专利名称：T淋巴细胞组库的组合多样性作为癌症的预后标志物的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及肿瘤学中的预后领域。更确切地说，本发明目的在于在具有给定实体癌症的患者中鉴定呈现出增加的过早死亡风险的那些，尤其是从而能够给他们提供更合适的医疗护理，获得治疗性创新以及因此获得提高治愈机会或至少他们的寿命和生活质量的希望。还目的在于鉴定处于给定肿瘤疾病风险(可能没有相应的參考治疗)的一組，以评价新治疗策略的有效性并提高候选药物的受益/风险比，因此有利于它们的临床批准。
背景技术：
术语“实体癌症”涉及“实体”组织和/或器官(比如乳房或前列腺)中细胞的异常增埴，不同于白血病，其为ー种影响血液和骨髓的癌症。 在实体癌症中，乳癌是最常见的之一。这基本上是女性当中发生的癌症(在法国，在其生命当中近10%的女性发展有乳癌)。这在男性中是罕见的(100个当中I个以下乳癌)，但是更为严重，因为它往往较晚被诊断。它是女性中最常见的癌症，并且是发达国家妇科癌症中死亡率的首要原因。尽管这些癌症中的ー些(10%至15%)具有遗传性的遗传起因，85至90%的情况仍然具有未能很好了解的起因(所谓的散发或非遗传性形式)。乳癌是乳腺中恶性细胞增殖产生的团块。如果没有被检测到和治疗，这种团块可以生长并产生转移。对于乳癌可获得大量治疗，这取决于发展的阶段和患者的具体特征。各种情况必须单独处理并优化治疗。对于局部乳癌，治疗具有治疗性目的。其是基于手术、化学疗法、辐射疗法、激素疗法以及更加近期的免疫疗法的五种治疗性武器。手术是乳癌治疗性治疗中必不可少的步骤，而其它治疗一般g在降低转移或复发的风险。它们因此被指示是否有高风险以及是否假定的治疗益处是足够的，因为所有这些治疗有副作用。期望的益处必须因此与并发症的风险相权衡。对于转移性乳癌，能够提供治疗性治疗是罕见的。然而，现代的治疗通常使得有可能延长几年患者的生命。转移性乳癌的治疗首先是基于化学疗法和激素疗法。当所有位点易于接受治疗时(例如単一的肝脏或脊椎转移的情況)，可以设想通过手术或通过辐射疗法的转移性位点的治疗具有治疗性目的，或具有缓和性(palliative)目的(例如，痛苦的骨转移的辐射)。新的治疗策略，尤其是基于单克隆抗体的使用或基于免疫系统的刺激，正在以持续的步伐进行评价和开发。例如，针对Her2受体(或CerbB2)的曲妥珠单抗(赫赛汀 )，其是ー种允许激活细胞增殖途径之一的膜受体，在25%的乳癌患者中过度表达，所述患者通常预后差。赫赛汀(I)首次是用于缓和情況。在这种情况下，赫赛汀 使得有可能平均加倍这些患者的生存时间。添加到辅助化学疗法，每21天输注赫赛汀 ，为期12个月，在Her+2患者中减半复发的风险并降低约三分之一的死亡率。尽管这些进展，乳癌死亡率仍然高，特别是当到达转移性阶段吋。然而，有相当大的个体变异，生存时间范围从不到一个月至数年不等。已经研究了一些预后标志物用于确定是否患有给定实体癌症的患者具有増加的过早死亡风险。这可能会被提到的实例是血红蛋白水平，肝转移的存在，PS (体能状态定量患者的总体情况；PS因此是ー个代表这种总体情况的象征)，或者多核中性粒细胞水平(PNN) (Ray-Coquard等人，2009)以及淋巴细胞減少，尤其是由本发明的发明人所鉴定的TCD4+淋巴细胞减少(Borg等人，2004)。本发明为患有实体癌症的患者提出了ー种新的过早死亡的预后标志物，比已经描述的某些标志物更加強大，并且不依赖于已经描述的某些标志物。发明人事实上已经证明血液中T淋巴细胞的免疫多样性的减少与增加的过早死亡风险相关。每个功能T淋巴细胞具有受体(TCR)，其特异性识别有限数目的不同的抗原肽。因此，广泛的受体的组库是保卫个体免受多重感染、恶性増殖或其可能在他/她的环境中所遇到的其它侵袭性因素所需的。