专利名称：一种高产γ-氨基丁酸的生产方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属医药生物与食品工程技术领域，是现代 生物和化学工程与传统发酵工程技术的有机结合，是对目前采用生物技术生产Y-氨基丁酸(GABA)方法的改进。更具体的说是采用从我国北方酸菜中分离选育的短乳杆菌LaciohciBttS brevis CGMCCN0. 3414， 通过生长细胞和休止细胞的生物转化，高效率地生产国际上公认最安全的原料药和保健食品一 Y-氨基丁酸。
背景技术：
γ -氨基丁酸(GABA)也称氨酪酸，是一种非蛋白质组成成份的天然氨基酸，广泛存在于自然界中，是目前研究较为深入的一种重要的抑制性神经递质，它参与多种代谢活动，具有降血压、调节心律失常、改善睡眠、抗焦虑、改善脂质代谢、防止动脉硬化等功效，因此受到越来越多的科学工作者的关注。目前，GABA的生产方法主要有化学合成、植物富集和生物合成三种。其中化学法是以邻苯二甲酰亚氨钾和Y-氯丁氰或丁内酯为原料在强烈条件下反应，所得产物与浓硫酸作用后再经过水解制得产品GABA ；该法速度快，得率高，但成本高，安全性差。植物富集法是从富含GABA的麸皮、茶叶、番茄汁等原料中分离提取。生物法是采用微生物发酵，生物合成方法，此方法生产成本低、无毒、安全且环保，是属低碳、绿色生产方式。现有技术公开的菌株大多都是以大肠杆菌作为发酵GABA的菌株，但其存在安全卫生方面的隐患。最近发现乳酸菌中同样拥有谷氨酸脱羧酶，可以催化底物谷氨酸钠来合成GABA，而且被安全地应用于食品医药行业当中。目前已报道的采用乳酸菌生产GABA的方法有两种一是培养短乳杆菌的同时不断流加底物谷氨酸钠进行发酵，生成积累GABA。目前国内报道采用此法发酵最高水平为 12g/L。二是培养并获得大量富含谷氨酸脱羧酶的短乳杆菌细胞，收集此细胞并制成休止细胞，放入含有谷氨酸钠的缓冲液中，在最佳的谷氨酸脱羧酶酶促反应条件下，将谷氨酸转化为GABA，目前国内外报道生成的GABA可达345. 83mM。
发明内容
本发明巧妙的将上述两种方法有机结合，采用生长短乳杆菌Lac tobacillus brevis (CGMCC NO. 3414)细胞发酵积累GABA和发酵结束后收集的短乳杆菌Zacio力aciBm brevis CGMCC Nq. 3414菌的休止细胞生物转化生产GABA可达100g/L左右，使得菌体产生的谷氨酸脱羧酶充分发挥作用，达到高效率的生产国际上公认最安全的原料药和保健食品一 Y-氨基丁酸。本发明还成功的将短乳杆菌Lactobacillus brevis TCCC CGMCCNO. 3414, 应用于味精厂电点废液生产GABA，实现变废为宝、循环经济。为实现上述目的本发明提供如下的技术方案
本发明的一个目的是公开了高产Y “氨基丁酸(GABA)的生长短乳杆菌S5，其保藏号为 CGMCC N0. 3414。保藏日期2009 年 11 月 06 日。
本发明的短乳杆菌菌株LaciohciBtts brevis，其菌株保藏号为CGMCCN0. 3414， 所具有的生理、生化特征如下
(1)奥林巴斯双目显微镜观察菌株形态，菌株在梯度平板培养时因产酸而形成透明圈， 菌落形态扁平湿润，边缘光滑呈白色不透明状态，镜检观察为短杆状，不运动，无孢子，根据革兰氏染色法鉴定为革兰氏阳性细菌，兼性厌氧型。诱变菌株的筛选平板和菌体形态见附图3，诱变菌株发酵液纸层析色谱图见附图4。从众多诱变菌株中得到一支产GABA较高的菌株，命名为菌株S5，由图可见S5菌株对应的色斑颜色最深，产生的GABA的量最多。然后利用液相色谱仪进行定量分析。S5菌株发酵液HPLC图见附图5。如图所示，S5菌株发酵后其发酵液经HPLC检测显示，样品中含有的少量杂质在最初几分钟被冲出，iaiiin后出现衍生剂的峰，16min的时候GABA的峰出现，峰面积为16. 679，GABA的产量为25. 4g/L。( 2 )诱变结果及稳定性试验
将经过初筛、复筛得到的高产菌株S5，进行发酵实验验证，通过五次实验结果分析稳定性良好，无回复突变现象发生。S5菌株经菌株的生理生化试验和16srDNA鉴定为 Lactobacillus brevis TCCC N0. 13007 (CGMCCNci. ；3414)，该菌株短乳杆菌^at/基因序列分析表明，在L. brevis TCCC13007 (CGMCC N0. 3414)中存在两段GAD1, 2.通过PCR扩增测序^ai/,发现GADl的氨基酸序列与已报道的Z. ^reW1S ATCC367和Z. ^reri1S IF012005的同源性分别是99. 8%和99.4%。GAD2的氨基酸序列与已报道的Ζ.知eta、ATCC367, L. brevis BH2和L. brevis (PK-3的同源性分别是10096，98. 5%和95. 9%，氨基酸序列比较见附图6。本发明的另一个目的是公开了 CGMCC NO. 3414菌株的制备方法，包括如下的步骤
