专利名称：可控制神经突起分支位点的装置及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及采用微流控基底精确控制神经细胞生长的领域。具体而言，本发明涉及一种精确操纵神经突起分支位点和神经网络的装置及其应用方法。
背景技术：
轴突的分支对于神经细胞间的高度连接和神经系统功能的建立起着至关重要的作用。研究表明，皮层的神经分布以及脊髓靶点的建立，在很大程度上依赖于轴突的分支， 而不是初级生长锥的延伸。在神经发育过程中，轴突的分支为每ー个神经元提供了与多个靶点建立起突触联系的能力。因此精确操纵分支对于导向轴突生长，神经网络构建和神经信号的传导、整合并最终发出指令这ー过程都十分重要。目前，对轴突分支的研究多关注于刺激或者抑制轴突分支的因子等方面，已有控制神经细胞图案化的方法在轴突分支位点精确控制方面的工作开展的还较少例如在文献 1 =Hellera D A. ,Gargab V,Kelleherb K J，Leea TC,Mahbubania S, Sigworthb LA, Leea T R, Reab M A, Biomaterials, 2005, 26,883-889 ψ, Rea Μ. A ^AM 整个神经网络的生长进行了图案化的控制。他们用表面带有微结构(该微结构由宽度6微米，间隔50微米的多条直线相互交叉形成网状结构，交叉点为14X14微米的方形结构)的聚ニ甲基硅氧烷印章将层粘连蛋白的ー个具有19个氨基酸的片段ΡΑ22-2转移到了金的表面，金原子和氨基酸N-末端的硫原子形成牢固的共价键结合；然后将神经细胞悬液种植在吸附该具有19个氨基酸的片段ΡΑ22-2的基底上，神经细胞的胞体黏着于该方形结构上，突起则沿着网状结构生长。这ー方法虽然实现了神经网络的可控生长，但是没有对神经突起分支的位点进行精确控制，并且需要进行复杂的化学反应，无法用于高通量的筛选。因此，目前存在对能够精确控制神经细胞生长中分支位点和神经网络形成的装置和方法的需求。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的ー个目的是提供一种可控制神经突起分支位点的装置，所述装置可以用于精确控制神经突起位点和精确控制神经网络数量。本发明的另 ー个目的是提供所述装置的制备方法。本发明的又ー个目的是提供控制神经突起分支位点的方法，该方法采用所述装置进行。此外，本发明的目的还在于提供所述装置和方法的应
ο本发明的目的是通过以下技术方案来实现的—方面，本发明提供一种可控制神经突起分支位点的装置，包括(1)用于神经細胞黏附和生长的基底，其包含第一条带单元所述单元含有平行排列的一条或多条直线型第一条帯，其长度为 1 3厘米，宽度为2 10微米，彼此之间的间距为20-100微米；至少ー组第二条带单元所述单元含有与第一条带单元中的第一条带相交但不重合的第二条带，所述第二条带包括一条中间条带，以及位于所述中间条带左侧和/或右侧的一条或多条侧条帯，并且该侧条带与中间条带不相交；第二条带的长度为1 3厘米，宽度为100 500微米，并且该中间条带和侧条带的最接近部分的间距为500微米 2厘米；所述基底的第一条带和第二条带上分別含有促进神经細胞黏附的物质，所述物质独立地选自层粘连蛋白、纤维结合蛋白、多聚赖氨酸和/或其他促进神经細胞黏附的物质中的ー种或多种；(2)紧密贴附于所述基底上的印章所述印章的贴附表面具有至少ー个凹槽单元，所述单元包括一条中间凹槽和位于所述中间凹槽左侧和/或右侧的一条或多条侧凹槽，该侧凹槽与中间凹槽不相交，并且中间凹槽和侧凹槽与基底上第二条带中的中间条带和侧条带分別完全相对应吻合；该中间凹槽和侧凹槽的ー个或两个槽端处连接了与相应凹槽相通的孔道，从而可以使神经细胞从印章上的孔道进入并黏附于所述基底上的第二条带上；优选地，所述印章由聚ニ甲基硅氧烷制成。优选地，在本发明的所述装置中，所述第二条带单元的中间条带为直线型中间条帯，所述侧条带为折线型侧条带，该折线型侧条带的中间段与该直线型中间条带不相交，其它段分別向远离该直线型中间条带的方向傾斜；所述印章上与第二条带的中间条带相对应吻合的中间凹槽为直线型中间凹槽，和第二条带的侧条带相对应吻合的侧凹槽为折线型侧凹槽，该折线型侧凹槽的中间段和直线型中间凹槽不相交，其它段分別向远离该直线型中间凹槽的方向傾斜。