烯酸的消费产品的方法，所述方法包括 i)将碳源与微生物细胞培养物结合用以制备3-羟基丙酸，其中 a)所述细胞培养物包含脂肪酸合成酶的抑制剂或所述微生物经遗传修饰导致所述生物体脂肪酸合成酶途径中降低的酶活性；或 b)其中所述微生物通过引入编码具有单功能丙ニ酰-CoA还原酶活性的多肽的外源核酸序列进行遗传修饰导致所述生物体的丙ニ酰-CoA还原酶(mcr)途径中提高的酶活性；或 c)所述3-羟基丙酸以高于O.05克每克微生物细胞干重每小时的単位生产率或以高于O. 50克每升每小时的容积生产率产生； )将所述3-羟基丙酸转化成为丙烯酸；以及 iii)将所述丙烯酸加工成为消费产品。
2.根据权利要求I所述的方法，其中所述碳源具有约I.OX 10_14或更高的碳14与碳12比率。
3.根据权利要求I所述的方法，其中所述碳源主要是葡萄糖、蔗糖、果糖、右旋糖、乳糖或其组合。
4.根据权利要求I所述的方法，其中所述碳源是低于50%的甘油。
5.根据权利要求I所述的方法，其中所述细胞培养物包含脂肪酸合成酶的抑制剂或所述微生物经遗传修饰导致所述生物体脂肪酸合成酶途径中降低的酶活性。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述脂肪酸合成酶抑制剂选自硫乳霉素、三氯生、浅蓝菌素、噻吩并ニ氮杂硼杂因、异烟肼及其类似物。
7.根据权利要求I所述的方法，其中所述微生物通过引入编码具有单功能丙ニ酰-CoA还原酶活性的多肽的外源核酸序列进行遗传修饰导致所述生物体的丙ニ酰-CoA还原酶(mcr)途径中提高的酶活性。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述单功能丙ニ酰-CoA还原酶是非NADPH依赖的。
9.根据权利要求I所述的方法，其中以高于O.05克每克微生物细胞干重每小时的单位生产率或以高于O. 05克每升每小时的容积生产率制备所述3-羟基丙酸。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述细胞培养物包含经遗传修饰的微生物。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述经遗传修饰的微生物可经修饰以具有选自以下的性状所述生物体的脂肪酸合成酶途径中降低的酶活性、所述生物体的丙ニ酰-CoA还原酶途径中提高的酶活性、对3-羟基丙酸提高的耐受性、所述生物体的NADPH依赖性转氢酶途径中提高的酶活性、提高的细胞内重碳酸盐水平、所述生物体的こ酰CoA羧化酶途径中提高的酶活性及其组合。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述经遗传修饰的微生物经修饰导致所述生物体脂肪酸合成酶途径中降低的酶活性。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述降低的酶活性是选自以下的酶的酶活性降低β -酮脂酰基-ACP还原酶、3-羟脂酰CoA脱水酶、烯酰基-ACP还原酶和硫酯酶。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述生物体的脂肪酸合成酶途径中所述降低的酶活性通过引入编码诱导型启动子的异源核酸序列而产生，所述启动子可操作地连接于编码所述脂肪酸合成酶途径中的酶或其同源物的序列，或者通过引入编码所述脂肪酸合成酶途径中具有降低活性的酶或其同源物的异源核酸序列而产生。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述脂肪酸合成酶途径中的酶或其同源物是具有温度敏感性β -酮脂酰基-ACP还原酶或温度敏感性烯酰基-ACP还原酶活性的多肽。
16.根据权利要求11所述的方法，其中经遗传修饰的微生物经修饰导致所述生物体丙ニ酰-CoA还原酶途径中提高的酶活性。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述丙ニ酰-CoA还原酶(mcr)途径中的酶活性的所述提高通过弓I入编码具有双功能丙ニ酰-CoA还原酶活性或单功能丙ニ酰-CoA还原酶活性的多肽的异源核酸序列而产生。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述异源核酸序列选自与选自SEQIDNO. 780-789的序列具有至少70%同源性的序列。
19.根据权利要求11所述的方法，其中所述经遗传修饰的微生物经修饰导致对3-羟基丙酸的提高的耐受性。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述对3-羟基丙酸耐受性的提高发生于3-HP耐受发生复合体(3HPTGC)复合物的一种或多种组分中，或者其中所述对3-羟基丙酸耐受性的提高由提供所述3HPTGC的A组和B组各自的至少ー种遗传修饰而导致。