(1)菌株的筛选从我国北方自然腌制的酸菜或汤中，采用双层平板法，即含有5%的碳酸钙和氨基丁酸，30°C培养48h，挑选具有透明圈的菌落进行发酵，采用高效液相色谱检测GABA含量，筛选出一株产量1.4g/L乳杆菌，编号为Si，转接在斜面上于4°C冰箱保藏；
(2)紫外线一吖啶橙诱变取生长良好的短乳杆菌Sl种子液，在紫外照射90s，然后把600 μ L经过紫外诱变的菌悬液接入到含有5mL诱变培养基的试管中30°C避光水浴振荡培养1 ；
(3)N+离子注入诱变取生长良好的短乳杆菌种子液，用浓度8%无菌甘油溶液稀释到 100倍，取100 μ L均勻涂布于无菌平皿上，以无菌风吹干，取镜检无细胞重叠者进行离子注入，用N+离子进行注入，注入能量为30keV，注入剂量为Oions/cm2 2. 0X 1014ions/ cm2,靶室真空度为1. 2X 10_3Pa，注入后取出平皿，以900 μ L浓度为0. 85%生理盐水洗脱， 采用种子培养基进行上，30°C培养3d，其诱变流程图如图2 ；
(4)将种子培养基中的菌株培养液以10%(v/v)接种量转接于驯化培养基中，在30°C 下，150r/min摇床培养12h，在转接于下一驯化培养基中，最后经过分离纯化培养，获得单菌落，然后进行摇瓶发酵实验选取高产菌株；其中的驯化培养基(I) (g/L)玉米糖化液 10，蛋白胨10，酵母浸出粉15，微量元素液15mL谷氨酸60 ；驯化培养基(II) (g/L)葡萄糖 15，酵母粉20，蛋白胨10，谷氨酸70 ；驯化培养基(III) (g/L)在等电点废液中添加葡萄糖 15，酵母粉20谷氨酸60驯化培养
(5)诱变菌种初筛将吖啶橙紫外诱变和N+注入后的菌种在无菌操作条件下，用无菌水稀释到10〃 10_9，取100 μ L涂布到初筛平板上，30°C培养1 3d，将能在含有CaCO3和高浓度GABA生长且有透明圈的单菌落保存与斜面，以备复筛；
(6)诱变菌种复筛将保藏的初筛菌种接于液体种子培养基中进行活化，150r/min摇床培养12h，以10%(v/v)接种量转接于另一瓶液体种子培养基中，150r/min摇床培养12h， 以10%(v/v)接种量，转接于复筛发酵培养基中，30°C静置发酵3d，用纸层析定性分析菌种是否高产GABA，并用HPLC定量分析GABA产量，将高产菌株保存于斜面中，以备分纯；
(7)高产Y-氨基丁酸菌株的获得利用初筛平板从诱变后的菌株中筛选得到一株产 GABA菌株，记为S5菌株，诱变菌株的筛选平板和菌体形态见附图3，诱变菌株发酵液纸层析色谱图见附图4。其中步骤(2)中的诱变培养基为含有lmg/mL吖啶橙，剂量分别为80yL， 100 μ L, 150 μ L, 200 μ L, 250 μ L0步骤(6)中的分纯指的是将高产菌株进行液体培养，并取ImL培养液将其稀释成10_7 10_9后涂布于平板上，30°C培养1 2d，观察菌落形态和革兰氏染色形态，记录并拍照。本发明再一个目的是公开了采用CGMCC NO. 3414制备GABA的方法，其特征在于它是将生长细胞发酵和静态细胞转化相偶联的方法生产GABA，按如下的步骤进行
(1)将该菌株接种于种子培养基中10 12h，30°C生长，转接含有7%的L-谷氨酸钠的发酵培养基(g/L):玉米糖化液20 22，酵母浸出粉15 20，玉米浆10 30，乙酸钠2，磷酸钾2、硫酸镁0. 4、硫酸铵0. 2，pH6. 0,培养58h，菌体生长进入到平稳期；
(2)培养细胞60h后，收集细胞，离心lOmin，8000rpm，4°C，用0. 2mM磷酸钠缓冲液pH 7. 2洗涤两次，重悬pH4. 6磷酸缓冲液，湿细胞浓度25 30g/L ；
(3)在细胞悬浮液中加入L-谷氨酸钠IOOmM,磷酸吡哆醛0.01M，30°C,180 rpm，6h转化得到GABA 10 g/L，细胞可重复进行转化三次，产量维持不变。(4)发酵结束后的发酵液和细胞生物转化液经金属微米膜过滤除去菌体细胞后， 通过大孔吸附树脂201-C II脱色，再经过DOOl强酸性阳树脂离子交换吸附GABA，并和其他杂质分离后，用2M氨水洗脱获得GABA，经三效真空浓缩得粗制GABA结晶后，采用乙醇重结
晶，获得纯度达99. 0%结晶。本发明另一个优选的采用CGMCC NO. 3414制备GABA的方法，其特征在于