优选地，在所述装置中，所述第一条带的长度优选为2厘米；宽度优选为5微米； 彼此之间的间距优选为50 100微米。优选地，在所述装置中，所述第二条带的长度优选为1. 5 2厘米；宽度优选为 200 300微米；其中中间条带和侧条带的最接近部分的间距优选为500微米 1厘米。另ー方面，本发明提供ー种制备所述装置的方法，包括(1)制备第一印章选取适合材料制成ー个印章作为第一印章，使该第一印章表面具有多条平行排列的直线型凸帯，其长度为1 3厘米，宽度为2 10微米，并且凸带的间距为20-100微米；(2)制备第二印章选取适合材料制成ー个印章作为第二印章，使该第二印章的表面具有至少ー组凹槽单元，其包括一条中间凹槽和位于该中间凹槽左侧和/或右侧的一条或多条侧凹槽，该侧凹槽与中间凹槽不相交，该中间凹槽和侧凹槽的长度为1 3厘米，宽度为100 500微米，并且该中间凹槽和侧凹槽的最接近部分的间距为500微米-2厘米；此外，该中间凹槽和侧凹槽的一个或两个槽端处连接了与相应凹槽相通的孔道通向该印章外；(3)制备基底选取适合培养神经細胞的基底，例如細胞培养皿中或玻璃的表面，将第一印章具有凸带的面上蘸上含有促进神经细胞黏附物质的溶液并干燥，再将其表面朝下置于该基底上，一定时间后，优选5 10分钟后揭去该印章，该第一印章上促进神经細胞黏附物质即转移到基底表面形成第一条带；将步骤O)中制备的第二印章表面朝下紧密贴附于上述具有第一条带的基底上，使该第二印章上的中间凹槽和侧凹槽与基底上的第一条带相交不重合；将所述含有促进神经细胞黏附物质的溶液通入第二印章上与凹槽相通的孔道，使促进神经細胞黏附的物质在所述基底上形成第二条带；优选地，所述第一印章和第二印章由聚ニ甲基硅氧烷制成。优选地，在所述方法的步骤(1)中，所述第一印章表面的直线型凸带的长度优选为2厘米；宽度优选为5微米；彼此之间的间距优选为50 100微米。优选地，在所述方法的步骤O)中，所述第二印章表面的中间凹槽为直线型中间凹槽，所述侧凹槽为折线型侧凹槽，该折线型侧凹槽的中间段和直线型中间凹槽不相交，其它段分別向远离该直线型中间凹槽的方向傾斜。优选地，在所述方法的步骤O)中，所述第二印章表面的凹槽长度优选为1. 5 2 厘米；宽度优选为200 300微米；其中中间凹槽和侧凹槽的最接近部分的间距优选为500 微米 1厘米。优选地，在所述方法的步骤(3)中，在所述用于制备第一条带和第二条带的含促进神经细胞黏附物质的溶液中，所含有的促进神经細胞黏附物质分别独立地选自层粘连蛋白、纤维结合蛋白、多聚赖氨酸和/或其他促进神经細胞的物质中的一种或多种，所述物质的浓度优选为20 200微克/毫升。再一方面，本发明还提供ー种控制神经突起分支位点的方法，所述方法包括以下步骤制备动物神经细胞悬浮液，通过上述装置中印章上的孔道进入该装置，然后将装置在适合所述细胞生长的条件下培养，当細胞黏附于所述基底的第二条带上后，去除该印章，加入神经培养液，在适合的培养条件下进行培养；优选地，所述神经培养液包含86%基础神经培养液，10%胎牛血清，2% B27添加剤，N2添加剤，1 %谷氨酸，所述培养条件为 37°C,5% C02。优选地，所述神经细胞为中枢神经細胞。此外，本发明还提供上述装置在控制神经突起分支位点和/或神经网络形成中的应用。以下是本发明的详细描述本发明的目的在于克服现有技术在对神经细胞的生长进行图案化控制吋，只能对整个神经网络进行控制，无法精确控制分支位点和神经网络形成的缺点，以及现有技术中所涉及装置的制作エ艺较为复杂，重复性不高的缺陷，从而提供一种简单易操作的控制神经分支位点和神经网络形成的装置和方法，以便于研究不同基质对神经突起分支能力和网络形成的影响，进而筛选出不同的分子或者化学信号，为神经突起分支的研究提供ー个便捷的平台。