为此目的，免疫系统已发展出ー种组装不连续的位 于基因组中的大量V、D、J基因区段的机制。这种组装机制，称为“V (D) J重组”，从ー个细胞到另ー个细胞是独立的，并使得有可能获得编码TCR的単一基因“片段”。这种系统使得有可能，利用不太多的基因数目，产生大量不同的受体。每个细胞根据精确的规则利用基因区段的组合并获得潜在的独特的TCR链。重组的原则是基于V (D) J基因的特异性RSS序列的识别以及切除插入两个重排的基因之间的染色体区域。每个V和J基因在它的末端之一具有重组信号序列(RSS)。对于D基因，它们自己占据两端。RSS是被特异性表达于淋巴细胞的特异性重组酶RAG I和RAG II所识别的序列。这些蛋白质是重排的主要因子。一旦结合HMG (高迁移率族)蛋白质，RAG酶识别属于它们的同源域的RSS九聚体，并诱导V、D、J基因区段和七聚体之间切害わ从而产生编码端和信号端。两个编码端V和J连接之后，完成重排。这ー步骤之前是酶TdT和核酸在V-J接合处的作用。一旦重排，转录新形成的基因，然后在翻译成膜蛋白之前剪接成mRNA。有助于产生组库多祥性的四种主要机制1)组合的多祥性，其对应于V区段和J区段之间重排的第一歩，任选被D区段分开；2)接合多祥性，在重排的基因区段之间的接合处产生的；3)重排的基因V-J和V-D-J中的体细胞超变；4)蛋白质异ニ聚体TCRa XTCR^或TCR Y XTCR δ的配对多样性。在产生多祥性的第一歩，此处称为“组合的多祥性”，是基于V(D)J基因重排的原贝U。这种多样性的计算由估计可能的mVXnDXpJ组合的数目组成。这种产生多样性的第一步确定组库的幅度数量级。事实上，即使这一步仅产生不太多的组合变异性(相对于估计为IO15的理论最大组库,上千数量级的可能组合(Davis和Bjorkman, 1988)),最大组合多样性直接与最初可获得的V、D和J基因的数目有关产生多祥性的其它两个步骤呈指数级扩增ー级组库的多祥性。接合多祥性使得有可能在接触抗原肽的受体CDR3区的水平上产生很大的变异性。有助于接合多样性增加的两种机制1)第一机制是由于P核苷酸(P代表回文的)的加入，产生自重排区段的发夹的分解(Fugmann等人，2000)。产生的多祥性不像涉及末端酶脱氧核苷酸转移酶的第二机制产生的那么多；2)TdT无需基因组模板通过向各编码区段3’端随机加入核苷酸N产生相当大多样性(Bogue等人，1992)。
ニ级重排的机制有助干“保留”多祥性接合多祥性代表组库多祥性扩增中最大的因素，但是如果没有ニ级重排的机制来挽救2/3其阅读框已被打断的胸腺细胞，甚至在正向选择的步骤之前，多祥性方面的这种益处将代表生物体的重大代价。这些非生产性重排不能给出有功能的TCR蛋白质。细胞然后有可能尝试用在基因座仍可获得的V (D) J基因进行第二重排。由于受细胞影响的第一重排发生在紧挨在一起的V-J基因对之间，TRAD基因座的协同开放的性质通过允许细胞最大数目的可能机会有助于这种过程(Pasqual等人，2002)。如果这些第一重排不是生产性的，细胞有可能尝试在第二个染色体上，或使用在第一重排两侧可获得的V和J基因进行重排。因此，ニ级重排允许在第一非生产性重排之后应当已被淘汰的大量细胞的生存。当遇到抗原时，淋巴结中B淋巴细胞分化期间发生体细胞超变(HMS)。HMS位于Igs的V-J和V (D) J重排的基因的“热点基序”中(Chaudhuri等人，2003)，但也，在某些情况下，位于TCR的V-J和V (D)J重排的基因中(Kotani等人，2005)。如果淋巴细胞过度表达通常特异于B淋巴细胞的酶AID (激活诱导的胞苷脱氨酶)，那么在可变基因水平，TCR可以是HMS的靶。通常TCR不经历HMS，因为T淋巴细胞根本就不合成AID。