专利名称：具有改变的生长特性的植物及其制备方法
具有改变的生长特性的植物及其制备方法本申请是申请日为2004年9月3日、申请号为20048002M44. 5、发明名称为“具有改变的生长特性的植物及其制备方法”的发明专利申请的分案申请。本发明广义上涉及分子生物学领域，涉及改变植物生长特性的方法。更具体的说， 本发明涉及通过调节植物中B型CDK(细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶)核酸的表达，和/或通过调节植物中B型CDK蛋白的活性和/或水平来改变植物生长特性的方法。本发明也涉及具有B型CDK核酸的已调节的表达和/或B型CDK蛋白的已调节的活性和/或水平的植物，该植物相对于对应的野生型的植物具有改变的生长特性。本发明还提供了新的筛选方法，鉴定相对于对应的未突变CDK具有提高了 CDK活性的CDK突变体。本发明同时提供了新的筛选方法，鉴定能够结合CKI (细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶的抑制剂)的无活性CDK。 本发明还提供通过本发明的筛选方法可获得的CDK突变体。世界人口的不断增长和农业可用耕地供应的不断减少加速为了提高农业效率的农业研究。传统的农作物和园艺改良方法是利用选择性繁殖技术鉴别具有期望特性的植物。但是，这种选择性繁殖技术具有许多缺点，即一般来说这些技术是劳动密集型的，产生的通常具有不同遗传组成的植物从亲本植物传代后不一定总能得到期望的性状。分子生物学的进展使人类可以改变动物和植物的种质。植物基因工程承担着遗传物质(一般以DNA 或RNA的形式)的分离和操纵、和该遗传物质的随后导入的使命。这种技术具有提供具有各种改良经济、农艺或园艺特性的植物的能力。具体经济利益的一个特征就是产量。通常产量定义为作物的有经济价值的可测量产物。其可从量和/或质上定义。产量直接依赖与几个因素，例如器官的数量和大小、植物的结构(例如分枝的数目)、种子产量及其它。根的生长、养分的摄取和逆境耐性也是决定产量的重要因素。植物通常面临的压力包括环境(非生物的)压力(例如异常高或低温引起的温度压力；养分不足导致的压力；缺水(干旱)导致的压力)和生物压力(其他植物(杂草)、动物性害虫和病原体施加给植物的)。不仅通过优化上述因素中的一种可以增加作物的产量，而且通过改变植物内在的生长机制也可以增加作物的产量。植物内在的生长机制是总称为“细胞周期”的高度有序的事件。细胞周期的进行是所有多细胞生物生长和发育的基础，对于细胞增殖至关重要。在酵母、哺乳动物和植物中细胞周期的主要组分是高度保守的。一般细胞周期分为下列有序的时期G0-G1-S-G2-M。 DNA的复制或合成一般发生在S期(“S”代表DNA的合成)，染色体的有丝分裂分离发生在 M期(“M”是有丝分裂)，和分裂间期(intervening gapphase) Gl (DNA复制前的细胞生长时期)和G2 (DNA复制后细胞准备分裂的时期)。M期的最后步骤，胞质分裂后细胞分裂完成。离开细胞周期的细胞和周期中静止的细胞称为处于GO期。这个时期内的细胞能够被刺激在Gl期进入细胞周期。G1、G2和GO中的“G”表示“间期”。细胞周期程序的完成使每一子细胞在细胞分裂中得到亲代基因组的全部备份。细胞分裂被两个主要的细胞周期事件控制，即DNA合成的起始和细胞分裂的起始。这些关键事件间的每个转化是由特殊蛋白质复合体(参与DNA复制和分离)代表的关卡控制的。在哺乳动物和植物细胞中，G1/S边界上DNA合成的必需基因的表达由转录因子中的 E2F家族控制(La Thangue, 1994 (Curr. Opin. Cell Biol. 6 (3)，443-450)； Muller 等人，2001 (Genes Dev. 15 (3)，267-285) ；De Veylder 等人，2002 (EMBO J. 21(6), 1360-1368))。进入细胞周期由整合信号并激活细胞周期基因转录的E2F/Rb复合体调节/ 引发。