专利名称：一种利用RNAi培育抗棉铃虫植物的方法
技术领域：
本发明涉及一种培育抗棉铃虫植物的方法，具体涉及ー种利用RNAi培育抗棉铃虫转基因植物的方法。
背景技术：
蜕皮调节转录因子是广泛存在于多种昆虫中、调控幼虫蜕皮过程中相关基因表达的重要功能蛋白，在昆虫蜕皮调控中起着十分重要的作用。蜕皮调节转录因子蛋白属于核受体超家族成员，现已克隆和鉴定的该类蛋白主要有果蝇的DmHR3、家蚕的BmHR3、烟草天蛾的 MHR3、大蜡螟的 GmHR3 和棉铃虫的 HHR3(Zhao et al.，Insect Mol Biol, 13(4)407-412. 2004)等。在昆虫的生长发育过程中，若蜕皮调节转录因子表达被抑制，则昆虫不能完成正常蜕皮过程，最终导致幼虫死亡。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是近年来发现的一种新的基因调控机制,它利用RNA序列匹配，专一地识别靶基因，在转录水平、转录后水平或翻译水平抑制靶基因表达，已被广泛用于基因功能研究、疾病治疗和农业应用，显示了广阔的利用前景。植物介导的昆虫重要靶标蛋白基因RNAi技术的发展表明，植物内源小RNA可能与植物生长发育调控和抗虫性有关(Mao et al.，Nat Biotech, 25 (11) :1307-1313. 2007 ；Baum et al.，NatBiotech，25 (I I) :1322-1326. 2007)，为利用RNAi技术控制农业害虫提供了重要的科学依据。棉铃虫Helicoverpa armigera(Hubner)是重要的农业害虫，危害棉花、玉米、小麦等多种农作物。尽管种植抗Bt棉品种，使棉铃虫得到有效控制，但由于害虫抗性的不断发展，使潜在的害虫爆发风险越来越大，亟待发展新的防治方法。通过RNAi技术来抑制棉铃虫的正常生长发育有可能成为极具潜力的害虫防治技木。所有已公开发表的文献表明，或已克隆了棉铃虫的蜕皮调节转录因子HHR3基因，或通过RNAi技术抑制了棉铃虫P450单加氧酶基因CYP6AE14等的表达，但没有通过植物介导的RNAi技术抑制棉铃虫蜕皮调节转录因子HaHR3的表达或其应用的报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种通过植物介导的RNAi技术抑制棉铃虫蜕皮调节转录因子HaHR3的表达，培育抗棉铃虫植物的方法。本发明ー种利用RNAi培育抗棉铃虫植物的方法，按照下述步骤实施a.克隆棉铃虫蜕皮调节转录因子编码基因HaHR3 ；b.选择HaHR3基因的部分片段构建RNAi中间载体pUCCRNAi_HaHR3sa ；c.将RNAi中间载体pUCCRNAi_HaHR3sa中的HaHR3正反向序列亚克隆至植物表达载体pCAMBIA2300-35S-0CS中，构建HaHR3基因的正反向RNA干扰载体pCAM-RNAi_HaHR3 ； d.将含有HaHR3基因片段的RNA干扰载体pCAM-RNAi_HaHR3导入农杆菌菌株，再经农杆菌介导转入植物细胞或组织，得到含有HaHR3基因片段的植物细胞或组织；
e.将含有HaHR3基因片段的植物细胞或组织再生成植物植株，即得抗棉铃虫的植物。本发明ー种利用RNAi培育抗棉铃虫植物的方法，其中所述农杆菌菌株可以是LBA4404。本发明ー种利用RNAi培育抗棉铃虫植物的方法，其中所述用农杆菌进行转化植物细胞或组织的方法为叶盘法。本发明ー种利用RNAi培育抗棉铃虫植物的方法，其中所述植物为烟草，所述植物细胞或组织为烟草细胞或组织。本发明ー种利用RNAi培育抗棉铃虫植物的方法，其中所述植物为棉花，所述植物细胞或组织为棉花细胞或组织。 本发明的有益效果通过植物转基因干扰载体pCAM-RNAi_HaHR3构建的转基因植物能表达棉铃虫蜕皮调节转录因子HaHR3基因的dsRNA，取食表达dsRNA的转基因植物可影响棉铃虫的体重、蜕皮、化蛹、羽化等各方面。因此,通过植物介导的RNAi技术培育抗棉铃虫植物的方法，能有效干扰棉铃虫生长发育相关基因，可以成功防治棉铃虫，在农业生产上有广泛的应用前景。