(1)将活化后的CGMCCN0. 3414菌株接种于种子培养基中培养，待菌体量达到发酵条件时转接入发酵培养基；其中
种子培养基(g/L)及培养方法玉米糖化液20，蛋白胨10，酵母浸出粉5，柠檬酸铵2， 硫酸镁0. 58，硫酸锰0. 25，乙酸钠2，磷酸二氢钾2。种子培养条件30°C培养箱，静置培养12h，按照10 15%的接种量接入到5L发酵罐中；
(2)发酵培养基(g/L)及培养方法玉米糖化液20，酵母浸出粉20，玉米浆10，乙酸钠 2，磷酸钾2，硫酸镁0. 4，硫酸铵0. 2，控制发酵罐培养温度为30°C，初始pH为6. 5，通风8h， 通风量为0.6L/min，6h pH降为5. 0，8h后的菌体浓度为1. 225h停止通风，补加底物按照 L-MSG (谷氨酸钠)/L-Glu (谷氨酸)=4:1比例添加；发酵58h后底物全部转化为GABA产量为 70.05g/L;
(3)当培养细胞60h后，收集细胞，离心lOmin，8000rpm，4°C，用0. 2mM磷酸钠缓冲液pH 7. 2洗涤两次，重悬pH4. 6磷酸缓冲液，湿细胞浓度30 g/L,在细胞悬浮液中加入 L-谷氨酸钠IOOmM,磷酸吡哆醛0. 01M, 30°C, 180 rpm，转化6h，HPLC分析检测GABA产量10g/L;细胞可重复进行转化四次，产量维持不变。通过两阶段转化生产GABA的终产量达到 100.05g/L ；
(4)发酵液和细胞转化液经7200 8000r/min高速离心lOmin，上清液经0. 45mm的膜过滤除菌体，取IOmL进入C18制备色谱柱进行分离提纯，采用甲醇和水的体积配比为30/70 的流动相进行洗脱，收集保留时间14 15min的馏分，置于60°C烘箱内进行蒸发干燥后得到GABA晶体。本发明还一个目的是公开了本发明(短乳杆菌CGMCC NO. 3414生产GABA的方法) 应用于含有谷氨酸的等电废液为原料的GABA生产。本发明优选是将活化后的Lacio力aciWm brevis CGMCC Ntl. 3414菌株接种于培养基为(g/L):蛋白胨10，牛肉提取物10，酵母提取物15，葡萄糖15，乙酸钠5，柠檬酸铵 2，MnSO4 - H2O 0. 05，MgSO4. 7H20 0. 2，吐温 80 ImL,蒸馏水 1000 mL 的种子培养基中于 30°C 下，培养10 12h。以10 15%的接种量转接到含有谷氨酸10 30g/L等电母液，另添加葡萄糖15g/L，酵母粉10g/L，玉米浆15/L的培养基中，在pH6. 0的环境中进行静置培养 10h, pH维持在4. 5 5. 0继续静置发酵62h，可得到GABA产量为6 21g/L，对谷氨酸的转化率为60 70%。按照实施例四的方法步骤从发酵液中分离提取出纯净的GABA。本发明更加详细的内容为
(1)高产GABA菌株的选育。从我国北方自然腌制的酸菜(汤)中，采用双层平板法，在含有10g/L碳酸钙和50g/L的Y-氨基丁酸的筛选培养基中，30°C培养48h，挑选具有透明圈的菌落进行发酵检测GABA含量，得到一株产量1. 6g/L乳杆菌Sl，并经吖啶橙一紫外线诱变和N+注入诱变，获得GABA产量达25g/L的乳杆菌S5，经菌株的生理生化试验以及16srDNA It^kLactobacillus brevis TCCC N0. 13007，送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记入册被编号CGMCCN0. 3414，见附件1 (菌种保藏证明)。(2)利用 Lactobacillusbrevis CGMCC N。· 3414 生长细胞转化生产 GABA。对 Lactobacillus brevis CGMCC N。. 3414菌株生长、发酵的优化。即将该菌株接种于种子培养基中10 12h，30°C生长，转接含有7%的L-谷氨酸钠的发酵培养基(g/L)玉米糖化液 20 22，酵母浸出粉15 20，玉米浆10 30，乙酸钠2，磷酸钾2、硫酸镁0. 4、硫酸铵0. 2， PH6. 0。培养58h，菌体生长进入到平稳期，GABA产量达到最大70. 05g/L,理论产量36. 95g/ L,转化率96. 7%。L -谷氨酸钠被完全利用并转化为GABA。(3)利用 Lacio^ciBw1S brevis CGMCC N。· 3414)静态细胞转化生产 GABA。培养细胞60 h后，收集细胞，离心lOmin，8000rpm，4°C，用0. 2mM磷酸钠缓冲液pH 7. 2洗涤两次，重悬PH4. 6磷酸缓冲液，湿细胞浓度25 30g/L。在细胞悬浮液中加入L-谷氨酸钠 IOOmM,磷酸吡哆醛0. 01M, 30°C，180 rpm, 6h转化得到GABA 10g/L,细胞可重复进行转化三次，产量维持不变；通过两阶段转化生产GABA的终产量达到100. 05g/L。(4)发酵结束后的发酵液和细胞生物转化液经金属微米膜过滤除去菌体细胞后， 通过大孔吸附树脂201-C II脱色，再经过D001强酸性阳树脂离子交换吸附GABA，并和其他杂质分离后，用2M氨水洗脱获得GABA，经三效真空浓缩得粗制GABA结晶后，采用乙醇重结晶，获得纯度达99. 0%结晶。本发明生产高产Y-氨基丁酸的特点