21.根据权利要求20所述的方法,其中所述ー种或多种组分选自CynS、CynT>AroG>SpeD、SpeE、SpeF、ThrA、AscU CysM、IroK、IlvA 及其同源物。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述修饰是对ー种或多种3HPTGC阻遏基因的破坏。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述阻遏基因选自tyrR、trpR、metj、purR、lysR、nrdR及其同源物。
24.根据权利要求11所述的方法，其中所述生物体NADPH依赖性转氢酶途径中提高的酶活性通过引入编码与选自SEQ ID NO. 776或778的序列具有至少70%同源性的多肽的异源核酸序列而产生。
25.根据权利要求11所述的方法，其中所述提高的细胞内重碳酸盐水平通过引入编码具有氰酸酶和/或碳酸酐酶活性的多肽的异源核酸序列而产生。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述异源核酸序列选自与选自SEQID NO. 337的序列具有至少70%同源性的序列。
27.根据权利要求11所述的方法，其中所述生物体こ酰CoA羧化酶途径中提高的酶活性通过引入编码与选自SEQ ID NO. 768-775的序列具有至少70%同源性的多肽的异源核酸序列而产生。
28.根据权利要求11所述的方法，其中所述经遗传修饰的细菌被进ー步修饰以降低乳酸脱氢酶、磷酸こ酰转移酶、丙酮酸氧化酶或丙酮酸甲酸裂解酶及其组合的活性。
29.根据权利要求I所述的方法，其中在步骤(i)后，所述方法进ー步包括通过在存在叔胺的情况下将3-羟基丙酸从所述培养物中提取而将3-羟基丙酸从所述细胞培养物中分离和/或纯化。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述3-羟基丙酸以高于O.05克每克微生物细胞干重每小时的単位生产率或以高于O. 50克每升每小时的容积生产率产生。
31.根据权利要求I所述的方法，其中所述消费产品选自尿布、地毯、涂料、粘合剂和丙烯酸玻璃。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述消费产品是尿布。
33.生物产生的3-羟基丙酸，其中所述3-羟基丙酸根据权利要求1-32中任一项产生。
34.根据权利要求33所述的3-羟基丙酸，其中所述3-羟基丙酸基本上不含化学催化剂。
35.根据权利要求34所述的3-羟基丙酸，其中所述化学催化剂是基于钥和/或钒的催化剂。
36.根据权利要求33所述的3-羟基丙酸，其中所述3-羟基丙酸具有约1.0X10_14或更高的碳14与碳12比率。
37.根据权利要求33所述的3-羟基丙酸，其中所述3-羟基丙酸包含低于约10%的源自石油的碳。
38.根据权利要求33所述的3-羟基丙酸，其中所述3-羟基丙酸包含与其制备方法相关的残留量的有机物质。
39.根据权利要求38所述的3-羟基丙酸，其中所述3-羟基丙酸包含其量介于所述3-羟基丙酸的百万分之I与百万分之1，000之间的残留量有机物质。
40.一种丙烯酸，其由根据权利要求33-39中任一项的3-羟基丙酸制备。
41.一种聚合物，其使用根据权利要求40的丙烯酸制备。
42.一种消费产品，其使用根据权利要求40的丙烯酸制备。
43.根据权利要求42所述的消费产品，其中所述消费产品选自尿布、地毯、涂料、粘合剂和丙烯酸玻璃。
44.根据权利要求43所述的消费产品，其中所述消费产品是尿布。
45.一种用于生物生产权利要求40的丙烯酸的系统，所述系统包括 对生物质进行糖化的罐； 用于将糖化产物输送至发酵罐的管线，任选地经过预发酵罐输送； 适用于微生物细胞培养的发酵罐； 用于从所述发酵罐将内容物排放至提取和/或分离容器的管线； 适用于将3-羟基丙酸从细胞培养物废料中移除的提取和/或分离容器； 用于将3-羟基丙酸转移至脱水容器中的管线；以及 适用于将3-羟基丙酸转化成为丙烯酸的脱水容器。
46.根据权利要求45所述的系统，其进一步包括一个或多个预发酵罐、蒸馏塔、离心容器、反萃取柱、混合容器或其组合。
47.根据权利要求45所述的系统，其中所述系统具有至少每年I吨丙烯酸的最低产能。
48.一种经遗传修饰的微生物，其中所述微生物能够以选自高于O. 05g/gDCW-hr、O. 08g/gDCff-hr> 高于 O. Ig/gDCff-hr> 高于 O. 13g/gDCff-hr> 高于 0. 15g/gDCff-hr> 高于O. 175g/gDCW-hr、高于 O. 2g/gDCW_hr、高于 O. 25g/gDCW_hr、高于 O. 3g/gDCW_hr、高于O. 35g/gDCW-hr、高于 O. 4g/gDCW_hr、高于 O. 45g/gDCW_hr 或高于 O. 5g/gDCW_hr 的速率的比速率产生3-羟基丙酸。
49.根据权利要求48所述的经遗传修饰的微生物，所述微生物包含提高丙二酰-CoA还原酶活性和乙酰CoA羧化酶活性的遗传修饰，和降低烯酰基-ACP还原酶活性、乳酸脱氢酶活性和乙酸激酶活性的遗传修饰。
50.根据权利要求48所述的经遗传修饰的微生物，所述微生物包含提高丙二酰-CoA还原酶活性和乙酰CoA羧化酶活性的遗传修饰，和降低烯酰基-ACP还原酶活性、乳酸脱氢酶活性和乙酰磷酸转移酶活性的遗传修饰。