无论如何，如果T 淋巴细胞开始表达AID，则TCR对这种酶与BCR同样敏感，由于它具有作用于其上的所有序列。总体而言，文献中描述，这种机制，目的在于增加识别抗原的机会，通过1000个因素诱导补充的多祥性。TCRa链和TCRP链之间配对产生的多样性通过TCRa链的不同组合数目乘以TCR^链的可能组合的数目进行估计。这种机制产生的多祥性直接依赖于重排中获得的一级组合的数目。实际上，如果我们检验小鼠中TCRy δ 一级组合的数目，而不考虑接合多祥性的话，结果只有40TCRS (=10V*2D*2J)X28TCRy (=7V*4J)=1120种不同的组合，而相同的计算对于TCRa β产生5.6 106种组合(计算如下102￥0*6(^0*33￥0*20 0*14113)。B淋巴细胞产生的免疫球蛋白组库的多样性是由与上述的T淋巴细胞相同的那些机制所导致的。除其它以外，免疫多祥性的測量使得以下成为可能，研究在白血病中建立免疫组库、动态平衡、參与免疫反应的T或B淋巴细胞的机制,或评价治疗或疾病尤其是肿瘤诱导的免疫缺陷，或反过来免疫系统的特异性激活。这个列表并非穷举的。淋巴细胞群的免疫组库的研究已导致若干多參数方法的发展，使得可能既测量多样性水平又鉴定某些特异性T或B克隆的存在。根据测量的多祥性的原则和“水平”下面列出免疫学家阐述的用于评价这些各种水平多祥性的某些方法。多样性V的测量-通过流式细胞术(Vanden Beemd, van Dongen 等人，2000)-通过基因组和转录组水平的Q-PCR(Fuschiotti等人,2007 ；Pasqual等人，2002)。-通过测序。⑶R3接合多样性的测量-通过]mmunoscope (Cochet 等人，1992 ；Pannetier 等人，1995 年)。-偶联至免疫扫描的Q-PCR (TcLandscape )-通过测序
-通过基因组水平的Amplicot方法(Baum和McCune,2006年)。-通过DNA 芯片(Bonarius 等人，2006)。体细胞超变的研究(HMS):-PCR/ 测序(Hamblin 等人，1999)。通过TREC切除环的减少的间接测量-通过PCR (Douek 等人，1998)。-通过Q-PCR (Pham 等人，2003)。尽管这些方法中的ー些已经证明它们在基础研究中的价值，尤其是 immunoscope (Pannetier, C. , J. Even,等人，1995)或流式细胞术(Van den Beemd, vanDongen等人，2000)，仍需要一定量的科学和技术验证来评价他们用作医学生物标志物的相关性。考虑到免疫系统的复杂性，科学家将需要偶联额外的技术方法用来解码包含于免疫组库中的并且与给定病理相关的所有信息。已描述了基于使用PCR特异性扩增某些重排的特征性核酸区段其它方法。例如，专利US 5，296，351和US 5，418，134提出了一种检测淋巴白血病或者B或T淋巴瘤的方法，其基于扩增编码免疫球蛋白和/或T受体的序列，使用“一致性”引物用于同时扩增几个V-J重排。本发明人之前已经描述了用于测量个体T和/或B淋巴细胞组库的组合多祥性的方法和试剂盒(W0 2009/095567)。在本专利申请中，发明人也将“divpenie (无对应译文)”定义为组合免疫多祥性的缺陷，并提及处于divp6nie状态中的患者増加的感染死亡率风险。在本文中，无论测量这种多祥性的水平如何(组合多祥性、接合多祥性或其它)divp6nie表示免疫多样性的缺陷。T divp6nie因此表示T淋巴细胞组库的多样性缺陷。
发明内容