(1)采用代谢控制发酵理论与结合乳酸细菌的特性、设计筛选选育高产GABA的分离平板，高效率地选育出国际上公认最安全的短乳杆菌制品——GABA的产生菌。并进而采用吖啶橙-紫外线诱变和N+注入诱变，获得GABA产量达较高的乳杆菌。送天津市疾病预防控制中心检测。检验项目小鼠急性经口毒性试验
检测结果动物染毒后，未见明显中毒表现，观察期内无死亡，尸检中各主要脏器未见明显异常。检测结论本品的小鼠急性经口毒性LD5tl > 20. 0 / g / kg. BW。按《食品安全性毒理学评价疗程和方法》(GB15193. 3-2003)，本品属于无毒。检测结果见附图8。(2)采用现代发酵技术和生物细胞和酶工程技术。充分利用和发挥LactohciBm brevis CGMCCN0. 3414的活力，巧妙地将生长细胞发酵和静态细胞转化相偶联的方法进行 GABA生产。(3)在深入研究GABA发酵液的理化性质的基础上，采用现代生物分离技术，从 GABA发酵液和细胞生物转化液中，分离提纯，并获得纯度达99. 0%的结晶GABA，提取收率达 85%左右。本发明生产高产Y -氨基丁酸的优点和有益效果为
1、本发明是现代生物医药、保健食品和传统发酵工程技术的有机结合，大量、低成本地制备Y -氨基丁酸。GABA是哺乳动物、甲壳类动物、昆虫和某些寄生蠕虫神经系统中重要的抑制性神经递质。它具有改善脑机能、延长记忆力、改善视觉功能、镇静神经、降血压、改善肝功能、活化肾功能等重要的生理功能。被开发为降血压、治疗癫痫、抗焦虑与抗惊厥、抗心律失常、调节激素的分泌及其生殖生理等药物中间体，GABA也可以制成保健营养品以及食品及饲料添加剂。2、本发明选育出被国际公认为最安全的短乳杆菌Lac tobacillus bre vis CGMCCN0. 3414)采用微生物厌氧发酵和细胞转化生产GABA。具有采用原料低廉、生产中能耗低，生产成本低、易实现工业化生产等优点，具有良好的社会和经济效益。3、本发明应用于味精厂的谷氨酸发酵废液为原料发酵生产Y -氨基丁酸，即味精厂经过等电提取后的废液。此溶液中仍有谷氨酸残留，其谷氨酸的残留量约为洲 4%，如果将废液直接排放到环境中，不但造成浪费而且给环境造成严重污染。因此有必要对发酵残液进行利用，本发明开发了采用含有谷氨酸的等电废液为原料生产Y-氨基丁酸，对废液中的谷氨酸进行有效的利用，变废为宝，开辟生产Y -氨基丁酸的新思路，新方法。
图1为高产Y-氨基丁酸生产新工艺流程图2为高产GABA产生菌一短乳杆菌LacioAaciBiz1S brevisCGMCC34:14诱变蹄选谱； 图3为附图3分离筛选平板和短乳杆菌ZaciohciWiAs brevis TCCCN013007菌体形
态；
图4为诱变菌株发酵液纸层析色谱图； 图5为S5菌株发酵液HPLC分析图 6 % Lactobacillus brevis TCCCN013007 基因序列分析； 图7为提纯的Y-氨基丁酸产品结晶； 图8为天津市疾病预防控制中心检验报告。
具体实施例方式
下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定。实施例1
(1)出发菌株的筛选从我国北方自然腌制的酸菜(汤)40余个样品中，采用双层平板法，即含有5%的碳酸钙和氨基丁酸，30°C培养48h，挑选具有透明圈的菌落进行发酵采用高效液相色谱检测GABA含量，得到5株产GABA的菌株，并筛选出一株产量1. 4g/L乳杆菌， 编号为Si，转接在斜面上于4°C冰箱保藏。(2)紫外线一吖啶橙诱变取生长良好的短乳杆菌Sl种子液，在紫外照射90s， 然后把600 μ L经过紫外诱变的菌悬液接入到含有5mL诱变培养基的试管中30°C避光水浴振荡培养12h。(诱变培养基中含有lmg/mL吖啶橙，剂量分别为80 μ L，100 μ L，150 μ L， 200 μ L, 250 μ L)