细胞周期的不同阶段的转化和之后细胞周期的进行由不同的异源二聚化的丝氨酸/ 苏氨酸蛋白激酶的形成和激活驱动，所述丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶一般指细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(CDK)。这些激酶活性的首要条件是和具体周期蛋白的物理结合，激活的时间选择主要由周期蛋白的表达决定。周期蛋白的结合导致相关CDK的N末端部位(lobe)的构像改变，导致复合体的定位和底物特异性。当与周期蛋白结合时，单体CDK被激活，并因此具有激酶的活性。在细胞周期中，细胞周期蛋白水平波动，并因此体现出一个决定CDK激活时间的主要因素。在细胞周期中，含有细胞周期蛋白和CDK的这些复合体的周期性活动介导细胞周期转化(关卡)的时间调节。调节CDK活性的其他因素包括CDK抑制剂(CKI或 ICK、KIP、CIP、INK)，CDK 激活激酶(CAK)，CDK 磷酸酶(Cdc25)和 CDK 亚基(CKS) (Mironov 等人，1999 (Plant Cell 11 (4)，509-522) ；Reed 1996 (Progressin Cell cycle Research2, 15-27))。在植物中，一直研究两个主要⑶K类别，已知的A型和B型⑶K。A型⑶K调节Gl 至S和G2至M的转化，而B型⑶K似乎仅控制G2至M的关卡(Hemerly等人，1995 (ΕΜΒ0 J. 14(16) ,3925-3936) ；Magyar 等人，1997 (Plant Cell 9 (2), 223-235) ；Porceddu 等人， 2001 (J. Biol. Chem. 276 (39) 36；354_36360))。另外，已有 C 型 CDK和 CDK 激活激酶(CAK)存在的报道(Magyar 等人，1997 (Plant Cell 9 (2), 223-235) ；Umeda等人，1998 (Proc Natl Acad SciUSA. 95 (9)，5021-5026. Joubes 等人，2001 (Plant Physiol. 126 (4)，1403-1415))，和 D 型、E 型和 F 型 CDK 存在的报道(Vand印oele 等人，2002 (Plant Cell 14 (4)，903-916))。影响植物中细胞周期和由此改变植物的各种生长特性的能力将在多个领域中有许多应用，例如作物增殖、植物繁殖、观赏植物生产、aboriculture、园艺、林业、藻类或植物生产(例如用作生物反应器，例如药品、抗体或疫苗的物质的生产，或有机废物生物转化或用作高产量藻类和植物的养料)。现已发现调节在植物中B型⑶K核酸的表达，和/或调节在植物中B型CDK蛋白的活性和/或水平，提供具有改变的生长特性的植物。因此，根据本发明的第一个实施方式， 本发明提供了改变(改良)植物生长特性的方法，包括调节植物中B型CDK核酸的表达，和 /或调节在植物中B型CDK蛋白的活性和/或水平，其中改变的生长特性选自提高生长速度、增加产量和改变的结构。调节B型⑶K核酸的表达即提高或增加B型⑶K基因/核酸的表达。调节B型⑶K 蛋白的活性和/或水平即增加活性(可能是，或可能不是增加B型CDK蛋白水平的结果)。 相对于对应的野生型植物中B型CDK的表达、活性和/或水平，变化了的表达、活性和/或水平被改变。在本领域中，获得提高或增加基因表达或基因产物的方法已被详尽记载，包括例如通过强启动子驱动的超表达、转录增强子或翻译增强子的使用。改变(更具体的，改良)植物生长特性的优选方法包括在植物中导入和表达B型 CDK核酸，所述核酸编码B型CDK蛋白。该核酸可通过，例如转化导入植物中。因此，根据本发明的一个优选方面，提供了改良植物生长特性的方法，包括向植物中导入B型CDK核酸的可表达形式，所述B型CDK核酸编码B型CDK蛋白，其中改良的生长特性是均相对于对应的
