专利名称：一种高效产透明质酸工程大肠杆菌及其制备方法
技术领域：
本发明涉及微生物的基因工程技术领域，具体是以质粒形式或以基因组整合方式构建的高效产透明质酸工程大肠杆菌及其制备方法。
背景技术：
大肠杆菌K-12株系因清晰的遗传背景、拥有众多高效的遗传转化系统和基因组的易操作性而被广泛应用在代谢工程领域，以生产各式各样的高附加值产品。目前尚未发现天然的大肠杆菌菌株有生产透明质酸的能力。透明质酸(Hyaluronic acid, HA)最早从牛眼中分离得到的一种具有高黏度氨基多糖。透明质酸广泛存在人和动物组织内，其分子量在5X IO4到8X IO6道尔顿之间， 是由β-1，4-糖苷键连接的葡萄糖醛酸及β-1，3-糖苷键连接的氮乙酰葡萄糖胺(β 1-4 D-Glucuronic acid, GlcA ， β 1-3 D-N-acetylglucosamine ， GlcNAc)交替连接而成的直链聚合物。研究证实，该多糖作为结构与信号分子参与了哺乳动物的受精、胚胎发育、血管再生和关节润滑等众多生理活动；同时在炎症与损伤修复、维持皮肤的水分与弹性方面也有重要作用。研究发现，特定长度的HA寡糖链在抗肿瘤免疫异常修复等方面发挥着重要功能。 由于透明质酸独特的化学特性与生理功能，HA及源于HA的寡糖链被广泛应用于眼科手术、关节炎治疗、抗肿瘤、给药方式、化妆品工业等诸多方面，仅2008年HA做为原料，在全球市场的交易金额约为10亿美元并有逐年增加的趋势。自然界中HA广泛存在，如动物组织、哺乳动物病原菌的细胞被膜及病毒PBCV-I浸染的小球藻等。目前商用HA主要从动物组织(如鸡冠，脐带、牛眼、关节滑液)，和培养人与高等哺乳动物的病原菌(如链锁状球菌，Str印tococci )中提取。出于资源限制、成本问题及药物安全等诸方面的考虑，上述生产绝非理想方式，国际社会极力探索更为经济、安全和持续的生产HA的方法。分子生物学及生物技术的发展，为上述问题的解决提供了重要的手段。对HA 在动物与微生物中合成机理，诸多HA的合成过程必需基因的克隆等研究，都为通过代谢工程的手段，在安全的宿主生物中重建或改造合成途径来生产HA奠定了坚实的基础。2004年日本学者柴谷滋郎等(中国专利申请号为200480022328.8)通过在转基因植物中表达从人类和草履虫病毒(PBCV-I)中得到的HA合成基因(Has)来尝试HA在植物组织中的合成。Widner B 等(Bill Widner et al . , Hyaluronic Acid Production in Bacillus subtil is Appl. Environ. Microbiol. 2005，71 (7) : 3747 - 3752)在枯草芽孢杆菌中成功表达从革兰氏阳性的链锁状球菌中得到的HA合成基因，工程芽孢杆菌在普通的三角瓶中发酵获0.5-0. 6g / L HA含量。然而在植物中生产透明质酸，因植物的转化难，生长周期受季节限制，许多保守环保人士反对转基因植物，及转基因植物本身存在对环境安全的潜在危害等而受到应用限制。对于枯草芽孢杆菌，因该菌有产生内毒素，各种大环脂类和脂肽类抗生素的报道，而会导致经发酵、用于医药领域HA的分离纯化成本增高，产率降低等系列问题。许多来源于人体肠道的大肠杆菌是维护肠道微生物平衡及人体健康的有益细菌。 加之大肠杆菌K12株系具清晰的遗传背景、拥有众多高效的遗传转化系统和基因组可操作性，而被广泛应用在代谢工程领域以生产高附加值的生物产品。对于用大肠杆菌为宿主进行工程改造生产透明质酸的首次报道是美国麻省理工学院的M^hanopoulos G研究组。 2008该研究组通过在大肠杆菌中表达革兰氏阳性链锁状球菌HA合成基因印Zfes和全新合成，优化过密码子并用于大肠杆菌表达的m/^s基因，该研究获得最高约0.2g/L的HA产量。该工程大肠杆菌因HA合成产率低而难以获得产业化运用。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效产透明质酸工程大肠杆菌及其制备方法，克服现有技术中生产透明质酸的资源短缺、安全性问题以及在工程大肠杆菌中较低透明质酸合成的问题。本发明是用表达透明质酸合成酶基因(hyaluronic acid synthase Has)和尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因(UDP-glucose Dehydrogenase)高效产透明质酸工程大肠杆菌。本发明的含有透明质酸合成酶基因和尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因的高效产透明质酸工程大肠杆菌是通过以下方法构建获得的