(3)Ν+离子注入诱变取生长良好的短乳杆菌种子液，用浓度8%无菌甘油溶液稀释到 100倍，取100 μ L均勻涂布于无菌平皿上，以无菌风吹干，取镜检无细胞重叠者进行离子注入。用N+离子进行注入，注入能量为30keV，注入剂量为Oions/cm2 ~ 2. 0X 1014ions/ cm2,靶室真空度为1. 2X 10_3Pa。注入后取出平皿，以900 μ L浓度为0. 85%生理盐水洗脱， 采用种子培养基进行上，30°C培养3d (诱变流程图如图2)
(4)驯化培养基(I)(g/L)玉米糖化液10，蛋白胨10，酵母浸出粉15，微量元素液 15mL谷氨酸60 ；驯化培养基(II) (g/L)葡萄糖15，酵母粉20，蛋白胨10，谷氨酸70 ；驯化培养基(III) (g/L)在等电点废液中添加葡萄糖15，酵母粉20谷氨酸60驯化培养将种子培养基中的菌株培养液以10%(v/v)接种量转接于驯化培养基中，在30°C下，150r/min摇床培养12h，在转接于下一驯化培养基中，最后经过分离纯化培养，获得单菌落，然后进行摇瓶发酵实验选取高产菌株。(5)诱变菌种初筛将吖啶橙紫外诱变和N+注入后的菌种在无菌操作条件下，用无菌水稀释到10_7 10_9，取100 μ L涂布到初筛平板上，30°C培养1 3d，将能在含有CaCO3 和高浓度GABA生长且有透明圈的单菌落保存与斜面，以备复筛。(6)诱变菌种复筛将保藏的初筛菌种接于液体种子培养基中进行活化，150r/ min摇床培养12h，以10%(v/v)接种量转接于另一瓶液体种子培养基中，150r/min摇床培养12h，以10%(v/v)接种量，转接于复筛发酵培养基中，30°C静置发酵3d。用纸层析定性分析菌种是否高产GABA，并用HPLC定量分析GABA产量。将高产菌株保存于斜面中，以备分纯。分纯是将高产菌株进行液体培养，并将培养液进行适度稀释后涂布于平板上，30°C培养 1 2d，观察菌落形态和革兰氏染色形态，记录并拍照。(7)高产Y _氨基丁酸菌株的获得利用初筛平板从诱变后的菌株中筛选得到一株产GABA菌株，记为S5菌株。通过奥林巴斯双目显微镜观察菌株形态，菌株在梯度平板培养时因产酸而形成透明圈，菌落形态扁平湿润，边缘光滑呈白色不透明状态，镜检观察为短杆状，不运动，无孢子，根据革兰氏染色法鉴定为革兰氏阳性细菌，兼性厌氧型。诱变菌株的筛选平板和菌体形态见附图3，诱变菌株发酵液纸层析色谱图见附图4。
从众多诱变菌株中得到一支产GABA较高的菌株，命名为菌株S5，由图可见S5菌株对应的色斑颜色最深，产生的GABA的量最多。然后利用液相色谱仪进行定量分析。S5菌株发酵液HPLC图见附图5，如图所示，S5菌株发酵后其发酵液经HPLC检测显示，样品中含有的少量杂质在最初几分钟被冲出，ianin后出现衍生剂的峰，16min的时候GABA的峰出现， 峰面积为16. 679，GABA的产量为25. 4g/L。诱变结果及稳定性试验
将经过初筛、复筛得到的高产菌株S5，进行发酵实验验证，通过五次实验结果分析稳定性良好，无回复突变现象发生。S5菌株经菌株的生理生化试验和16srDNA鉴定为 Lactobacillus brevis CGMCCNci. ；3414)，该菌体部分基因序列分析见附图6。实施例2
一种利用高产短乳杆菌Lacio^ciBtts brevis CGMCCN0. ；3414生产Y-氨基丁酸的新工艺流程简图见附图1。将活化后的ZacioAaci^^As brevis CGMCCNci. 3414菌株接种于种子培养基中培养，待菌体量达到发酵条件时转接入发酵培养基。种子培养基(g/L)及培养方法玉米糖化液20，蛋白胨10，酵母浸出粉5，柠檬酸铵2，硫酸镁0.58，硫酸锰0.25，乙酸钠2，磷酸二氢钾2。种子培养条件30°C培养箱，静置培养12h。按照10 15%的接种量接入到5L发酵罐中。发酵培养基(g/L)及培养方法玉米糖化液20，酵母浸出粉20，玉米浆10，乙酸钠 2，磷酸钾2，硫酸镁0.4，硫酸铵0.2。控制发酵罐培养温度为301，初始？!1为6.5。通风他，通风量为0. 6L/min,6h左右的pH降为5. 0，此时控制pH，不要继续下降；他后的菌体浓度为1. 225h停止通风，补加底物按照L-MSG/L-Glu=4:1比例添加。发酵5 后底物全部转化为GABA产量为70. 05g/L。当培养细胞60 h后，收集细胞，离心lOmin，8000rpm，4°C，用0. 2mM磷酸钠缓冲液 PH 7. 2洗涤两次，重悬pH4. 6磷酸缓冲液，湿细胞浓度30 g/L。在细胞悬浮液中加入L-谷氨酸钠IOOmM,磷酸吡哆醛0. 01M，30°C，180 rpm，转化6h，HPLC分析检测GABA产量10g/L。 细胞可重复进行转化四次，产量维持不变；通过两步法生产GABA的终产量达到100. 05g/L。发酵液(细胞转化液)一高速离心(7200r/min) IOmin —上清液经0. 45mm的膜过滤除菌体一取IOmL进入C18制备色谱柱进行分离提纯一采用甲醇和水的体积配比为30/70 的流动相进行洗脱一收集保留时间14 15min的馏分一置于60°C烘箱内进行蒸发干燥一待甲醇和水分挥发完全即有GABA的晶体析出。虽然上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的，因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属本发明要求保护的范围。实施例3