51.根据权利要求48所述的经遗传修饰的微生物，所述微生物包含提高丙二酰-CoA还原酶活性和乙酰CoA羧化酶活性的遗传修饰，和降低烯酰基-ACP还原酶活性、乳酸脱氢酶活性、乙酸激酶活性和乙酰磷酸转移酶活性的遗传修饰。
52.根据权利要求48所述的经遗传修饰的微生物，所述微生物包含提高丙二酰-CoA还原酶活性和乙酰CoA羧化酶活性的遗传修饰，和降低烯酰基-ACP还原酶活性、乳酸脱氢酶活性和丙酮酸甲酸裂解酶活性的遗传修饰。
53.根据权利要求48所述的经遗传修饰的微生物，所述微生物包含提高丙二酰-CoA还原酶活性和乙酰CoA羧化酶活性的遗传修饰，和降低烯酰基-ACP还原酶活性、乳酸脱氢酶活性和丙酮酸氧化酶活性的遗传修饰。
54.根据权利要求48所述的经遗传修饰的微生物，所述微生物包含提高丙二酰-CoA还原酶活性和乙酰CoA羧化酶活性的遗传修饰，和降低烯酰基-ACP还原酶活性、乳酸脱氢酶活性和甲基乙二醛合成酶活性的遗传修饰。
55.根据权利要求48所述的经遗传修饰的微生物，所述微生物包含提高丙二酰-CoA还原酶活性和乙酰CoA羧化酶活性的遗传修饰，和提高β -酮脂酰基-ACP合成酶活性、乳酸脱氢酶活性和甲基乙二醛合成酶活性的遗传修饰。
56.根据权利要求48所述的经遗传修饰的微生物，所述微生物包含提高丙二酰-CoA还原酶活性和乙酰CoA羧化酶活性的遗传修饰，和降低烯酰基-ACP还原酶活性、鸟苷3' - 二磷酸5'-三磷酸合成酶活性和鸟苷3' - 二磷酸5' -二磷酸合成酶活性的遗传修饰。
57.根据权利要求48-56中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中进行了提高NADH/NADPH转氢酶活性的进一步的遗传修饰。
58.根据权利要求57所述的经遗传修饰的微生物，其中所述转氢酶活性是可溶的。
59.根据权利要求57所述的经遗传修饰的微生物，其中所述转氢酶活性是膜结合的。
60.根据权利要求48-59中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中进行了提高氰酸酶活性的进一步的遗传修饰。
61.根据权利要求48-60中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中进行了提高碳酸酐酶活性的进一步的遗传修饰。
62.根据权利要求48-60中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中进行了提高丙酮酸脱氢酶活性的进一步的遗传修饰。
63.据权利要求48-62中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中进行了降低鸟苷.3' - 二磷酸5'-三磷酸合成酶活性和鸟苷3' - 二磷酸5' -二磷酸合成酶活性的进一步的遗传修饰。
64.根据权利要求48-63中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中进行了提高通气环境中NADH/NAD+比率的遗传修饰。
65.根据权利要求48-64中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中进行了降低β-酮脂酰基-ACP合成酶活性的遗传修饰。
66.根据权利要求48-65中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中进行了降低3-羟基丙酸还原酶活性的遗传修饰。
67.根据权利要求48-66中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中进行了降低NAD+依赖性3-羟基丙酸脱氢酶活性的遗传修饰。
68.根据权利要求48-67中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中进行了降低NAD+依赖性3-羟基丙酸脱氢酶活性的遗传修饰。
69.根据权利要求48-68中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中进行了提高对3-羟基丙酸的耐受性的遗传修饰。
70.根据权利要求48-69中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中导致对3-羟基丙酸的耐受性提高的所述遗传修饰提高了 3-HP耐受发生复合体中任何酶的活性。
71.根据权利要求69-70中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中导致对3-羟基丙酸的耐受性提高的所述遗传修饰提高了丙酮酸脱氢酶活性。
72.根据权利要求69-70中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中导致对3-羟基丙酸的耐受性提高的所述遗传修饰提高了氰酸酶活性。