(1)构建表达透明质酸合成酶基因Has的载体，具体是将PCR克隆的Has连接入大肠杆菌的表达载体(如PQE801)中；
(2)构建表达尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因的载体，将PCR克隆的尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因连接入大肠杆菌的表达载体(如PQE801)中；
(3)构建含有透明质酸合成酶基因Has^和含有尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因，在大肠杆菌中共同表达的重组载体；以( 中构建的含有尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因表达载体为PCR的模板，扩增含驱动子(如T5)驱动kfi\)表达的PCR产物，并连入(1)中构建的表达透明质酸合成酶基因Zfes的表达载体中而获得含有透明质酸合成酶基因Zfes和尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因，且能在大肠杆菌中共同表达的重组载体。(4)将(3)中获得含有透明质酸合成酶基因Zfes和尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组载体，转化大肠杆菌(如JM109菌株)，经筛选而获高效产透明质酸的工程大肠杆菌。本发明的产透明质酸工程大肠杆菌是PHK/JM109，分类命名为大肠埃希氏菌 {Escherichia co/i)，保藏号为CGMCC No. 3926，于2010年6月17日在中国北京市的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)保藏，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明的高效产透明质酸工程大肠杆菌(pHK/五coliMim具体按以下方法制备
(1)构建含有透明质酸合成酶基因的表达载体PQEpmHas,用PCR扩增方法克隆源自 ^ ^sWiMM (.Pasteurella multoeida subsp. ifo/iocii/a)中的透明质酸合成酶基因 {Pasteurella muliociVahyaluronic acid synthase PmHas),其 PCR 扩±曾克隆所用弓 |物设计如下
上游引物pmHas Pl 为 5' -TAgfi^r<XATGAACACATTATCACAAGCAAT~3',(序列表中 SEQ ID No:3)含汉H I位点GGATCC和起始密码子ATG ；
下游引物为/Mzfes P2 为 5' -TA6^g67TTTATAGAGTTATACTATTAATMT-3’ (序列表中 SEQ ID No 4)，含Sac I位点GAGCTC和终止密码子TAA ；
PCR的模版为多杀巴斯德菌菌株ATCC 15742的基因组DNA，扩增产物经汉a H I和 I双酶切后，连接入商用载体PQE80L中的相同酶切位点，插入片段经DNA测序确证无突变后，将所获载体命名为PQEpmHas，基因为/M^ks (序列表中SEQ ID No: 1)
(2)构建含尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因的表达载体pQEkfiD，用PCR扩增方法克隆源自源于大肠杆菌(fecAericAiaco/i)菌株k5 iE. coli K5)中鸟苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因(K5 capsule gene D，i/iD)，扩增的引物设计如下