在如下实验部分中所呈现的研究中，本发明人尝试当治疗患有实体癌症的患者时，尤其是在转移性阶段，确定是否divp6nie和各种待考虑的风险之间存在关系。令人惊奇地，他们发现T divpenie与过早死亡率(不一定是感染)，尤其是在转移性乳癌(实施例I)的情况下，具有強烈的直接的关联。重要的是要注意Tdivp6nie与其它已知的过早死亡率的标志物不是系统性相关的，尤其是在淋巴细胞減少中。尤其，本发明人确定，在转移性乳癌的情况下，hTRB基因座的基因的V (D)J重排的组合多样性20%以下的可能重排，是过早死亡強大的预后因素，生存的中值在6个月以下。这似乎并不是B divp6nie的情况(实施例2)。此外，与预期相反，divpenie (T或B)似乎不是ー个用于治疗原发性乳癌的化学疗法治疗的严重毒性的风险因素(结果未显示)。任何治疗之前快速鉴定具有増加的过早死亡率风险的患者对于这些患者以及对于医学研究具有重要意义，因为这意味着，尤其可以设想对这些患者进行监测，必要吋，更长的住院治疗和/或施用更少免疫抑制的治疗或施用更专门刺激他们的免疫系统的治疗。对于医学研究，使得有可能鉴定患者的同质群，对于这样的患者參考治疗将可能无效，对于这样的患者目前临床医生显得特别无力。这种群的特征代表了临床医生和制药行业对比參考治疗具有更高疗效的创新治疗的临床试验的主要挑战，从而増加新药产品注册的可能性。可以优选选择这种群用于进行临床试验来测试创新的治疗。因此，本发明首先涉及具有转移性实体癌症的个体T淋巴细胞组库的多祥性作为这种癌症发展的预后标志物的用途。尤其是，T divp6nie的情况下，这种标志物指示增加的过早死亡风险。更具体的，本发明涉及一种用于离体或体外确定患有实体癌症的患者是否具有增加的过早死亡风险，換言之，用于对患有转移性实体癌症的个体建立离体或体外预后的方法，包括以下步骤(i)在从含有所述个体的淋巴细胞的生物样本获得的核酸(例如，基因组DNA或信使RNA)的基础上，测量所述个体T淋巴细胞组库的多样性水平；(ii)与预先确定的阈值比较步骤(i)中测量的多祥性水平；(iii)据此推断，当步骤(i)中测量的多祥性水平低于预先确定的阈值的情况下， 个体具有高的过早死亡风险。本方法适合的ー个具体的实体癌症的实例是转移性阶段中的乳癌，但是基于发明人之前对淋巴细胞减少的工作(Borg等人，2004 ;Ray-Coquard等人，2009),其还可以转换到所有实体癌症，比如前列腺癌、肺癌、结肠癌、卵巣癌、sphSre ORL (无对应译文)、淋巴瘤、肉瘤等，当它们成为转移性吋。很明显，步骤(ii)中考虑的阈值可能取决于患者的临床资料(癌症的类型和阶段，以及如果适用时，年龄及其它生理參数)，本领域技术人员能够进行必要的实验，通过回顾性或前瞻性研究，确定给定类型的病理和/或患者的相关阈值。此外，“过早死亡率”的概念被称为个体类型的癌症，以及这种癌症的进展阶段(尤其是，要知道它是否是转移性的)。术语“増加的(或高的)过早死亡的风险”将用于这样的患者，在代表他/她的病理状态的群体中，当她属于生存的中值低于整个群体的生存的中值的亚群时(代表患有转移性乳癌的患者的群体的一个实例在试验部分中给出)。对于ー个给定的亚群(例如，在T diνρ ηie状态中的患者)，当这种亚群的生存的中值(代表这种亚群成员的预期寿命)统计学上显著低于整个群体的生存的中值时，将使用术语过早死亡率。在本发明的文中，T divp6nie状态中的患者的过早死亡率通常对应着比患有相同阶段相同癌症的患者群的预期寿命低两或三倍，或甚至5倍的预期寿命，而不考虑他们的免疫多祥性的水平(或，更不必说，与具有满意的淋巴细胞多祥性的患有相同阶段相同癌症的患者群相比)。因此，具有増加的过早死亡风险的个体具有显著低于用相同医学和生物评估(癌症的类型和阶段、PS、血红蛋白水平等)的个体将具有的预期寿命(通常是一半)，而不用考虑他/她的淋巴细胞多样性T，或淋巴细胞多样性T是否在指定的阈值以上(例如，40%以上)。