73.根据权利要求69-70中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中导致对3-羟基丙酸的耐受性提高的所述遗传修饰提高了碳酸酐酶活性。
74.根据权利要求69-70中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中导致对3-羟基丙酸的耐受性提高的所述遗传修饰提高了天冬氨酸激酶活性。
75.根据权利要求69-70中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中导致对3-羟基丙酸的耐受性提高的所述遗传修饰提高了苏氨酸脱水酶活性。
76.根据权利要求69-70中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中导致对3-羟基丙酸的耐受性提高的所述遗传修饰提高了 2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶活性。
77.根据权利要求69-70中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中导致对3-羟基丙酸的耐受性提高的所述遗传修饰提高了半胱氨酸合成酶活性。
78.根据权利要求69-70中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中导致对3-羟基丙酸的耐受性提高的所述遗传修饰提高了核糖-磷酸ニ磷酸激酶活性。
79.根据权利要求69-70中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中导致对3-羟基丙酸的耐受性提高的所述遗传修饰提高了核糖核苷-ニ磷酸还原酶活性。
80.根据权利要求69-70中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中导致对3-羟基丙酸的耐受性提高的所述遗传修饰提高了 L-半胱氨酸脱巯基酶活性。
81.根据权利要求69-70中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中导致对3-羟基丙酸的耐受性提高的所述遗传修饰提高了赖氨酸脱羧酶活性，或者其中导致对3-羟基丙酸的耐受性提高的所述遗传修饰提高了同型半胱氨酸甲基转移酶活性。
82.根据权利要求69-70中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中导致对3-羟基丙酸的耐受性提高的所述遗传修饰提高了ニ氢叶酸还原酶活性。
83.根据权利要求69-70中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中导致对3-羟基丙酸的耐受性提高的所述遗传修饰提高了 N-こ酰谷氨酰磷酸还原酶活性。
84.根据权利要求69-70中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中导致对3-羟基丙酸的耐受性提高的所述遗传修饰提高了こ酰谷氨酸激酶活性。
85.根据权利要求69-70中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中导致对3-羟基丙酸的耐受性提高的所述遗传修饰提高了こ酰谷氨酸激酶活性。
86.根据权利要求69-70中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中导致对3-羟基丙酸的耐受性提高的所述遗传修饰提高了精氨基琥珀酸裂解酶活性。
87.根据权利要求69-70中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中导致对3-羟基丙酸的耐受性提高的所述遗传修饰提高了こ酰鸟氨酸脱こ酰基酶活性。
88.根据权利要求69-70中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中导致对3-羟基丙酸的耐受性提高的所述遗传修饰提高了分支酸变位酶活性。
89.根据权利要求69-70中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中导致对3-羟基丙酸的耐受性提高的所述遗传修饰提高了预苯酸脱水酶活性。
90.根据权利要求69-70中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中导致对3-羟基丙酸的耐受性提高的所述遗传修饰提高了预苯酸脱氢酶活性。
91.根据权利要求69-70中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中导致对3-羟基丙酸的耐受性提高的所述遗传修饰提高了 2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶活性。
92.根据权利要求69-70中任一项所述的经遗传修饰的微生物，其中导致对3-羟基丙酸的耐受性提高的所述遗传修饰提高了 D-3-磷酸甘油酸脱氢酶活性。