上游引物IfiD Pl: 5' - TGGAGArmTGTTCGGAACACTAAAAATAACT G-3，(序列表中 SEQ ID No:5)，含Bgl II位点AGATCT，和起始密码子ATG)；
下游引物IfiD P2 5' -TT^TT^gTTAGTCACATTTAAA CMATCGCGAC-3'(序列表中 SEQ ID No 6)，含Xho I位点CTCGAG和终止密码子TAA ；
PCR的模版为大肠杆菌菌k5菌株ATCC 23500的基因组D N A，成功扩增并纯化的产物，給B gl II和损ο I双酶切后，连接入Qiagen公司的商用载体pQE80L的汉警H I和 Sal I位点，所得载体经DNA测序分析确证插入片段无突变后，所获载体命名为pQEkfiD， 相应基因命名为A/iD基因(序列表中SEQ ID No:2)；
(3)构建大肠杆菌中共同表达透明质酸合成酶基因和含有尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组载体
根据构建好的pQEkfiD载体的DNA序列设计PCR引物，扩增T5启动子驱动i/iD表达的片段T5:kfiD，具体引物序列设计如下
上游引物 T5kfiD Pl 5' -TAGAGCTCCCTTTCGTCTTCACrTCGAGA-3'(序列表中 SEQ ID No:7)，该引物含有Sac I位点，GAGCTC，其中下标G表示将原始pQESOL载体中C突变为 G,以消除其损ol位点，CTCGAG ；
下游引物 T5kfiD P2 5' -TACTCGAGTTCTGAGGTCATTACTGGATCT-3'(序列表中 SEQ ID No:8)，该引物含损ο I site, CTCGAG ；
PCR的模版用pQEkfiD载体，纯化的T5 kfiD扩增产物，首先连接入pGEM-T-Vector (Promega产品，www. promega. com)并转化大肠杆菌JM109菌株，获中间载体pT_T5KfiD， 该载体中T5:kfiD (序列表中SEQ ID No:9)片段，经测序分析证实核苷酸顺序无突变后， 该插入T5: kfiD片段经fee I和损ο I双酶切后，连接入表达载体pQEpmHas的fee I和 sal I位点而获和A/iD基因在大肠杆菌中共表达的重组载体pQHK ；
(4)pHK的构建
根据德国MoBiTec公司的革兰氏阴性菌宿主广谱质粒pBBR122的DNA序列(GenBank No. Y14439)设计引物:
上游引物 PBBR Pl 5' -TTTGGTGTCGACCTTGCCAGCCCGTGGATATGTGG-3'(序列表中 SEQ ID NO 10)；含有fe/I酶切位点，GTCGAC
下游引物 PBBR Pl 5' -TTAGGTGTCGACTCTGTGATGGCTTCCATGTCGGCAG-3'(序列表中 SEQID NO: 11)，含有5^1酶切位点，61^^0 ；
用上述引物扩增质粒PBBR122中包含其复制位点及卡那霉素抗性基因在内的片段， PCR 扩增的参数为95°C、2min，1 个循环；94°C，30s，55°C >30s, 72°C、3min，25 个循环；72°C、IOmin 1个循环，纯化约3. 2 1Λ扩增产物，用5 / I酶解后，加入连接酶让其自连，自身连接产物转化大肠杆菌JM109菌株，并用卡那霉素筛选获质粒pRP (序列表中SEQ ID NO :1 ，提取质粒pRP，经fe/I酶解后，连接入上述能在大肠杆菌中共表达pmHas和 kfi\)基因的pQHK的Xho I位点，而获在革兰氏阴性菌中共表达pmHas和k·来合成透明质酸的表达载体pHK;
(5)将该重组载体pHK转入大肠杆菌JM109中获得所述的高效产透明质酸的工程大肠杆菌 PHK/JM109 (CGMCC NO: 3926)。以上所述的大肠杆菌菌株pHK/JM109为高效产透明质酸工程大肠杆菌，其中pHK 为表达载体JM109为表达载体的宿主菌株。与现有技术相比，本发明的有益效果是