具体地，本发明提供ー种可以控制神经突起分支位点的装置，包括-基底，所述基底上表面附着两种促进神经細胞黏附的条带第一条带单元和第 ニ条带单元；第一条带单元包括多条平行排列的宽度为5微米的条带，相邻两条带的间距为50-100微米；第二条带单元由一条直线型中间条带和位于直线型中间条带左边或右边的一条折线型侧条带组成，这些条带与第一条带相交不重合，并且该折线型侧条带的中间段与该直线型中间条带不相交，其它段分別向远离该直线型中间条带的方向傾斜，两条带长度为1-3厘米，宽度为100-500微米，最接近部分的间距为500微米-2厘米；此外，第一条带和第二条带上分別含有促进神经細胞黏附的物质，所述物质独立地选自层粘连蛋白、 纤维结合蛋白、多聚赖氨酸和/或其它ー些促进神经細胞黏附的物质的ー种或多种。-聚ニ甲基硅氧烷印章，该聚ニ甲基硅氧烷印章下表面具有ー组微凹槽单元，所述微凹槽単元包括一条直线型中间凹槽；设置于所述直线型中间凹槽左侧或右侧的一条折线型侧凹槽；所述折线型侧凹槽的中间段与所述直线型中间凹槽不相交，所述折线型侧凹槽中间段之外的两端段分别向远离直线型中间凹槽的方向傾斜；所述直线型中间凹槽和所述折线型侧凹槽的槽端处分别设有与相应凹槽相通的垂直孔道；所述直线型中间凹槽和所述折线型侧凹槽的长度均在1-3厘米范围内，宽度均为100-500微米；两相邻凹槽最接近部分的壁间间距为500微米-2厘米；所述聚ニ甲基硅氧烷印章下表面紧密地贴覆于所述基底附有促进神经細胞黏附物质的条带表面上，其直线型中间凹槽和折线型侧凹槽与基底表面上的第一条带相交不重合，与第二条带中的直线型中间条带和折线型侧条带分別完全相对吻合。本发明还提供ー种精确控制神经突起分支位点的方法，包括以下步骤1)制备基底(1):使用光刻技术(Whitesides GM, Ostuni E, Takayama S, Jiang XY, IngberDE, Annu Rev Biomed Eng. 2001 ；3 :3；35_373.))，在ー硅片上刻制ー组微结构单元；该微结构单元由多条平行排列的直线型凹槽组成，所述直线型凹槽宽度为5微米，所述直线型凹槽的间距为50-100微米；以该具有微结构単元的硅片作模板，用聚ニ甲基硅氧烷对其进行翻摸，得到聚ニ 甲基硅氧烷第一印章，从而该聚ニ甲基硅氧烷第一印章的表面上具有了多条平行排列的凸型条带，其宽度为5微米，间距为50-100微米将所述聚ニ甲基硅氧烷第一印章具有凸型条带的面上蘸上含促进神经細胞黏附物质的溶液井吹干；再将其具有凸型条带的面朝下垂直置于细胞培养皿或玻璃表面，5-10 分钟后揭去该聚ニ甲基硅氧烷第一印章，促进神经细胞黏附物质从该聚ニ甲基硅氧烷印章的凸型条带上转移到細胞培养皿或玻璃表面对应的部位，在細胞培养皿或玻璃表面上形成第一条帯；2)制备聚ニ甲基硅氧烷第二印章所制备的聚ニ甲基硅氧烷第二印章的下表面具有至少ー组微凹槽単元，所述微凹槽单元包括一条直线型中间凹槽；设置于所述直线型中间凹槽左侧或右侧的至少一条折线型侧凹槽；所述折线型侧凹槽的中间段与所述直线型中间凹槽不相交，所述折线型侧凹槽中间段之外的两端段分别向远离直线型中间凹槽的方向傾斜；所述直线型中间凹槽和所述折线型侧凹槽的槽端处分别设有与相应凹槽相通的垂直孔道；所述直线型中间凹槽和所述折线型侧凹槽的长度为1-3厘米，宽度均为100-500微米；两相邻凹槽槽壁间间距为500微米-2厘米；
3)加载微流通道将步骤幻制备的聚ニ甲基硅氧烷第二印章取出，把具有微凹型単元的面朝下，紧密地贴覆于步骤1)中制备的附着有促进神经细胞黏附物质的第一条带的基底上，形成封闭的流通管腔；其中，聚ニ甲基硅氧烷第二印章的直线型中间凹槽和折线型侧凹槽与基底表面上的第一条带相交不重合；4)制备基底(2)将含促进神经细胞黏附物质的溶液通入步骤幻中形成的管腔；在管腔的基底表面吸附形成两条与第一条带相交不重合的第二条带；5)细胞种植提取动物中枢神经細胞，制备悬浮液，所述动物中枢神经细胞悬浮液中的动物细胞密度为IO6个/ml，把动物中枢神经悬浮液经由所述的垂直孔道送入ー个基底为第二条带的流通管道中，然后将装置放入細胞培养箱，在37°C，5% CO2条件中培养30-60分钟后，动物細胞神经元黏附在流通管道内的第二条带表面；揭去聚ニ甲基硅氧烷印章，加入神经细胞培养液，动物细胞神经元在神经细胞培养液中生长，发出突起，几天后，神经突起长出第 ニ条带的区域，沿着第一条带定向生长；当沿着第一条带定向生长的单根突起碰到另ー个第二条带后，就会在该位点发出分支；以此实现了对神经突起分支位点的精确控制。