将活化LacioAaciWw1S brevis CGMCCNci. 3414菌株接种于种子培养基中，于30°C下静置培养10 12h。种子培养基组成(g/L):蛋白胨10，酵母提取物10，葡萄糖20，乙酸钠5，柠檬酸胺 2，MnSO4. H2O 0. 05，MgSO4. 7H20 0.2，吐温 80 lmL，蒸馏水 1000 mL，pH 控制 5. O 6. O。
以10 15%的接种量转接入含有8% L-谷氨酸钠的发酵培养基。
发酵培养基(g/L)玉米浆10，葡萄糖22，酵母粉15，醋酸钠2，硫酸镁0. 2， (NH4)2SO4O. 2，pH6.0。培养16h，菌体生长进入到对数期生长后，调节pH为4. 6，并一直控制在4.6，培养60h后，GABA产量达到最大76. 52g/L。培养细胞60 h后，收集细胞，离心 IOmin, 8000rpm, 4°C，用0. 2mM磷酸钠缓冲液pH 7. 2洗涤两次，重悬pH4. 6磷酸缓冲液，湿细胞浓度25g/L。在细胞悬浮液中加入L-谷氨酸钠80mM，磷酸吡哆醛0. 01M,在30°C，180 rpm条件下转化2 h，经HPLC分析检测GABA产量8g/L。细胞可重复进行转化三次，产量维持不变。 将上述的发酵液(和离心除去细胞转化液)放入旋转式真空蒸发器中浓缩，使GABA含量达 100 110g/L。取出放入三角瓶中，用NaOH调溶液至pH7. 5(GABA的等电点)后，并缓慢降温至10°C -4°c，获得GABA结晶析出。再用高速离心(7200r/min)机离心获得结晶GABA 和母液。采用盐酸将分离的母液PH调至3. 0以下，采用DOOl强酸阳离子交换树脂提取得粗制GABA，再经颗粒活性炭脱色、阴、阳树脂去盐、最后浓缩结晶等制得商品GABA.
实施例4
将活化后的LacioAaci/^As brevis CGMCCN0. ；3414菌株接种于种子培养基于30°C下生长培养10 12h。种子培养基为(g/L)蛋白胨10，牛肉提取物10，酵母提取物5，葡萄糖5，乙酸钠 5，柠檬酸二铵 2，MnSO4. H2O 0. 05，MgSO4. 7H20 0.2，吐温 80 lmL，蒸馏水 1000 mL，pH 控制在6.0。以10 15%的接种量转接入含有70g/L的L -谷氨酸钠的发酵培养基(g/L) 玉米浆10，葡萄糖22，酵母粉15，醋酸钠2，硫酸镁0. 2，(MM)2SO4O. 2，pH6. 0。培养12h，菌体生长进入到对数期生长后，调节pH为4. 6，并一直控制在4. 6，发酵到34h时，检测L-谷氨酸含量10g/L左右时，补加谷氨酸30g/L，葡萄糖5g/L ；发酵53 5 时，检测L-谷氨酸含量4g/L，GABA达到68g/L，即停止发酵。将发酵液采用8000rpm，4°C下离心lOmin，收集细胞，并用0. 2mM磷酸钠缓冲液 CpH 7.2)洗涤两次，重悬？朋.6磷酸缓冲液，湿细胞浓度458/1。在细胞悬浮液中加入L-谷氨酸钠80mM，磷酸吡哆醛0. 01M，30°C, 180 rpm，转化6 h，HPLC分析检测GABA产量8g/L。 细胞可重复进行转化3 4次。将上述的发酵液(和细胞转化液)采用金属微米膜过滤除菌体，获得含GABA的发酵清液经过大孔吸附树脂201-C II脱色的脱色液、直接通过DOOl强酸阳离子交换树脂提取GABA，获得的GABA液再经再经脱色树脂脱色、阴、阳树脂除盐、浓缩后用乙醇萃取可溶性杂质，获得GABA重结晶，再经干燥制得商品GABA见附图7。实施例5
(1)将该菌株接种于种子培养基中12h，30°C生长，转接含有7%的L-谷氨酸钠的发酵培养基(g/L)玉米糖化液22，酵母浸出粉20，玉米浆10，乙酸钠2，磷酸钾2、硫酸镁0. 4、 硫酸铵0. 2，pH6. 0,培养58h，菌体生长进入到平稳期；
(2)培养细胞60h后，收集细胞，离心lOmin，8000rpm，4°C，用0. 2mM磷酸钠缓冲液pH 7. 2洗涤两次，重悬pH4. 6磷酸缓冲液，湿细胞浓度25g/L ；