1、本发明的工程大肠杆菌能产透明质酸2g/L 2. 5g/L,比现有技术中通过大肠杆菌中表达革兰氏阳性链锁状球菌HA合成基因spHas和全新合成，优化过密码子并用于大肠杆菌表达的seHas基因获得的最高约0. 2g/L的透明质酸产量提高近10倍。2、本发明第一次用在革兰氏阴性菌来源的透明质酸合成酶基因pmHas和含有尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因i/iD在革兰氏阴性宿主中表达来生产透明质酸。3、本发明所构建的重组表达载体pHK，含有广谱的能在革兰氏阴性细菌中复制的必需片段，且驱动透明质酸合成酶基因PmHas和含有尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因i/iD表达的启动子，在大部分革兰氏阴性细菌中有较好的活性，而使本发明的重组表达载体PHK， 可用于(其他非大肠杆菌)革兰氏阴性细菌中生产透明质酸。
图1是本发明中透明质酸合成酶催化鸟苷二磷酸葡萄糖酸和鸟苷二磷酸葡萄糖胺聚合形成透明质酸的过程图。图2是本发明的共表达/7^/ s和Zfii 载体图，其中A :pQHK仅用于在大肠杆菌中表达；B :pHK既可以用于在大肠杆菌中表达，还可以用于在其他革兰氏阴性菌中表达；
图3是本发明的显示透明质酸合成酶基因—Has)和含有尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因ikfW在大肠杆菌JM109菌株中的表达图，其中A :pQEpmHAS/JM109菌株中pmHAS表达检测，B :pHK/JM109菌株中pmHAS和kfiD共表达检测.Al, Bl分别为pQEpmHAS/JM109菌株和pHK/JM109菌株，经Ni-NTA-Agrose纯化的电泳，显示pmHas分子量约为llOkD，kfiD 分子量约为45kD，A2，B2为蛋白分子量标准(从上到下分子量分别为225 150 100 75 50 35 25 15 (KDa)，A3, B3 分别为pQE80L/JM109和pBQ/JM109 (空载体转化)的总可溶性蛋白电泳，A4，B4分别为pQEpmHas/M109和pHK/JM109的总可溶性蛋白电泳。本发明所涉及的DNA序列说明
序列表中SEQ ID NO :1所示的是源自多杀巴斯德菌(/^sieareWa SM^iocit/a subsp. Multocida中的透明质酸合成酶基因编码区核苷酸序列。序列表中SEQ ID NO :2所示的是源自大肠杆菌k5菌株(中鸟苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因kfiD的编码区核苷酸序列。 序列表中SEQ ID NO :3所示的是克隆源自多杀巴斯德菌(Fasteurella multocida subsp. Multocida)中的透明质酸合成酶基因fffi^ks的上游引物的碱基序列。序列表中SEQ ID NO :4所示的是克隆源自多杀巴斯德菌(/^asteure^a multocida subsp. Multocida)中的透明质酸合成酶基因/^Hfes的下游引物的碱基序列。序列表中SEQ ID NO 5所示的是克隆源于大肠杆菌k5菌株中鸟苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因i/iD的上游引物的碱基序列。序列表中SEQ ID NO 6所示的是克隆源于大肠杆菌k5菌株中鸟苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因A/iD的下游引物的碱基序列。序列表中SEQ ID NO 7所示的是克隆T5:kfiD片段的上游引物的碱基序列。序列表中SEQ ID NO 8所示的是克隆T5:kfiD片段的下游引物的碱基序列。序列表中SEQ ID NO 9所示的是T5:kfiD片段的核苷酸序列。序列表中SEQ ID NO 10所示的是克隆PBRR122卡那霉素抗性基因及复制必需片段的上游引物的碱基序列。序列表中SEQ ID NO=Il所示的是克隆PBRR122卡那霉素抗性基因及复制必需片段的下游引物的碱基序列。序列表中SEQ ID NO 12所示的是质粒pRP的核苷酸序列。本发明涉及的遗传资源
1Pasteurella multocida subsp. multocida (Lehmann
and Neumann) Rosenbusch and Merchant)；遗传资源取自美国典型培养物保存中心 (ATCC)；获取方式购买，价格225美金；获取时间2008年1月；原始来源美国科学家KL Heddleston从火鸡心脏中分离，获取时间1962年4月