所述促进神经细胞黏附的物质选自层粘连蛋白、纤维结合蛋白、多聚赖氨酸和/ 或其它ー些促进神经細胞黏附的物质的ー种或多种。此外，本发明还提供一种可以用于控制神经网络的装置，包括-基底，所述基底上表面附着两种促进神经細胞黏附的条带第一条带单元和至少ー组第二条带单元；第一条带单元包括多条平行排列的宽度为5微米的条带，相邻两条带的间距为50-100微米；第二条带单元包括一条直线型中间条带和位于该直线型中间条带左边和/或右边的一条或多条折线型侧条带，这些条带与第一条带相交不重合，并且该折线型侧条带的中间段与该直线型中间条带不相交，其它段分別向远离该直线型中间条带的方向傾斜，这些条带的长度为1-3厘米，宽度为100-500微米，相邻条带最接近部分的间距为500微米-2厘米；此外，第一条带和第二条带上含有促进神经細胞黏附的物质，所述物质选自层粘连蛋白、纤维结合蛋白、多聚赖氨酸和/或其它ー些促进神经細胞黏附的物质的ー种或多种。-聚ニ甲基硅氧烷印章，该聚ニ甲基硅氧烷印章下表面具有至少ー组微凹槽単元組成，所述微凹槽单元包括一条直线型中间凹槽；设置于所述直线型中间凹槽左侧和右侧的一条或多条折线型侧凹槽；所述折线型侧凹槽的中间段与所述直线型中间凹槽不相交，该折线型侧凹槽中间段之外的两端段分別向远离直线型中间凹槽的方向傾斜，并且折线型侧凹槽和直线型中间凹槽的槽端处分别设有与相应凹槽相通的垂直孔道；所述直线型中间凹槽和所述折线型侧凹槽的长度均在1-3 厘米范围内，宽度均为100-500微米；两相邻凹槽最接近部分的间距为500微米-2厘米；所述聚ニ甲基硅氧烷印章下表面紧密地贴覆于所述基底的促进神经細胞黏附的条带的表面上，其直线型中间凹槽和折线型侧凹槽与基底表面上的第一条带相交不重合， 与第二条带中的直线型中间条带和折线型侧条带分別完全相对吻合。
本发明提供了一种控制神经网络的方法，包括以下步骤1)制备基底(1)使用光刻技木，在ー硅片上刻制ー组微结构单元，该微结构单元由多条平行排列的直线型凹槽组成，所述直线型凹槽宽度为5微米，间距为50-100微米；以具有该微结构单元的硅片作模板，用聚ニ甲基硅氧烷对其进行翻摸，得到聚ニ 甲基硅氧烷第一印章；该聚ニ甲基硅氧烷第一印章上表面上具有多条平行排列的凸型条帯，其宽度为5微米，间距为50-100微米；将所述聚ニ甲基硅氧烷第一印章具有凸型条带的面上蘸上含促进神经細胞黏附物质的溶液井吹干；再将其面朝下垂直置于细胞培养皿中或玻璃表面，5-10分钟后揭去该聚ニ甲基硅氧烷第一印章，蛋白从该聚ニ甲基硅氧烷第一印章的凸型条带上转移到細胞培养皿或玻璃表面对应的部位，在細胞培养皿表面上形成第一条带；2)制备聚ニ甲基硅氧烷第二印章所制备的聚ニ甲基硅氧烷第二印章下表面具有至少ー组微凹槽単元，所述微凹槽単元包括一条直线型中间凹槽；设置于所述直线型中间凹槽左侧和右侧的至少一条折线型侧凹槽，该折线型侧凹槽的中间段与直线型中间凹槽不相交，中间段之外的两端段分别向远离直线型中间凹槽的方向傾斜；所述直线型中间凹槽和折线型侧凹槽的槽端处分别连接了与相应凹槽相通的垂直孔道；并且，所述直线型中间凹槽和所述折线型侧凹槽的长度为1-3厘米，宽度为 100-500微米；两相邻凹槽最接近部分的间距为500微米-2厘米；3)加载微流通道将步骤2、制备的聚ニ甲基硅氧烷第二印章取出，把具有微凹型単元的面朝下，紧密地贴覆于步骤1)中附有第一条带的基底上，形成封闭的流通管腔；聚 ニ甲基硅氧烷第二印章的直线型中间凹槽和折线型侧凹槽与基底表面上的第一条带相交不重合；4)制备基底O):将含促进神经细胞黏附物质的溶液通入步骤幻中形成的所有管腔；在管腔的基底表面吸附形成至少三条(Cl，C2，C3. . . Cn)与第一条带相交不重合的第二条带；5)細胞种植提取动物中枢神经細胞，制备悬浮液，所述动物中枢神经细胞悬浮液中的动物細胞密度为IO6个/ml，把动物中枢神经悬浮液经由所述的垂直孔道送入最左侧或最右侧的ー个基底为第二条带(Cl)的流通管道中，将装置放入細胞培养箱，在37°C，5% CO2条件中培养30-60分钟后，动物细胞神经元黏附在Cl表面；揭去聚ニ甲基硅氧烷印章， 