可能影响T淋巴细胞多祥性阈值的另ー个參数是测量这种多样性的技术，在该參数以下T divp6nie构成过早死亡风险的显著标志物。事实上，如上所述，本领域技术人员有大量供他之用的技术(測序、免疫扫描、DNA芯片等)用于在各种水平上测量个体T淋巴细胞组库的多祥性。使用測量T淋巴细胞多祥性的任何技术可应用于本发明，无论其源自何种材料(gDNA、RNA等)以及无论所测量的这种多样性处于何种水平(组合多样性、接合多样性等)。如下所述在实验部分通过实验和常规的统计分析的结果的转换，将允许确定所用的替代技术的显著阈值。如下以实验方式说明的根据本发明的具体实施方式
，多祥性是在组合水平上測量的。在WO 2009/095567号之下公布的专利申请中，发明人描述了几种用于依赖靶向的基因座(TRA、TRB、TRG、TRD)测量组合多样性、所分析的重排是否有不完整、对于各基因座所分析的重排的百分比(进行不同数目的PCR)、这些重排的分析水平(检测重排的百分比，或者对所观察到的并精确地鉴定的各重排进行定量)等方法。在如下所述的实验研究的文中，通过ー种允许分析TRB基因座80%以上V (D)J重排的方法，基于仅ー个基因座TRB的V (D) J重排的分析，评价了 T淋巴细胞组库的组合多样性。此外，ー种方法构成本发明的优选实施方式，其中步骤(i )中所用的技术使得可能分析TRB基因座至少70%的V (D)J重排。尤其是，可以有优势地通过η≥2的多_η_路PCR通过测量T淋巴细胞组库的组合多祥性来应用本发明的方法，其中PCR使用至少3种引物的组合，各引物组合包括至少引物hTRBJl. 6(CTTGGTGCATGGCTATGTAATCCTG，SEQ ID NO :1)、hTRBJ2. 7 (CTCGCCCTCTGCTCAGCTTTCC, SEQ ID NO :2)以及选自 SEQ ID NOs :3 至 25 的引物的引物hTRBV。根据本发明的ー种方法，其中通过进行至少23个多-2-路PCR分析TRB基 因座，使用由引物 hTRBJl. 6 (SEQ ID NO :l)、hTRBJ2. 7 (SEQ ID NO :2)和选自 SEQ ID NO:3至25的引物(表I)的引物hTRBV组成的三重引物进行各多_2_路PCR，构成本发明的优选实施方式。表I :本发明文中可用的、杂交至TRB基因座(基因V)的引物
权利要求
1.ー种方法，其用于离体或体外建立对患有转移性实体癌症的患者的预后，包括以下步骤 (i)从源自含有所述个体的淋巴细胞的生物样本的核酸，测量所述个体T淋巴细胞组库的多祥性水平； ( )与预先确定的阈值比较步骤(i)中测量的多祥性水平； (iii)据此推断，如果步骤(i)中测量的多祥性水平低于预先确定的阈值，个体具有高的过早死亡风险。
2.根据权利要求I所述的方法，其中个体患有的癌症是乳癌。
3.根据权利要求I或权利要求2所述的方法，其中步骤(i)中，所用的核酸是基因组DNA。
4.根据权利要求I至3任一项所述的方法，其中步骤(i)中測量T淋巴细胞组库的组合多样性。
5.根据权利要求4所述的方法，其中通过使得可能分析TRA基因座或TRB基因座的至少10个V (D) J重排的方法进行所述个体的T淋巴细胞组库的组合多样性的測量。
6.根据权利要求5所述的方法，其中通过使得可能分析TRA基因座或TRB基因座的至少20个V (D) J重排的方法进行所述个体的T淋巴细胞组库的组合多样性的測量。
7.根据权利要求5或权利要求6所述的方法，其中通过使得可能分析至少70%的TRB基因座的V (D) J重排的方法进行所述个体的T淋巴细胞组库的组合多样性的測量。