图I为干扰载体pUCCRNAi。图2 为 RNA 干扰载体 pCAM-RNAi-HaHR3。图3为转基因烟草对棉铃虫化蛹的影响对照图。
具体实施例方式下面通过实施例进ー步阐述本发明。步骤一、棉铃虫蜕皮调节转录因子编码基因HaHR3的克隆提取棉铃虫5龄幼虫的总RNA，经电泳和紫外检测确定其质量后，保存备用。根据GenBank中登陆的棉铃虫蜕皮调节转录因子HHR3基因序列(AF337637)，设计了一对特异引物用于目的基因的PCR扩增，其中，PI : 5 ’ -ATGAACAACAACCAGTTCCACG-3 ’，P2 :5’ -TTAACCGTGGGTGTAGTCCAGG-3’。用该对引物和棉铃虫总RNA为模板进行RT-PCR，扩增得到一个约为1600bp的DNA片段。RT-PCR产物纯化后克隆到pMD19_T载体上，挑取阳性克隆进行PCR鉴定，得到了同预期大小相当的片段。挑取PCR鉴定和酶切验证正确的阳性克隆6个进行测序分析，所得结果一致。由此，获得了棉铃虫蜕皮调节转录因子基因的全序列，其ORF为1671bp，编码556个氨基酸残基，将该基因命名为HaHR3。目前，该基因已经在GenBank中登录，登录号为F J009448。HaHR3与已报道的棉铃虫HHR3基因同源性最高(98%)，与大蜡螟(P49868)、烟草天蛾(Q08882)、杉色卷蛾(AAC47163)、家蚕(NP_001037012)中的蜕皮调节转录因子也高度同源，其一致性分别为98%、93.3%、87. 3%,79. 9%和 71. 2%。步骤ニ、HaHR3干扰中间载体pUCCRNAi_HaHR3sa的构建为了便于构建双向RNA干扰载体，设计引物克隆HaHR3的一段特异DNA(460bp)作为干扰片段。正向序列引入Xho I和Bgl II酶切位点，其上游引物HaHR3-RNAi-Pl :5’-ccCTCGAGATGAACAACAACCAGTTCCACGAT-3’ 下游引物 HaHR3_RNAi_P2 5，-gaAGATCTCACGCAGGCTTTATTCCGTGGACA-3’。以pMD19_T/HaHR3重组质粒为模板，用上述弓I物进行PCR扩增，获得两端带有Xho I和Bgl II位点的HaHR3干扰片段。先将这ー PCR产物克隆到pMD18-Tsimple上，测序验证后，再用Xho I和Bgl II双酶切后亚克隆到pUCCRNAi (见图I)干扰载体上的相应位点，构建成重组质粒pUCCRNAi-HaHR3s。对此重组质粒进行Xho I和Bgl 11双酶切，切出了一条约为460bp的条带，表明HaHR3基因干扰片段正向连到pUCCRNAi载体上。同样，反向序列中引入Sal I和Bam HI酶切位点，其上游引物HaHR3_RNAi_P3 5，-gcGTCGACATGAACAACAACCAGTTCCACGAT-3’ 下游引物 HaHR3_RNAi_P4 :5’ -cgGGATCCCACGCAGGCTTTAITCCGTGGACA-3’。PCR扩增获得两端带有Sal I和BamHI位点的HaHR3干扰片段。将这ー PCR产物克隆到pMD18-Tsimple上，经测序验证后，进行Sal I和BamH I双酶切，切下的片段亚克隆至重组质粒pUCCRNAi-HaHR3s 上，构建成含有HaHR3正反向序列的RNA干扰载体pUCCRNAi-HaHR3sa。用Sal I和BamH I双酶切鉴定HaHR3基因是否反向插入到pUCCRNAi-HaHR3s 重组质粒中。步骤三、HaHR3植物转基因干扰载体pCAM-RNAi_HaHR3的构建将构建的RNA干扰载体pUCCRNAi_HaHR3sa中的HaHR3正反向序列用Sal I和Xho I双酶切，亚克隆至经同样双酶切的植物表达载体pCAMBIA2300-35S-0CS中，构建成由35S启动子调控的HaHR3基因的正反向RNA干扰载体pCAM-RNAi_HaHR3 (见图2)。