加入神经细胞培养液，动物细胞神经元在神经细胞培养液中生长，发出突起，几天后，神经突起长出Cl的区域，沿着第一条带定向生长；当沿着第一条带定向生长的单根突起碰到C2 后，就会在该位点发出分支，一段时间后在C2区域形成神经网络；从C2中长出的单根神经突起接着沿条带一定向生长，在触碰到C3的位点发出分支，经过一段时间孵育在C3区域内形成神经网络；依次类推，实现对神经网络形成的操纵。所述促进神经细胞黏附的物质选自层粘连蛋白、纤维结合蛋白、多聚赖氨酸和/ 或其它ー些促进神经細胞黏附的物质的ー种或多种。本发明提供的装置和方法，可以精确的控制神经突起发出分支的位点，进而对整个神经网络形成的数量进行操纵。本发明所提供的装置和方法简单、易操作，可为以神经元为基础的生物传感器的制造提供基础支持；另外，该装置还可用于筛选和研究不同基质对神经突起分支能力的影响，进而筛选出不同的分子或者化学信号，这将为神经突起分支的研究提供一个便捷的平台。与现有技术相比，本发明的优点在于1、本发明中蛋白转移和微流控的结合利用，可以精确控制神经突起分支的位点， 这是现有技术无法解决的问题；2、本发明所提供的装置为神经生物学，特別是神经突起生长的有序控制和神经电信号传导的研究提供了新的途径；3、该装置还可用于筛选和研究不同基质对神经突起分支能力的影响，进而筛选出不同的分子或者化学信号，这将为神经突起分支的研究提供一个便捷的平台。4、本发明可以便捷的同时对大量神经细胞的分支位点进行控制，为高通量的研究神经分支提供便利平台；5、本发明可以控制神经网络形成的位置和数量，这是现有技术无法解决的；6、本发明可以对神经分支处的基底进行不同的控制，例如不同浓度和不同种类的蛋白，进而高通量的研究以上各因素对神经分支的影响。
以下，将结合附图来详细说明本发明，其中图1为本发明用于控制突起分支的装置的一种结构示意图，其中基底1表面附着两种促进神经細胞黏附的条带即条带11和条带21 ；紧密贴附于基底1上的聚ニ甲基硅氧烷印章2，其包括直线型中间凹槽22和位于该直线型中间凹槽左侧和右侧的折线型侧凹槽23，该直线型中间凹槽22和折线型侧凹槽23的槽端处分别设有垂直孔道M ；图2为本发明用于控制突起分支的装置的另ー种结构示意图，其中基底1表面附着两种促进神经細胞黏附的条带即条带11和条带21 ；紧密贴附于基底1上的聚ニ甲基硅氧烷印章2，其包括直线型中间凹槽22和位于该直线型中间凹槽左侧和右侧的四条折线型侧凹槽23，该折线型侧凹槽和直线型中间凹槽的槽端处分别设有与相应凹槽相通的垂直孔道M ；图3为本发明所提供的装置中基底的制备流程图，其中图3-A 表面有凸型条带状结构的聚ニ甲基硅氧烷印章4 ；图3-B 将印章4表面微结构孵育上促进神经細胞黏附的蛋白溶液后，将印章4的微结构面朝下置于基底1表面；图3-C 揭去印章4，蛋白质已从印章4的凸型条帯状结构表面转移到基底1表面的对应部位，在基底1的表面形成平行排列的蛋白质条带11 ；图3-D 将聚ニ甲基硅氧烷印章2的微结构面朝下至于蛋白条带11上，在凹槽中通入促进神经細胞黏附的蛋白溶液并孵育；图3-E 揭去印章2，可见凹槽中的蛋白质吸附在基底1上，形成与条带11相交但不重合的条带21。
图4为正常生长的神经元与用本装置生长的神经元的示意图，其中图4-A表示正常生长的神经元，其神经突起发出大量分支形成神经纤维网络；图4-B表示由本装置和方法生长的神经元，神经突起可以在特定位点发出突起， 形成神经网络。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明进行进一步的详细描述。应当理解给出的实施例仅为了对制备和使用本发明的特定方法和产品进行说明，而不是为了限制本发明的范围。实施例1 1)光刻使用光刻技木，分別制备有微结构单元一和微结构単元ニ的硅片。