8.根据权利要求5至7任一项所述的方法，其中通过η> 2的多-η-路PCR通过组合至少3种引物的手段进行T淋巴细胞组库的组合多祥性的測量，各引物的组合包括至少引物 hTRBJl. 6 (SEQ ID NO :1)、hTRBJ2. 7 (SEQ ID NO 2)以及选自 SEQ ID NOs 3 至 25 的引物的引物hTRBV。
9.根据权利要求8所述的方法，其中通过进行至少23个多-2-路PCR进行分析，进行的各多-2-路 PCR 具有由引物 hTRBJl. 6 (SEQ ID NO :1)、hTRBJ2. 7 (SEQ ID NO :2)和选自SEQ ID NOs :3至25的引物的引物hTRBV组成的三重引物。
10.根据权利要求I至9任一项所述的方法，其中生物样本是选自血、白细胞(PBMC)、胸腺、淋巴结、脾、乳房、肝、皮肤的组织的样本、肿瘤样本或生物流体(胸膜渗漏、腹水)。
11.根据权利要求I至10任一项所述的方法，其中生物样本是全血或PBMC的样本。
12.根据权利要求I至11任一项所述的方法，其中步骤(i)中，基因组DNA是从生物样本纯化的。
13.根据权利要求I至12任一项所述的方法，其中步骤(ii)中所用的阈值是这样的，步骤(i)中测量的其多祥性水平低于此阈值的患者的预期生存是患有与影响该患者的相同的转移性实体癌症的患者通常所观察到的预期生存的至少一半。
14.根据权利要求I至13任一项所述的方法，其中步骤(ii)中，阈值固定在30%的多样性，以及步骤(iii)中的解释由如下说法组成如果测量的T淋巴细胞组合多祥性的水平低于所述阈值，个体具有他/她的病理所通常观察到的一半的预期寿命。
15.根据权利要求I至13任一项所述的方法，其中步骤(ii)中，阈值固定在20%的多样性，以及步骤(iii)中的解释由如下说法组成如果测量的T淋巴细胞组合多祥性的水平低于所述阈值，个体具有比他/她的病理所通常观察到的预期寿命低2至5倍的预期寿命。
16.根据权利要求I至15任一项所述的方法，其中患者患有转移性乳癌，并且其中在20%以下的TRB基因座V (D) J重排的多祥性水平指示着6个月以下的患者预计生存。
17.根据权利要求I至16任一项所述的方法，其中通过将所述个体的T淋巴细胞组库的多祥性水平与他/她的淋巴细胞计数组合来建立预后。
18.根据权利要求I至17任一项所述的方法，其中通过将步骤(i)中测量的多祥性水平与选自淋巴细胞计数、CD4+细胞计数、血清细胞因子水平、PS (体能状态)和血红蛋白水平的一个或多个其它生物或临床參数组合来建立预后。
19.ー种方法，其用于离体或体外确定患有实体癌症的患者是否应当纳入用于测试新药产品的临床研究方案中，包括如下步骤 (i)通过采用前述权利要求任一项所述的方法确定患者是否具有増加的过早死亡风险，以及 (ii)如果患者具有増加的过早死亡风险，将他/她纳入临床研究方案。
20.根据权利要求I至19任一项所述的方法，其为了辅助医生确定是否患有实体癌症的患者应当得益于特定的出院后护理和/或预防性抗生素疗法和/或免疫刺激和/或疫苗和/或化学疗法和/或化学疗法施用的剂量学或频率的变化和/或目的在于恢复免疫防御的膳食补充。
全文摘要
本发明涉及一种使得有可能从那些受到给定实体癌症影响的当中鉴定具有增加的过早死亡风险的患者的方法。所述方法是在含有淋巴细胞的生物样本的基础上基于患者淋巴细胞多样性的离体分析。事实上，低淋巴细胞多样性涉及不良的预后。尤其是，有可能设置多样性阈值，这取决于所用的分析技术以及影响患者的癌症，该阈值以外患者寿命预期通常显著低于受到相同疾病影响的患者的寿命。
文档编号C12Q1/68GK102822351SQ201080061848
公开日2012年12月12日 申请日期2010年12月9日 优先权日2009年12月9日
发明者C·科, J·F·穆雷, C·梅内特里-耶科, N·帕斯夸尔, T·巴舍洛, M·玛努阿, J-Y·布莱 申请人:免疫技术有限公司, 贝哈里昂中心