将构建成的植物转基因干扰载体pCAM-RNAi-HaHR3用Sal I和Pst I进行双酶切验证，切出了 1300bp的条带，表明HaHR3基因干扰片段的正反向序列已成功地插入到植物表达载体PCAMBIA2300-35S-0CS中，可以用于后续的转基因操作。步骤四、农杆菌介导转化法转化烟草选用的烟草为三生烟(Nicotiana tobacum cv. Samsun NN),采用叶盘转化法进行转化。首先将构建的载体pCAM-RNAi-HaHR3用冻融法转化农杆菌LBA4404，从农杆菌中提取质粒进行PCR检测正确后，含有干扰载体pCAM-RNAi-HaHR3的农杆菌即可用于转化烟草。先后用75%こ醇、20%的84消毒液、2. 5% NaCLO溶液浸泡消毒健康幼嫩的三生烟草叶片，再将消毒叶片剪成Icm2大小，叶面朝下放置于预培养基中，25°C暗培养叶盘48h。将含有干扰载体pCAM-RNAi-HaHR3的农杆菌LBA4404接种于YEB培养基中，28°C培养至0D_=0. 6-1. 0，浸染预培养48h的叶盘15min。将叶盘转移到灭菌滤纸上，吸干叶盘表面菌液后转移到共培养基上，叶面朝下，25°C暗培养48h。将叶盘转移到抗性筛选培养基，25°C，光周期14/24h培养ー个月左右，每10天更换一次新鲜培养基至出现再生小苗。将分化出的小苗转移到生根成苗培养基上，28°C，光周期14/24h培养，至再生苗根系旺盛后取出，自来水冲掉再生苗根上的固体培养基，转移至土钵中培养即可。步骤五、转基因烟草的分子生物学检测(I) PCR 检测用CTAB法提取组培获得的烟草苗的基因组DNA，然后根据步骤ニ所述的引物Pl和P2进行PCR扩增，得到460bp大小DNA片段，将这一片段然克隆到T载体后测序验证，结果显示其序列和步骤一中的棉铃虫蜕皮调节因子HaHR3基因序列完全吻合，说明HaHR3基因片段已经整合到烟草基因组中，初步确定抗性烟草苗为阳性植株。(2) RT-PCR 检测
用Trizol提取PCR阳性株和对照株的RNA,用全式金反转录试剂盒反转录成cDNA第一条链，然后用步骤ニ所述的引物Pl和P2进行PCR扩增，RT-PCR结果显示阳性株在400到500之间有一条带，而对照烟草植株没有。说明整合到烟草基因组中的目的基因已经发生转录。(3) Southern 杂交验证选取PCR阳性及测序正确的转基因植株进行Southern blot分析，非转基因烟草作为阴性对照。提取每个植株烟草总DNA，HindIII酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，使酶切的DNA片段均匀分布，然后再转膜，将DNA转至尼龙膜。探针标记时以棉铃虫cDNA为模板，采用随机引物法标记干扰片段，以步骤ニ所述的引物Pl和P2扩增HaHR3正向序列片段作为探针。42°C条件下，加入适量探针，进行Southern杂交。杂交后，采用化学发光法检测，使CSPD在杂交膜上均勻分布,最后显影、定影、成像。Southern结果显示HaHR3基因片段已整合到烟草基因组中。
(4) Northern 杂交验证采用invitrogen公司Trizol试剂提取烟草叶片总RNA,电泳和分光光度计检测RNA浓度。取转基因烟草不同株系的RNA，进行10%甲醛变性和I. 2%琼脂糖电泳。电泳后RNA经碱转液转移到尼龙膜上，探针和杂交过程同Southern杂交，但转膜前转膜仪、电泳槽、制胶器等要用双氧水浸泡处理，并用DEPC冲洗干净。Northern结果显示转基因烟草中有HaHR3小分子RNA，而对照烟草植株却没有。步骤六、转基因烟草的生物学活性測定(I)转基因烟草对棉铃虫初孵幼虫的影响用分子检测为阳性的转基因烟草和对照烟草进行棉铃虫初孵幼虫的饲喂实验。在直径5厘米的小培养皿中，放入滤纸，并用水润湿，然后放入剪成规则的直径4厘米的烟草叶圆片和棉铃虫初孵幼虫，每皿ー头；分别设置处理组和对照组，每组30个培养皿，3次重复(即每组共90皿)。从放入棉铃虫时开始统计，分别统计第一天，第三天，第四天，第五天，第六天，第七天处理组和对照组的棉铃虫体重和死亡情況。下表统计了棉铃虫初孵幼虫取食烟草叶片平均体重的变化情况和死亡率。棉铃虫初孵幼虫取食烟草叶片平均体重和死亡率变化表