(3)在细胞悬浮液中加入L-谷氨酸钠IOOmM,磷酸吡哆醛0.01M，30°C,180 rpmjh转化得到GABA 10 g/L，细胞可重复进行转化三次，产量维持不变；通过两阶段转化生产GABA 的终产量达到100. 05g/L ；
(4)发酵结束后的发酵液和细胞生物转化液经金属微米膜过滤除去菌体细胞后，通过大孔吸附树脂201-C II脱色，再经过DOOl强酸性阳树脂离子交换吸附GABA，并和其他杂质分离后，用氨水洗脱获得GABA，经三效真空浓缩得粗制GABA结晶后，采用乙醇重结晶，获得纯度达99. 0%结晶。实施例6
将活化后的LaciO^ciBtts brevis CGMCCNtl. 3414菌株接种于培养基为(g/L)蛋白胨10，牛肉提取物10，酵母提取物15，葡萄糖15，乙酸钠5，柠檬酸铵2，MriS04.H20 0. 05，MgSO4 - 7H20 0. 2，吐温80 ImL,蒸馏水1000 mL的种子培养基中于30°C下，培养10 12h。以10 15%的接种量转接到含有谷氨酸10g/L等电母液，另添加葡萄糖15g/L，酵母粉10g/L，玉米浆15/L的培养基中，在pH6. 0的环境中进行静置培养10h，pH维持在4. 5，继续静置发酵62h，可得到GABA产量为6g/L，对谷氨酸的转化率为60%。按照实施例四的方法步骤从发酵液中分离提取出纯净的GABA。参考文献许建军，江波，许时嬰.Y-氨基丁酸(GABA)-—种新型的功能食品因子.食品工业科技，2003，(1) :109 一 110.张晖，姚惠源，姜元荣.富含Y-氨基丁酸保健食品的研究与开发.食品与发酵业· 2002，28 (9) :6 9-72.郭晓娜，朱永义，朱科学.生物体内GABA的研究[J].氨基酸和生物资源， 2003，25(2) :70-72杨立川，高Y-氨基丁酸与癫痫，国内外医学神经病学科科学分册。 1993，16(3) 19-20。
权利要求
1.高产Y-氨基丁酸(GABA)的生长短乳杆菌S5，其保藏号为CGMCCNO. 3414。
2.一种制备权利要求1所述CGMCC NO. 3414的方法，其特征在于按如下步骤进行(1)菌株的筛选从我国北方自然腌制的酸菜或汤中，采用双层平板法，即含有5%的碳酸钙和氨基丁酸，30°C培养48h，挑选具有透明圈的菌落进行发酵，采用高效液相色谱检测GABA含量，筛选出一株产量1. 4g/L乳杆菌，编号为Si，转接在斜面上于4°C冰箱保藏；(2)紫外线一吖啶橙诱变取生长良好的短乳杆菌Sl种子液，在紫外照射90s，然后把600 μ L经过紫外诱变的菌悬液接入到含有5mL诱变培养基的试管中30°C避光水浴振荡培养1 ；(3)N+离子注入诱变取生长良好的短乳杆菌种子液，用浓度8%无菌甘油溶液稀释到 100倍，取100 μ L均勻涂布于无菌平皿上，以无菌风吹干，取镜检无细胞重叠者进行离子注入，用N+离子进行注入，注入能量为30keV，注入剂量为Oions/cm2 2. 0X 1014ions/ cm2,靶室真空度为1. 2X 10_3Pa，注入后取出平皿，以900 μ L浓度为0. 85%生理盐水洗脱， 采用种子培养基进行上，30°C培养3d，其诱变流程图如图2 ；(4)将种子培养基中的菌株培养液以10%(v/v)接种量转接于驯化培养基中，在30°C 下，150r/min摇床培养12h，在转接于下一驯化培养基中，最后经过分离纯化培养，获得单菌落，然后进行摇瓶发酵实验选取高产菌株；其中的驯化培养基(I) (g/L)玉米糖化液 10，蛋白胨10，酵母浸出粉15，微量元素液15mL谷氨酸60 ；驯化培养基(II) (g/L)葡萄糖 15，酵母粉20，蛋白胨10，谷氨酸70 ；驯化培养基(III) (g/L)在等电点废液中添加葡萄糖 15，酵母粉20谷氨酸60驯化培养(5)诱变菌种初筛将吖啶橙紫外诱变和N+注入后的菌种在无菌操作条件下，用无菌水稀释到10〃 10_9，取100 μ L涂布到初筛平板上，30°C培养1 3d，将能在含有CaCO3和高浓度GABA生长且有透明圈的单菌落保存与斜面，以备复筛；(6)诱变菌种复筛将保藏的初筛菌种接于液体种子培养基中进行活化，150r/min摇床培养12h，以10%(v/v)接种量转接于另一瓶液体种子培养基中，150r/min摇床培养12h， 以10%(v/v)接种量，转接于复筛发酵培养基中，30°C静置发酵3d，用纸层析定性分析菌种是否高产GABA，并用HPLC定量分析GABA产量，将高产菌株保存于斜面中，以备分纯；(7)高产Y-氨基丁酸菌株的获得利用初筛平板从诱变后的菌株中筛选得到一株产 GABA菌株，记为S5菌株，诱变菌株的筛选平板和菌体形态见附图3，诱变菌株发酵液纸层析色谱图见附图4。