首先用作图软件L-editCTarmer EDA)设计出所需要的两种图型，微结构単元一包括多组平行排列的直线型凹槽，其宽度为5微米，间距为50微米(50-100微米均可)。微结构单元ニ包括至少ー组凸型线型微结构単元，该凸形线型微结构单元包括一条直线型凸型线和一条折线型凸型线，所述直线型凸型线和折线型凸型线的中间段平行，其间距为500 微米(500微米-2000微米均可)，所述折线型凸型线的中间段之外的两端部分向远离直线型凸型线的方向倾斜；所述两种凸型线的长度在1. 5厘米(1-3厘米均可)，宽度100微米 (100-500微米均可)；在商业化影印公司打印分辨率微3600dip的胶片(www. bjflfd. com)，接着涂胶 (SU-8系列负胶)(MicroChem，Newton, ΜΑ)，利用甩胶机均勻的将光刻胶涂在硅片(洛阳单晶硅厂，4英寸)上，80°C烘烤3小时后硬化，把胶片垂直放在涂有光刻胶的硅片上，显影曝光后就在涂有光刻胶的硅片上制成了所需的微型结构单元一和微型结构单元ニ；2)印章制备用聚ニ甲基硅氧烷(Sylgard 184, Dow Corning, MI, US)对步骤1)得到的两种微结构单元进行翻摸，分別得到与这两种微结构単元相对应的聚ニ甲基硅氧烷第一印章和第 ニ印章；把聚ニ甲基硅氧烷第一印章有微结构面朝上，在等离子清洗器中氧化3分钟，制备成具有亲水表面的聚ニ甲基硅氧烷第一印章；采用本领域常规技术，在聚ニ甲基硅氧烷第二印章上制备和所形成凹槽的终端垂直相通的孔道。3)制备基底(1)将所述聚ニ甲基硅氧烷第一印章的具有凸型条带的面上蘸上含0.01%多聚赖氨酸(Sigma)的溶液井吹干；再将其面朝下垂直置于细胞培养皿中，5-10分钟后揭去该印章， 多聚赖氨酸从该印章的凸型条带上转移到細胞培养皿表面对应的部位，在細胞培养皿表面上形成第一条带；4)加载微流通道将步骤幻制备的聚ニ甲基硅氧烷第二印章取出，把具有微凹型単元的面朝下，紧密地贴覆于步骤幻中制备的附着有第一条带的基底上，形成封闭的流通管腔；聚二甲基硅氧烷第一印章的直线型中间凹槽和折线型侧凹槽与基底表面上的多聚赖氨酸的条带相交不重合；5)制备基底(2)将上述含多聚赖氨酸的溶液通过印章上的孔道通入步骤4)中形成的管腔；在管腔的基底表面吸附形成两条与第一条带相交不重合的第二条带；6)细胞种植:提取动物中枢神经细胞(来自SD乳鼠，出生后1天之内，该乳鼠购自北京维通利华实验动物有限公司)，制备悬浮液，所述动物中枢神经细胞悬浮液中的动物細胞密度为 IO6个/ml，把动物中枢神经悬浮液经由所述的垂直孔道送入ー个基底为第二条带的流通管道中，放入細胞培养箱，在37°C，5% CO2条件中培养30-60分钟后，动物细胞神经元黏附在流通管道内的第二条带表面；揭去聚ニ甲基硅氧烷印章，加入神经细胞培养液(86%基础神经培养液 anvitrogen)，10%胎牛血清 Qnvitrogen)，2% B27添加剂(Invitrogen), 1 % N2添加剂(Invitrogen)，谷氨酸(Hyclone))，动物细胞神经元在神经细胞培养液中生长，发出突起，几天后，神经突起长出第二条带的区域，沿着第一条带定向生长；当沿着第一条带定向生长的单根突起碰到另ー个第二条带后，就会在该位点发出分支；以此实现了对神经突起分支位点的精确控制。实施例2 1)光刻使用光刻技木，分別制备有微结构单元一和微结构単元ニ的硅片。首先用作图软件L-edit设计出所需要的两种图型，微结构単元一包括多组平行排列的直线型凹槽，其宽度为5微米，间距为50微米(50-100微米均可)。微结构単元ニ包括至少ー组凸型线型微结构単元，该凸形线型微结构单元包括一条直线型凸型线和两条折线型凸型线；所述直线型凸型线位于折线型凸型线中间，直线型凸型线和另两条折线型凸型线的中间段平行，间距为500微米；所述折线型凸型线中间段之外的两端部分向远离直线型中间凸型线的方向倾斜；所述凸型线的长度在1. 5厘米(1-3厘米均可)，宽度100微米(100-500微米均可)，间距500微米。