2:大肠杆菌 K5 菌株 ATCC23500 (fecAericAia coli (Migula) Castellani and Chalmers，serotype 02a，2b:K5 (L) :H4 ；遗传资源取自美国典型培养物保存中心(ATCC) 获取方式购买，价格225美金，获取时间2008年9月原始来源美国疾病控制中心 (⑶C)科学家Kauffmarm从人尿中分离，及获取时间1943年7月。
具体实施例方式本发明通过以下实施例作更详细的描述，但本发明并不仅限于此。 实施例源自多杀巴斯德菌(/^1StetfreWasubsp. Jfo/iocit/a)中的透明质酸合成酶基因的克隆和含有透明质酸合成酶基因^fflfe1S的表达载体pQEpmHas的构建及转化大肠杆菌JM109菌株。具体步骤如下
(1)构建含有透明质酸合成酶基因的表达载体PQEpmHas，用PCR扩增方法克隆源自 ^ ^ E^ (.Pasteurella mul tocida subsp. ifo/iocit/a)中的透明质酸合成酶基因 {Pasteurella muliociVahyaluronic acid synthase PmHas),其 PCR 扩±曾克隆所用弓 |物设计如下
上游引物pmHas Pl 为 5' -TAgfi^r<XATGAACACATTATCACAAGCAAT~3'，(序列表中 SEQ IDNo:3)含汉H I位点GGATCC和起始密码子ATG ；
下游引物为为 5' -TA6^g67TTTATAGAGTTATACTATTAATAAT-3’ (序列表中 SEQ ID No 4)，含Sac I位点GAGCTC和终止密码子TAA ；
PCR的模版为多杀巴斯德菌菌株ATCC 15742的基因组DNA，扩增产物经汉a H I和 I双酶切后，连接入商用载体PQE80L中的相同酶切位点，插入片段经DNA测序确证无突变后，将所获载体命名为pQEpmHas，基因为/Mzfe1S如序列表中SEQ ID NO 1所示。大肠杆菌中pmHas表达，纯化及活性测定
将含pQEpmHas大肠杆菌JM109菌株，在含100ug/L Amp (氨卞青霉素)LB (琼脂固体)培养基，10g/L Tryptone (胰化蛋白胨)，5g/L Yeast extract (酵母提取物)，10g/L NaCl, pH 7.0，15g/L琼脂平板上划线以产生单菌落，挑取单菌落置于5ml含100u/L Amp 的LB在37°C、250 rpm培养14-16小时获种子液；将种子液按100倍(V/V)培养在新的含 100u/L Amp的LB中生长至培养物600nm光吸收约0. 5-0. 6 ；这时立刻加入终浓度为ImM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG),并在30°C培养6-8小时。培养物经12000 rpm离心5min收集细菌，菌体用等体积50 mM (pH8. 0)磷酸钠缓冲液洗涤后，再次离心收集，菌体以约0.2g鲜重/ml浓度悬浮于pH8.0，含50 mM 磷酸钠，300mM NaCl, IOmM咪唑(imidazole)，ImM溶菌酶，2mM的蛋白酶抑制剂(DMSF)的混合液中后，低温下(0-4°C)超声波破碎为勻浆，细胞裂解物经12000 RPM离心20 min,取上清液得风办浙粗提液。该粗提液加入到含Ni-NTA-Agrose (Sigma公司产品)的层析柱中，用pH 8. 0，含50mM磷酸钠，300mM NaCl，20 mM咪唑(imidazole)溶液洗涤，和用pH 8.0，含50 mM磷酸钠，300mM NaCl，250 mM咪唑(imidazole)溶液洗脱，收集洗脱液。该洗脱溶液经IOmM pH7. 0 Tris- HCl透析过夜，得纯化的透明质酸合成酶(/ ^),从图3 可见透明质酸合成酶(ZMfes)在大肠杆菌JM109菌株中获得高效表达，且被纯化为十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的单一条带。