3.权利要求2所述的制备方法，其中步骤(2)中的诱变培养基为含有lmg/mL吖啶橙， 剂量分别为 80 μ L, 100 μ L, 150 μ L, 200 μ L, 250 μ Lo
4.权利要求2所述的制备方法，其中步骤(6)中的分纯指的是将高产菌株进行液体培养，并取ImL培养液将其稀释成10_7 10_9后涂布于平板上，30°C培养1 2d，观察菌落形态和革兰氏染色形态，记录并拍照。
5.一种采用权利要求1所述CGMCC NO. 3414制备GABA的方法，其特征在于它是将生长细胞发酵和静态细胞转化相偶联的方法生产GABA，按如下的步骤进行(1)将该菌株接种于种子培养基中10 12h，30°C生长，转接含有7 %的L-谷氨酸钠的发酵培养基(g/L):玉米糖化液20 22，酵母浸出粉15 20，玉米浆10 30，乙酸钠2，磷酸钾2、硫酸镁0. 4、硫酸铵0. 2，pH6. 0,培养58h，菌体生长进入到平稳期；(2)培养细胞60h后，收集细胞，离心lOmin，8000rpm，4°C，用0. 2mM磷酸钠缓冲液pH 7. 2洗涤两次，重悬pH4. 6磷酸缓冲液，湿细胞浓度25 30g/L ；(3)在细胞悬浮液中加入L-谷氨酸钠IOOmM,磷酸吡哆醛0.01M，30°C,180 rpm，6h转化得到GABA 10 g/L，细胞可重复进行转化3 4次，产量维持不变；(4)发酵结束后的发酵液和细胞生物转化液经金属微米膜过滤除去菌体细胞后，通过大孔吸附树脂201-C II脱色，再经过DOOl强酸性阳树脂离子交换吸附GABA，并和其他杂质分离后，用2M氨水洗脱获 得GABA，经三效真空浓缩得粗制GABA结晶后，采用乙醇重结晶，获得纯度达99. 0%结晶。
6.一种采用权利要求1所述CGMCC NO. 3414制备GABA的方法，其特征在于(1)将活化后的CGMCCNO. 3414菌株接种于种子培养基中培养，待菌体量达到发酵条件时转接入发酵培养基；其中种子培养基(g/L)及培养方法玉米糖化液20，蛋白胨10，酵母浸出粉5，柠檬酸铵2， 硫酸镁0.58，硫酸锰0.25，乙酸钠2，磷酸二氢钾2;种子培养条件30°C培养箱，静置培养 12h，按照10 15%的接种量接入到5L发酵罐中；(2)发酵培养基(g/L)及培养方法玉米糖化液20，酵母浸出粉20，玉米浆10，乙酸钠 2，磷酸钾2，硫酸镁0. 4，硫酸铵0. 2，控制发酵罐培养温度为30°C，初始pH为6. 5，通风8h， 通风量为0.6L/min，6h pH降为5. 0，8h后的菌体浓度为1. 225h停止通风，补加底物按照 L-MSG/L-Glu=4:1比例添加；发酵58h后底物全部转化为GABA产量为70. 05g/L ；(3)当培养细胞60h后，收集细胞，离心lOmin，8000rpm，4°C，用0. 2mM磷酸钠缓冲液pH 7. 2洗涤两次，重悬pH4. 6磷酸缓冲液，湿细胞浓度30 g/L,在细胞悬浮液中加入 L-谷氨酸钠IOOmM,磷酸吡哆醛0. 01M，30°C，180 rpm，转化6h，HPLC分析检测GABA产量 10g/L;细胞可重复进行转化4次，产量维持不变；通过两阶段转化生产GABA的终产量达到 100.05g/L ；(4)发酵液细胞转化液经7200 8000r/min高速离心lOmin，上清液经0. 45mm的膜过滤除菌体，取IOmL进入C18制备色谱柱进行分离提纯，采用甲醇和水的体积配比为30/70 的流动相进行洗脱，收集保留时间14 15min的馏分，置于60°C烘箱内进行蒸发干燥后得到GABA晶体。
7.权利要求1所述短乳杆菌在制备采用含有谷氨酸的等电废液为原料生产GABA方面的应用。
全文摘要
本发明涉及一种高产γ-氨基丁酸生产方法，属生物技术医药与食品工程技术领域。它包括菌种分离筛选、吖啶橙—紫外线诱变和N+注入诱变获得一株高产γ-氨基丁酸LactobacillusbrevisTCCC(CGMCC No.3414)菌株；发酵培养基和发酵条件的优化以及采用该菌株的生长细胞发酵和休止细胞的生物转化相偶联生产γ-氨基丁酸；采用膜过滤、吸附树脂脱色、强酸阳离子树脂离交、乙醇重结晶等技术以及制备色谱技术节能降耗技术，将γ-氨基丁酸从发酵和生物转化液中分离出来，提纯制得纯度达99%的结晶γ-氨基丁酸。此法具有原料低廉、生产能耗低、生产成本低，产品安全性好、易实现工业化生产等优点。其菌株应用于谷氨酸发酵废液生产γ-氨基丁酸，有良好的社会和经济效益潜力。
文档编号C12R1/24GK102174449SQ20111005173
公开日2011年9月7日 申请日期2011年3月4日 优先权日2011年3月4日
发明者冯宇, 宋磊, 张健, 张颖, 王德培, 高年发, 高强 申请人:天津科技大学