6野生型植物，且为生长速度的提高，产量的增加和改变的结构中的任意一种或几种。本发明中“B型CDK核酸”定义为编码蛋白质的核酸/基因，其具有⑴没有错配，或在从左向右数的2位和/或4位上有错配的PPTALRE基序；(ii)催化激酶结构域；和 (iii) T 环激活激酶结构域(Magyar 等人，1997 (Plant Cell 9 (2), 223-235) 本领域中的普通技术人员使用常规技术可以容易的确定以上(i)到(iii)中定义的基序和结构域。激酶分析可以如Cockcroft等人，2000 (Nature，405 (6786)，575-579) 的描述实施。该分析包括在液氮中研磨植物材料，在合适的缓冲液(例如Iml的50mM的 Tris-HClpH7. 5,75mM NaCl, 15mM EGTA, 15mM MgCl2, ImM二硫苏糖醇，0· 1 % Tween 20，IX完全Tm蛋白酶抑制剂，ImM NaF, 0. 2mM NaV，2mM焦磷酸钠，60mMβ -甘油磷酸)中重悬。然后将悬浮液勻浆四次，每次30秒，勻浆之间在冰上放置30秒。接着，上清液与20 μ 1蛋白 A琼脂糖凝胶(50%悬浮)在4°C孵育30分钟。该上清液与1 μ 1抗血清(针对⑶C2b蛋白的羧基端多肽，如 Setiady 等人，1996 (Plant Cell Physiology 37 (3)，369-376)在冰上孵育2小时，然后加入20 μ 1蛋白A琼脂糖凝胶，样品在4°C旋转1小时。样品用激酶缓冲液(50mMTris-HCl pH7. 5，IOOmM NaCl，5mM EGTA, ImM DTT)洗涤 2 次，在 15 μ 1 分析缓冲液 (50mM Tris-HCl pH7. 5, IOOmM NaCl, 5mMEGTA, IOmM MgCl2, ImM DTT，ImM NaF，0.2mM 钒酸钠，2mM焦磷酸钠，25πιΜβ-甘油磷酸，0. 5mM组蛋白Hl作为底物，0. 5mM PMSF，和74kBq[ γ 32P ATP ( > 185TBq mmol-1)每15 μ 1反应物)中重悬，并在室温下孵育30分钟。该反应通过加入凝胶载样缓冲液停止，可以使用SDS-PAGE分析样品，使用磷光影像分析仪(Molecular Dynamics)定量。本文中定义的术语“B型CDK氨基酸”是任何氨基酸序列，当其用于构建例如
图1 所描述的CDK系统发生树时，倾向于聚簇在B型CDK周围而非其他CDK群周围。本领域的普通技术人员使用产生这种系统发生树的已知技术和软件，例如GCG、EBI或CLUSTAL包，使用默认值，能够容易的确定任何讨论的氨基酸序列是否符合“B型CDK氨基酸”的定义。构建这种系统发生树后，聚簇在B型CDK群中的序列将被认为符合“B型CDK”的定义，并将用于进行本发明的方法。另外或或者，本文中定义的术语“B型CDK氨基酸”包括(i)没有错配，或在从左向右数的2位和/或4位上有错配的PPTALRE基序；(ii)催化激酶结构域； (iii) T 环激活激酶结构域(Magyar 等人，1997 (Plant Cel 19 O)，223-235)。下表1显示代表性的没有错配，或在从左向右数的2位和/或4位上有错配的B 型CDK和PPTALRE基序。表 权利要求
1.改良选自增加产量、增加生长速度和改变的结构中的一种或多种植物生长特性的方法，所述方法包括在植物中增加编码B型CDK蛋白的核酸的表达，和/或增加植物中B型 CDK蛋白的活性和/或水平。
2.根据权利要求1中所述的方法，其中所述增加表达是通过在植物中导入和表达B型 CDK核酸来实现。
3.根据权利要求1或2中所述的方法，其中所述B型CDK来自植物、藻类或真菌来源。
4.根据权利要求3中所述的方法，其中所述来自植物的B型CDK优选来自双子叶植物， 进一步优选来自十字花科，更优选该核酸序列来自鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述B型⑶K是1类B型⑶K，优选来自鼠耳芥的⑶K Bl ；1或来自鼠耳芥的⑶K Bl ；2。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述B型⑶K是2类B型⑶K，优选来自鼠耳芥的CDK B2 ；2。
7.根据权利要求5中所述的方法，其中所述CDKBl ； 1核酸是SEQID NO :1代表的序列或其部分序列，或可以与其杂交的核酸序列，并且其中CDK Bl;l蛋白是SEQ ID NO :2代表的序列或其同源物、衍生物或活性片段。