透明质酸合成酶的活性分析采用体外透明质酸的积累来测定，酶促反应是在 50ul 体系中进行，该体系含 IOOmM Tris HCl (pH7. 0), 40mM MgS04, 0. 5mM 乙二醇二乙醚四乙酸(EGTA)，2mM，巯基乙醇0.1%牛血清白蛋白，(BSA)，2mM尿苷二磷酸6-葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)，2mM尿苷二磷酸氮乙酰葡萄糖胺(UDP-GlcNAc^P IOul不同稀释、不同纯化过程中和不同阶段的PmHas酶液。反应物混合均勻后，在37°C条件下反应60min后，用 900C 5min使酶失活终止反应，离心反应混合溶液，取上清测定透明质酸含量。透明质酸含量测定采用透明质酸结合蛋白(Hyaluronic Acid Binding Protein, HABP)来测定，本发明采用透明质酸放射免疫分析试剂盒(北京北方生物技术研究所产品，http://WWW. bnibt. com,)来分析，该分析试剂盒采用竞争放射免疫分析法，即标准或待测样品中的HA和125I-HA共同与限量的透明质酸结合蛋白(HABP)在适宜的条件下进行竞争性结合反应。一部分125I-HA与HABP结合形成复合物，而另一部分呈游离状态。 125I-HA与HABP结合的比例取决于标准或待测样品中非标记HA的含量，非标记HA的含量越高，125I-HA与HABP形成的复合物越少。HA-HABP复合物与HABP抗体和第二抗体形成交联的聚合物沉淀下来，测定沉淀物的放射性计数。经过数据处理后可获得标准曲线及回归方程，从标准曲线上查出被测样品的HA含量。1酶活性单位(U)定义为1小时催化形成Iug 透明质酸分子数。酶液中蛋白含量采用伯乐(Bio-Rad)公司蛋白测定试剂盒(www. biorad.com)并用牛血清白蛋白(BSA)为蛋白标准品，以计算酶的比活。表1数据表明基因在大肠杆菌中获得活性表达。
权利要求
1.一种高效产透明质酸工程大肠杆菌，其特征在于其分类命名为大肠埃希氏菌 (.Escherichia co/i )，保藏号为 CGMCC No. 3926。
2.权利要求1所述的高效产透明质酸工程大肠杆菌的制备方法，其特征在于按以下步骤进行(1)构建含有透明质酸合成酶基因的表达载体PQEpmHas,用PCR扩增方法克隆源自 ^ ^sWiMM (.Pasteurella multoeida subsp. ifo/iocit/a)中的透明质酸合成酶基因 {Pasteurella muliociVahyaluronic acid synthase PmHas),其 PCR 扩±曾克隆所用弓 |物设计如下上游引物 pmHas Pl 为 5' -TAgfi^r<XATGAACACATTATCACAAGCAAT~3'(序列表中 SEQ ID No 3)，含汉H I位点GGATCC和起始密码子ATG ；下游引物为风 汤计2 为 5' -TA6^g67TTTATAGAGTTATACTATTAATAAT-3’ (序列表中 SEQ ID No 4)，含Sac I位点GAGCTC和终止密码子TAA ；PCR的模版为多杀巴斯德菌菌株ATCC 15742的基因组DNA，扩增产物经汉a H I和 I双酶切后，连接入商用载体PQE80L中的相同酶切位点，插入片段经DNA测序确证无突变后，将所获载体命名为PQEpmHas，基因为(序列表中SEQ ID No:l)；(2)构建含尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因的表达载体pQEkfiD，用PCR扩增方法克隆源自源于大肠杆菌(fecAericAia ColirE. cWi)菌株k5中鸟苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因(K5 capsule gene D，i/iD)，扩增的引物设计如下上游引物IfiD Pl: 5' - TGGAGArmTGTTCGGAACACTAAAAATAACT G-3，(序列表中 SEQ ID No:5)，含Bgl II位点AGATCT，和起始密码子ATG)；下游引物IfiD P2 5' -TT^TT^gTTAGTCACATTTAAA CMATCGCGAC-3'(序列表中 SEQ ID No 6)，含Xho