93.ー种包含处于水性介质中的碳源以及根据权利要求48-92中任ー项的经遗传修饰的微生物的培养系统，其中所述经遗传修饰微生物以选自高于O. 05gDCW/L、0. lgDCW/L、高于lgDCW/L、高于5gDCW/L、高于10gDCW/L、高于15gDCW/L或高于20gDCW/L的量存在。
94.根据权利要求93所述的培养系统，其中所述水性介质的体积选自高于5mL、高于IOOmL,高于O. 5L、高于1L、高于2L、高于10L、高于250L、高于1000L、高于10，000L、高于50，000L、高于 100，000L 或高于 200，OOOL0
95.根据权利要求93-94中任一项所述的培养系统，其中所述水性介质的体积高于250L并且容纳于钢质容器中。
96.根据权利要求93-95中任一项所述的培养系统，其中所述碳源选自右旋糖、蔗糖、戊糖、多元醇、己糖、己糖和戊糖两者，及其组合。
97.根据权利要求93-96中任一项所述的培养系统，其中所述水性介质的pH低于7.5。
98.根据权利要求93-97中任一项所述的培养系统，其中所述培养系统是通气的。
99.根据权利要求98所述的培养系统，其中所述培养系统通气以具有选自以下的氧转移速度 i)高于5毫摩尔/L-hr的氧和低于200毫摩尔/L_hr的氧； ii)高于5毫摩尔/L-hr的氧和低于100毫摩尔/L_hr的氧； iii)高于5毫摩尔/L-hr的氧和低于80毫摩尔/L_hr的氧；和 iv)高于5毫摩尔/L-hr的氧和低于50毫摩尔/L_hr的氧。
100.—种由根据权利要求93-99中任一项的培养系统获得的水性培养液，其中所述水性培养液包含 i)选自闻于5g/L、闻于10g/L、闻于15g/L、闻于20g/L、闻于25g/L、闻于30g/L、闻于35g/L、闻于40g/L、闻于50g/L、闻于60g/L、闻于70g/L、闻于80g/L、闻于90g/L或闻于100g/L的3-羟基丙酸的浓度的3-羟基丙酸；以及)选自低于30g/L、低于20g/L、低于10g/L、低于5g/L、低于lg/L或低于0. 5g/L的浓度的1，3-丙ニ醇。
101.根据权利要求100的水性培养液，其中所述水性培养液包含选自低于20gDCW/L生物质、低于15gDCW/L生物质、低于10gDCW/L生物质、低于5gDCW/L生物质或低于lgDCW/L生物质的量的生物质。
102.根据权利要求100的水性培养液，其中3-HP/琥珀酸比率(g3-HP/g琥珀酸)高于3、高于10、高于30、高于60、高于100、高于150或高于200。
103.根据权利要求100的水性培养液，其中3-HP/延胡索酸比率(g3-HP/g延胡索酸)闻于3、闻于10、闻于30、闻于60、闻于100、闻于150或闻于200。
104.根据权利要求100的水性培养液，其中3-HP/甘油比率(g3-HP/g甘油)高于3、闻于10、闻于30、闻于60、闻于100、闻于150或闻于200。
105.根据权利要求100的水性培养液，其中3-HP/こ酸比率(g3-HP/gこ酸)高于.1.5、闻于3、闻于10、闻于30、闻于60、闻于100、闻于150或闻于200。
106.根据权利要求100的水性培养液，其中所述3-HP/丙氨酸比率(g3-HP/g丙氨酸)闻于3、闻于10、闻于30、闻于60、闻于100、闻于150或闻于200。
107.根据权利要求100的水性培养液，其中3-ΗΡ/β-丙氨酸比率(g 3-HP/g β -丙氨fe)闻于1.5、闻于3、闻于10、闻于30、闻于60、闻于100、闻于150或闻于200。
108.根据权利要求100的水性培养液，其中3-HP/谷氨酸比率(g3-HP/g谷氨酸)高于3、高于10、高于30、高于60、高于100、高于150或高于200。
109.根据权利要求100的水性培养液，其中3-HP/谷氨酰胺比率(g3-HP/g谷氨酰胺)闻于3、闻于10、闻于30、闻于60、闻于100、闻于150或闻于200。
110.根据权利要求100的水性培养液，其中3-HP/3-羟基丙醛比率(g3-HP/g 3-羟基丙fe)闻于1.5、闻于3、闻于10、闻于30、闻于60、闻于100、闻于150或闻于200。
111.根据权利要求100的水性培养液，其中3-ΗΡΛ，3-丙ニ醇比率(gI, 3-HP/g 1，.3_丙_■醇)闻于1.5、闻于3、闻于10、闻于30、闻于60、闻于100、闻于150或闻于200。
112.根据权利要求100的水性培养液，其中3-HP/乳酸比率(gl，3-HP/g乳酸)高于.1.5、闻于3、闻于10、闻于30、闻于60、闻于100、闻于150或闻于200。
全文摘要
本发明涉及经代谢工程改造的微生物菌株，如细菌菌株，其中对用于化学产物制备的丙二酰-CoA具有提高的利用率，所述化学产物包括3-羟基丙酸。
文档编号C12N15/74GK102695799SQ201080053692
公开日2012年9月26日 申请日期2010年9月27日 优先权日2009年9月27日
发明者M·D·林奇, R·T·吉尔, T·瓦内克-利普斯科布 申请人:Opx生物工艺学公司, 科罗拉多大学董事会法人