8.根据权利要求5中所述的方法，其中所述⑶KBl ;2核酸是SEQ ID NO :3代表的序列或其部分序列，或可以与其杂交的核酸序列，并且其中CDK Bl ;2蛋白是SEQ ID NO :4代表的序列或其同源物、衍生物或活性片段。
9.根据权利要求6中所述的方法，其中所述⑶KB2;2核酸是SEQ ID NO :5代表的序列或其部分序列，或可以与其杂交的核酸序列，并且其中CDK B2 ；2蛋白是SEQ ID NO 6代表的序列或其同源物、衍生物或活性片段。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述B型CDK是选自下列的核酸变体或氨基酸变体(a)B型CDK核酸/基因的功能部分；(b)能够与B型CDK核酸/基因杂交的序列；(C)B型CDK核酸/基因的可变剪接变体；(d)B型CDK核酸/基因的等位基因变体；(e)B型CDK蛋白的同源物、衍生物或活性片段；(f)突变的B型CDK。
11.根据权利要求5至10中任一项所述的方法，其中所述⑶KBl ；1核酸的表达是由在未成熟的膨胀组织中有活性的启动子驱动的，优选所述启动子是苹果青霉素启动子。
12.根据权利要求5至10中任一项所述的方法，其中所述⑶KBl ；2核酸的表达和其中所述CDK Β2 ；2核酸的表达是由组成型启动子驱动的，优选其中所述启动子是G0S2启动子。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述增加产量包括以下中的一种或多种相对于对照植物，增加面积、增加圆锥花序的数量、增加高度、增加种子的数量、增加饱满种子的数量、增加种子的总重量、增加千粒重(TKW)和增加收获系数。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述改变的结构包括以下中的一种或多种地上面积的增加、圆锥花序数量的增加和高度的增加。
15.可由权利要求1至14中任一项所述的方法得到的植物。
16.构建体，包含(a)编码B型CDK蛋白的B型CDK基因/核酸；或(b)编码⑶K突变体的核酸，该⑶K突变体包含表A中所示的七个氨基酸位置改变中的至少一个，或表B中所示的八个氨基酸位置改变中的至少一个；(c)能够驱动(a)或(b)的核酸表达的一个或多个控制序列；和任选(d)转录终止序列。
17.根据权利要求16中所述的构建体，其中所述(a)中的核酸是SEQID N0:3代表的 CDK Bl ;2核酸或其部分，或可以与其杂交的核酸序列，并且所述核酸编码CDK Bl;2蛋白， 所述蛋白是SEQ ID NO :4代表的序列或其同源物、衍生物或活性片段。
18.根据权利要求16中所述的构建体，其中所述(a)中的核酸是SEQID NO :5代表的 CDK B2;2核酸或其部分，或可以与其杂交的核酸序列，并且所述核酸编码CDK B2;2蛋白， 所述蛋白是SEQ ID NO :6代表的序列或其同源物、衍生物或活性片段。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的构建体，其中所述的控制序列包含组成型启动子，优选是G0S2启动子。
20.生产具有选自增加产量、增加生长速度和改变的结构中的一种或多种的改良的植物生长特性的转基因植物的方法，该生长特性相对于对应的野生型植物的生长特性而被改良，所述方法包括以下步骤(a)在植物或植物细胞中导入B型CDK基因/核酸；或(b)编码CDK突变体的核酸，该CDK突变体包括表A中显示的七个氨基酸位置改变中的至少一个；(c)在促进再生和成熟植物生长的条件下培养所述的植物细胞。
21.具有选自增加产量、增加生长速度和改变的结构中的一种或多种的改良植物生长特性的转基因植物，其特征在于所述植物相对于对应的野生型植物，在植物中具有B型CDK 核酸的增加表达，和/或植物中B型CDK蛋白的增加的活性和/或水平。
22.根据权利要求21中所述的转基因植物，其中所述植物是单子叶植物。
23.CDK B型核酸或CDK B型氨基酸在改良植物的生长特性中的应用，所述生长特性选自增加产量、增加生长速度和改变的结构中的一种或多种。
24.用作生长调节物的组合物，包含SEQID NO :2、SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 6代表的蛋白质，或前述序列中任一个的同源物、衍生物或活性片段。