在商业化影印公司打印分辨率微3600dip的胶片(www. bjflfd. com)，接着涂胶 (SU-8系列负胶)，利用甩胶机均勻的将光刻胶涂在硅片上，80°C烘烤3小时后硬化，把胶片垂直放在涂有光刻胶的硅片上，显影曝光后就在涂有光刻胶的硅片上制成了所需的微型结构单元一和微型结构单元ニ；2)印章制备用聚ニ甲基硅氧烷对步骤1)得到的两种微结构单元进行翻摸，得到与这两种微结构单元相对应的聚ニ甲基硅氧烷第一印章和第二印章；把聚ニ甲基硅氧烷第一印章有微结构面朝上，在等离子清洗器中氧化3分钟，制备成具有亲水表面的聚ニ甲基硅氧烷第一印章；采用本领域常规技术，在聚ニ甲基硅氧烷第二印章上制备和所形成凹槽的终端垂直相通的孔道。3)制备基底(1)将所述聚ニ甲基硅氧烷第一印章的具有凸型条带的面上蘸上含层粘连蛋白(100 微克/毫升，Sigma)的溶液井吹干；再将其面朝下垂直置于细胞培养皿表面，5-10分钟后揭去该聚ニ甲基硅氧烷第一印章，蛋白从该印章的凸型条带上转移到細胞培养皿表面对应的部位，在細胞培养皿表面上形成第一条带；4)加载微流通道将步骤1)制备的聚ニ甲基硅氧烷第二印章取出，把具有微凹型単元的面朝下，紧密地贴覆于步骤幻中制备的附着有层粘连蛋白条带的基底上，形成封闭的流通管腔；该印章上的直线型中间凹槽和折线型侧凹槽与基底表面上的第一条带相交不重合；5)制备基底(2)将上述含层粘连蛋白的溶液通过印章的孔道通入步骤4)中形成的所有管腔；在管腔的基底表面吸附形成三条(C1、C2、C;3)与第一条带相交不重合的第二条带；6)细胞种植提取实施例1所采用的动物中枢神经細胞，制备悬浮液，所述动物中枢神经细胞悬浮液中的动物細胞密度为IO6个/ml，把动物中枢神经悬浮液经由所述的垂直孔道送入最左侧或最右侧的ー个基底为第二条带(Cl)的流通管道中，放入細胞培养箱，在37°C，5% CO2条件中培养30-60分钟后，动物细胞神经元黏附在Cl表面；揭去聚ニ甲基硅氧烷印章， 加入实施例1所采用的神经细胞培养液，按照同实施例1的方法培养动物細胞神经元在神经细胞培养液中生长，发出突起，几天后，神经突起长出Cl的区域，沿着第一条带定向生长；当沿着第一条带定向生长的单根突起碰到C2后，就会在该位点发出分支，一段时间后在C2区域形成神经网络；从C2中长出的单根神经突起接着沿第一条带定向生长，在触碰到 C3的位点发出分支，经过一段时间发育在C3区域内形成神经网络，从而实现对神经网络形成数量的操纵。
权利要求
1.一种可控制神经突起分支位点的装置，包括(1)用于神经細胞黏附和生长的基底，其包含第一条带单元所述单元含有平行排列的一条或多条直线型第一条帯，其长度为1 3 厘米，宽度为2 10微米，彼此之间的间距为为20-100微米；至少ー组第二条带单元所述单元含有与第一条带单元中的第一条带相交但不重合的第二条带，包括一条中间条带，以及位于所述中间条带左侧和/或右侧的一条或多条侧条帯，并且该侧条带与中间条带不相交；第二条带的长度为1 3厘米，宽度为100 500微米，并且该中间条带和侧条带的最接近部分的间距为500微米 2厘米；所述基底的第一条带和第二条带上分別含有促进神经細胞黏附的物质，所述物质独立地选自层粘连蛋白、纤维结合蛋白、多聚赖氨酸和/或其他促进神经細胞黏附的物质中的 ー种或多种；(2)紧密贴附于所述基底上的印章其贴附表面具有至少ー个凹槽单元，所述单元包括一条中间凹槽和位于所述中间凹槽左侧和/或右侧的一条或多条侧凹槽，该侧凹槽与中间凹槽不相交，并且中间凹槽和侧凹槽与基底上第二条带中的中间条带和侧条带分別完全相对应吻合；该中间凹槽和侧凹槽的一个或两个槽端处连接了与相应凹槽相通的孔道，从而可以使神经细胞从印章上的孔道进入并黏附于所述基底上的第二条带上；优选地，所述印章由聚ニ甲基硅氧烷制成。
2.如权利要求1所述的装置，其中，所述第二条带单元的中间条带为直线型中间条帯， 所述侧条带为折线型侧条带，该折线型侧条带的中间段与该直线型中间条带不相交，其它段分別向远离该直线型中间条带的方向傾斜；所述印章上与第二条带的中间条带相对应吻合的中间凹槽为直线型中间凹槽，和第二条带的侧条带相对应吻合的侧凹槽为折线型侧凹槽，该折线型侧凹槽的中间段和直线型中间凹槽不相交，其它段分別向远离该直线型中间凹槽的方向傾斜。