I位点CTCGAG和终止密码子TAA ；PCR的模版为大肠杆菌菌k5菌株ATCC 23500的基因组D N A，成功扩增并纯化的产物，給B gl II和损ο I双酶切后，连接入Qiagen公司的商用载体pQE80L的汉警H I和 Sal I位点，所得载体经DNA测序分析确证插入片段无突变后，所获载体命名为pQEkfiD， 相应基因命名为A/iD基因(序列表中SEQ ID No:2)；(3)构建大肠杆菌中共同表达透明质酸合成酶基因和含有尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因的重组载体根据构建好的pQEkfiD载体的DNA序列设计PCR引物，扩增T5启动子驱动i/iD表达的片段T5:kfiD，引物序列设计如下上游引物 T5kfiD Pl 5' -TAGAGCTCCCTTTCGTCTTCACrTCGAGA-3'(序列表中 SEQ ID No: 7)，该引物含有fee I位点，GAGCTC，其中下标G表示将原始pQESOL载体中C突变为 G,以消除其损ol位点，CTCGAG ；下游引物 T5kfiD P2 5' -TACTCGAGTTCTGAGGTCATTACTGGATCT-3'(序列表中 SEQ ID No:8)，该引物含损ο I site, CTCGAG ；PCR的模版用pQEkfiD载体，纯化的T5 kfiD扩增产物，首先连接入pGEM-T-Vector 并转化大肠杆菌JM109菌株，获中间载体pT-T5KfiD，该载体中T5 kfiD (序列表中SEQ ID No 9)片段，经测序分析证实核苷酸顺序无突变后，该插入pT-T5KfiD片段经Sac I和Xho I双酶切后，连接入表达载体pQEpmHas的fee I和I位点而获pfflfes和A/iD基因在大肠杆菌中共表达的重组载体PQHK ；(4)表达载体pHK的构建用德国MoBiTec公司的革兰氏阴性菌宿主广谱质粒pBBR122的DNA序列(GenBank No. Y14439)设计引物上游引物 PBBR Pl 5' -TTTGGTGTCGACCTTGCCAGCCCGTGGATATGTGG-3'(序列表中 SEQ ID NO 10)；含有fe/I酶切位点，GTCGAC ；下游引物 PBBR Pl 5' -TTAGGTGTCGACTCTGTGATGGCTTCCATGTCGGCAG-3'(序列表中 SEQ ID NO 11)，含有 SalI 酶切位点，GTCGAC ；用上述引物扩增质粒PBBR122中包含其复制位点及卡那霉素抗性基因在内的片段， PCR 扩增的参数为95°C、2 min，1 个循环；94°C、30s，55°C>30s, 72°C、3min，25 个循环；72°C、10 min 1个循环，纯化3. 2 kb扩增产物，用fe/ I酶解后，加入连接酶让其自连， 自身连接产物转化大肠杆菌JM109菌株，并用卡那霉素筛选获质粒pRP (序列表中SEQ ID NO 12)，提取质粒pRP，经SalI 酶解后，连接入上述能在大肠杆菌中共表达pmHas和i/iD 基因的PQHK的损ol位点，获得在革兰氏阴性菌中共表达^ffife1S和i/iD来合成透明质酸的表达载体PHK ；(5)将该重组载体pHK转入大肠杆菌JM109中获得所述的高效产透明质酸的工程大肠杆菌 PHK/JM109 CGMCC NO: 3926。
全文摘要
本发明是高效产透明质酸工程大肠杆菌及其制备方法。该工程大肠杆菌通过构建含有透明质酸合成酶基因Has和含有尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因在大肠杆菌中共同表达的重组表达载体转化大肠杆菌而获得。本发明所提供的高效产透明质酸工程大肠杆菌是pHK/JM109 CGMCC No.3926。用本发明的工程大肠杆菌能产透明质酸2g～2.5g/L,比现有技术通过大肠杆菌中表达革兰氏阳性链锁状球菌HA合成基因spHas获得的最高HA产量提高近10倍多。
文档编号C12N15/70GK102154190SQ20111000621
公开日2011年8月17日 申请日期2011年1月13日 优先权日2011年1月13日
发明者尚海丽, 杨发祥, 毛自朝, 程倩 申请人:云南省微生物发酵工程研究中心有限公司