25.鉴定相对于对应的未突变植物CDK，具有提高的CDK活性的突变植物细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(CDK)的筛选方法，所述方法包括以下步骤(a)提供植物来源的CDK突变体；(b)鉴定细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶的抑制剂(ICK)不反应的突变体；(c)鉴定具有细胞周期蛋白结合活性的突变体；并且可选地接有，(d)步骤(b)和(c)中得到的突变体的酵母互补测试。
26.鉴定基本没有活性，但能够结合植物ICK的植物⑶K的筛选方法，其包括以下步骤(i)提供植物来源的CDK突变体；( )鉴定植物来源的ICK结合的突变体；和(iii)鉴定非细胞周期蛋白结合的突变体。
27.根据权利要求25或沈中所述的筛选方法，其中所述CDK突变体由以下步骤提供(i)提供野生型植物CDK ；和( )在至少一个氨基酸位置上突变所述⑶K。
28.根据权利要求25或27中所述的筛选方法可得到的突变CDK，其中所述突变CDK如表A所示。
29.根据权利要求沈或27中所述的筛选方法可得到的突变CDK，其中所述突变CDK如表B所示。
30.分离的核酸分子，其包含(a)SEQ ID N0:9、SEQ ID NO 10,SEQ ID NO =IUSEQ ID NO :12 禾口 SEQ ID NO :13 中任一个代表的CDK突变体的编码核酸；(b)SEQID NO :9,SEQ ID NO 10,SEQ ID NO =IUSEQ ID N0:12 禾口 SEQ ID NO :13 中任一个代表的CDK突变体的同源物、衍生物或活性片段的编码核酸，该同源物、衍生物或活性片段包含表A中所示的七个氨基酸位置改变中的至少一个，或表B中所示的八个氨基酸位置改变中的至少一个；(c)能够与上面(a)或(b)中的核酸杂交的核酸，其中该杂交序列编码的氨基酸包含表A中所示的七个氨基酸位置改变中的至少一个，或表B中所示的八个氨基酸位置改变中的至少一个；(d)由于遗传密码子所致的上面(a)至(c)的核酸的简并核酸；(e)(a)至(d)的核酸的等位基因变体，该等位基因变体编码的氨基酸包含表A中所示的七个氨基酸位置改变中的至少一个，或表B中所示的八个氨基酸位置改变中的至少一个；和(f)(a)至(e)的核酸的可变剪接变体，该可变剪接变体编码的氨基酸包含表A中所示的七个氨基酸位置改变中的至少一个，或表B中所示的八个氨基酸位置改变中的至少一个。
31.⑶K突变体，包含(a)SEQ ID N0:9、SEQ ID NO 10,SEQ ID NO =IUSEQ ID NO :12 禾口 SEQ ID NO :13 中任一个代表的氨基酸；和(b)SEQID NO :9,SEQ ID NO :10,SEQ ID NO =IUSEQ ID NO :12 禾口 SEQ ID NO :13 代表的氨基酸的片段，该片段包含表A中所示的七个氨基酸位置改变中的至少一个，或表B中所示的八个氨基酸位置改变中的至少一个。
全文摘要
本发明涉及通过调节植物中B型CDK核酸的表达，和/或通过调节植物中B型CDK蛋白的活性和/或水平来改变植物生长特性的方法。本发明也涉及具有改变的生长特性的转基因植物，该植物相对于对应的野生型的植物中的表达、活性和/或水平，具有调节的植物中B型CDK核酸的表达，和/或调节的B型CDK蛋白的活性和/或水平。本发明还提供了新的筛选方法，鉴定相对于对应的未突变CDK具有提高了CDK活性的CDK突变体。本发明同时提供了新的筛选方法，鉴定能够结合CKI(细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制剂)的无活性CDK。本发明还提供通过本发明的筛选方法得到的CDK突变体。
文档编号C12N15/82GK102174545SQ20111000620
公开日2011年9月7日 申请日期2004年9月3日 优先权日2003年9月5日
发明者V·弗兰卡德, V·米罗诺夫, W·布罗科特, Y·哈茨菲尔德 申请人:作物培植股份有限公司