处理处理组对照组
せ间平均体重(g) 死亡率(%) 平均体重(g) 死亡率(°/c)
第一天0.031±0.0060.000. 030±0.0060.00
第三天0.039±0.0102. 220. 073±0.0082. 22
第四天0.046±0.0098.890. 080±0.0114.44
第五天0.059±0.01724.440.093±0.0164.44
第六天0.059±0.01955.560. 097±0.0134.44
第七天0.060±0.00671.110. 104±0.0134.44
从上表可以看出对照组棉铃虫的体重明显比处理组的增长快，处理组的棉铃虫取食缓慢，到第四天时活动迟缓，停止取食，死亡率开始增加，到第六天第七天大量死亡。而对照组死亡率却没有显著增加，而且体重増加迅速，生命力旺盛。在该实验中还观察到，处理组的棉铃虫幼虫取食转基因烟草叶片会导致蜕皮紊舌し有的幼虫在蜕皮过程中死亡；有的不蜕皮，体重不增加，不长大，活动迟缓，两三天后死亡。有的虽然蜕皮，但是后期活动迟缓，基本不取食，逐渐死亡。而对照组幼虫蜕皮正常。(2)转基因烟草对棉铃虫高龄幼虫的影响进行了棉铃虫高龄幼虫(五龄和六龄)的饲喂实验。用转基因烟草和对照烟草分别饲喂吋，处理组高龄幼虫表现为基本不取食，体重不变，并且常常喜欢把烟草叶片卷起来并把自己藏在其中。对照组继续取食，但是取食量不大，体重増加也不明显。在该实验中还观察到，处理组和对照组相比，处理组有的虫不化蛹；有的虫虽然化 蛹，但蛹特别小而且异常(如图3所示)，这些异常的蛹在后来表现为不能变成成虫，或者变成成虫时一半是蛹一半是成虫，有的成虫翅展明显比对照组的小。以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
权利要求
1.ー种利用RNAi培育抗棉铃虫植物的方法，其特征在于按照下述步骤实施 a.克隆棉铃虫蜕皮调节转录因子编码基因HaHR3； b.选择HaHR3基因的部分片段构建RNAi中间载体pUCCRNAi_HaHR3sa； c.将RNAi中间载体pUCCRNAi-HaHR3sa中的HaHR3正反向序列亚克隆至植物表达载体PCAMBIA2300-35S-0CS 中，构建 HaHR3 基因的正反向 RNA 干扰载体 pCAM-RNAi_HaHR3 ； d.将含有HaHR3基因片段的RNA干扰载体pCAM-RNAi_HaHR3导入农杆菌菌株，再经农杆菌介导转入植物细胞或组织，得到含有HaHR3基因片段的植物细胞或组织； e.将含有HaHR3基因片段的植物细胞或组织再生成植物植株，即得抗棉铃虫的植物。
2.根据权利要求I所述的利用RNAi培育抗棉铃虫植物的方法，其特征在于用农杆菌介导的转化植物细胞或组织的方法为叶盘法。
3.根据权利要求2所述的利用RNAi培育抗棉铃虫植物的方法，其特征在于所述植物为烟草或棉花。
4.根据权利要求I所述的利用RNAi培育抗棉铃虫植物的方法，其特征在于所述植物细胞或组织为烟草细胞或组织。
5.根据权利要求I所述的利用RNAi培育抗棉铃虫植物的方法，其特征在于所述植物细胞或组织为棉花细胞或组织。
全文摘要
棉铃虫蜕皮调节转录因子HaHR3基因是棉铃虫生长发育相关的重要基因。本发明通过克隆棉铃虫HaHR3基因，选择HaHR3基因的部分片段，构建了RNAi中间载体pUCCRNAi-HaHR3sa和植物表达载体pCAM-RNAi-HaHR3，培育出表达HaHR3基因dsRNA的转基因植物，取食这种转基因植物可影响棉铃虫的体重、蜕皮、化蛹、羽化等各方面，可以成功防治棉铃虫，是棉铃虫生物防治的新策略，在农业生产上有广泛的应用前景。
文档编号C12N15/113GK102653761SQ201110052409
公开日2012年9月5日 申请日期2011年3月4日 优先权日2011年3月4日
发明者尹富仕, 张雨良, 徐大伟, 曾洪梅, 杨秀芬, 熊叶辉, 袁京京, 邱德文, 郭立华 申请人:中国农业科学院植物保护研究所