3.如权利要求1或2所述的装置，其中，所述第一条带的长度为2厘米；宽度为5微米； 彼此之间的间距为50 100微米。
4.如权利要求1-3中任一项所述的装置，其中，所述第二条带的长度为1.5 2厘米； 宽度为200 300微米；所述中间条带和侧条带的最接近部分的间距为500微米 1厘米。
5.一种如权利要求1-4中任一项所述装置的制备方法，包括(1)制备第一印章选取适合材料制成ー个印章作为第一印章，使该第一印章表面具有多条平行排列的直线型凸帯，其长度为1 3厘米，宽度为2 10微米，并且凸带的间距为20-100微米；(2)制备第二印章选取适合材料制成ー个印章作为第二印章，使该第二印章的表面具有至少ー组凹槽单元，其包括一条中间凹槽和位于该中间凹槽左侧和/或右侧的一条或多条侧凹槽，该侧凹槽与中间凹槽不相交，该中间凹槽和侧凹槽的长度为1 3厘米，宽度为100 500微米， 并且该中间凹槽和侧凹槽的最接近部分的间距为500微米-2厘米；此外，该中间凹槽和侧凹槽的ー个或两个槽端处连接了与相应凹槽相通的孔道通向该印章外；(3)制备基底选取适合培养神经細胞的基底，例如細胞培养皿中或玻璃的表面，将第一印章具有凸带的面上蘸上含有促进神经细胞黏附物质的溶液并干燥，再将其表面朝下置于该基底上， 一定时间后，优选5 10分钟后揭去该印章，该第一印章上促进神经細胞黏附物质即转移到基底表面形成第一条带；将步骤(2)中制备的第二印章表面朝下紧密贴附于上述具有第一条带的基底上，使该第二印章上的中间凹槽和侧凹槽与基底上的第一条带相交不重合；将所述含有促进神经细胞黏附物质的溶液通入第二印章上与凹槽相通的孔道，使促进神经細胞黏附的物质在所述基底上形成第二条带；优选地，所述第一印章和第二印章由聚ニ甲基硅氧烷制成。
6.如权利要求5所述的制备方法，其中，在所述方法的步骤(1)中，所述第一印章表面的直线型凸带的长度为2厘米；宽度为5微米；彼此之间的间距为50-100微米。
7.如权利要求5或6所述的制备方法，其中，在所述方法的步骤O)中，所述第二印章表面的中间凹槽为直线型中间凹槽，所述侧凹槽为折线型侧凹槽，该折线型侧凹槽的中间段和直线型中间凹槽不相交，其它段分別向远离该直线型中间凹槽的方向傾斜；优选地，所述第二印章表面的凹槽长度优选为1. 5 2厘米；宽度优选为200 300微米；其中中间凹槽和侧凹槽的最接近部分的间距优选为500微米 1厘米。
8.如权利要求5-7中任一项所述的制备方法，其中，在所述方法的步骤(3)中，在所述用于制备第一条带和第二条带的含促进神经细胞黏附物质的溶液中，所含有的促进神经细胞黏附物质分别独立地选自层粘连蛋白、纤维结合蛋白、多聚赖氨酸和/或其他促进神经細胞的物质中的一种或多种，所述物质的浓度优选为20 200微克/毫升。
9.ー种控制神经突起分支位点的方法，所述方法包括制备动物神经细胞悬浮液，通过上述装置中印章上的孔道进入该装置，然后将装置在适合所述细胞生长的条件下培养，当細胞黏附于所述基底的第二条带上后，去除该印章，加入神经细胞培养液，在适合的培养条件下进行培养；优选地，所述神经培养液包含86%基础神经培养液，10%胎牛血清，2% B27添加剤， 1% N2添加剤，谷氨酸，所述培养条件为37°C，5% C02 ；优选地，所述神经细胞为中枢神经細胞。
10.如权利要求1-4中任一项所述装置在精确控制神经突起分支位点和/或神经网络形成中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种用于精确控制神经突起分支位点以及神经网络数量的装置，所述装置包括基底和紧密贴附于所述基底上的印章，其中所述基底含有用于黏附神经细胞的第一条带单元和至少一个第二条带单元，所述印章含有至少一个凹槽单元，所述凹槽单元中的凹槽和所述第二条带单元中的第二条带完全相对应吻合。本发明还提供了所述装置的制备方法和应用。
文档编号C12N5/079GK102586103SQ20111000620
公开日2012年7月18日 申请日期2011年1月13日 优先权日2011年1月13日
发明者刘文文, 蒋兴宇, 袁博, 邢仕歌 申请人:国家纳米科学中心