专利名称：一种定向改造动物基因组特定基因的方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种定向改造动物基因组特定基因的方法及其应用。
背景技术：
通过对基因组进行诱变改造研究基因在动物的发生和遗传中的作用机制、制造疾病动物模型、或创制具优良生产性状的新动物品系是当代生命科学研究中采用的基本研究策略。动物基因组诱变技术分为非定向的突变技术和针对特定基因的定向诱变技术。由于研究者可以选择突变的位点、充分利用已有的动物基因组序列信息，定向诱变技术成为研究者进行相关研究的“金标准”。定向诱变技术中的基因打祀(gene targeting)是一项利用同源重组(homologous recombination)原理改造内源基因的遗传学技术。但因为需要借助于在胚胎干细胞(ES)系上的筛选，基因打祀最初只能在小鼠基因组上实现(Evans and Kaufman, 1981, Nature292 154-156 ；Rossant and McMahon, 1999,Genes & Development 13 :142-145)。最近，大鼠的ES细胞系也已建立(Buehr et al. ,2008,Cell 135 :1287-1298 ;Li et al. ,2008,Cell135 :1299-1310)，并成功地实现了基因打靶(Tong et al.，2010，Nature 467:211-213)。由于除小鼠和大鼠外，在其他动物上均没有建成ES细胞系，对这些动物的基因组上基因进行定向改造一直到新近发明的锌指核酸酶(zinc finger nuclease, ZFN)技术的出现才有可能得以实现。ZFN是一种人工融合蛋白，它由位于氨基端的由多个锌指基序(motif)而成的识别特定DNA序列的功能域和位于羧基端的非特异性的Fok I核酸内切酶功能域两部分组成(Kim et al. ,1996，PNAS(USA)93 :1156-1160。每一个锌指基序可识别三个连续的核苷酸对。在切割DNA时，ZFN通过形成二聚体发挥功能。其中ZFN的两个单体中的多个锌指基序分别识别并特异性结合特定序列的DNA片段，从而使它们的FokI功能域位于合适的空间位置和取向上，相互结合并切割DNA，形成DNA双链断裂(DSB)。受损细胞然后通过非同源末端接合(NHEJ)对DSB进行易错修复，结果导致可能会在断裂位点附近引入插入/缺失突变(indel)。通过向胚胎注射特定ZFN，人们已经获得了 NHEJ介导的外源EGFP基因敲除大鼠、白介素2受体ga_a(I12rg)基因敲除大鼠(Geurts etal. , 2009, Science 325 :433 ；Mashimo et al. ,2010, PloS ONE5 e8870)、Mdrla、Jagl和 Notch3 基因敲除小鼠(Carbery et al. ,2010, Genetics 186:451-459)和 ntl、kdr、tfr2> dopamine transporter、telomerase、hiflaa 和 gridlock 等 7 个基因敲除斑马鱼(Doyon et al. ,2008, Nat. Biotech. 26 :702-708 ；Meng et al. ,2008, Nat. Biotech. 26 695-701 ；Foley et al.，2009，PLoS ONE 4 :e4348)，其敲除基因可稳定地进行种质系遗传(germline transmission)。利用ZFN进行基因组改造的研究在植物(Osakabe et al.,2010，PNAS(USA) 107 :12034-12039)和蚕蛾(Takasu et al. ,2010, Insect Biochemistryand Molecular Biology 40:759-765)中同样取得了进展。细胞对由ZFN造成的DSB除可进行NHEJ介导的易错修复外，也可以采用同源重组的高保真性方式修复。基于这一原理，新近的报道证明利用这种对ZFN的同源重组修复方式可在小鼠和大鼠基因组上的特定基因位点处引入一小段外源DNA序列甚至于一个报告基因(Meyer et al.，2010，PNAS (USA) 107 :15022-15026. Cui et al. ,2011, Nat.Biotech. 29 :64-67)。尽管理论上ZFN技术可以在任何生物上对给定的任何一个基因进行定向改造，但是该技术的主要瓶颈是筛选到一个能有效切割给定基因的ZFN十分困难，甚至常常做不到。目前已知的锌指核酸酶构建与筛选方法包括模块组装(Modular Assembly)(Wright et al. , 2006, Nat. Protoc. I : 1637-1652)、寡聚物化集中工程(OligomerizedPool Engineering, OPEN) (Maeder et al. , 2009, Nat. Protoc. 4 :1471-1501)和背景参照组装(Context-Dependent Assembly, CoDA)(Sander et al. , 2011, Nat. Meth. 8 :67-69)。模块组装方法将位于不同载体上的锌指编码序列通过限制性酶切和连接的方法连接为完整的锌指结构域编码序列，并连入筛选用表达载体，与筛选用靶载体共同转入细菌中，以细菌 或酵母双杂交的方式鉴定锌指结构域的特异性结合能力。在鉴定结果为有一定的结合能力后，将锌指结构域编码序列与Fok I内切功能域编码序列相重组，形成完整的锌指核酸酶单体基因。寡聚物化集中工程将位于不同载体上的锌指编码序列以重叠聚合酶链式反应的方法连接为完整的锌指结构域编码序列，筛选方法与模块组装相同。这些筛选方法的优点在于可以针对一对具切割功能的锌指核酸酶二聚体中的一个锌指核酸酶的锌指结构域的识别能力进行筛选，并且OPEN方法适宜进行大批量筛选。但其缺点在于按这些方法筛选锌指结构域费时费力，对一个给定基因并不总是能够筛选到有效的锌指核酸酶，且筛选出来的锌指结构域的结合能力与在体内该对锌指核酸酶能否有效切割靶基因并不完全匹配。同时，已有的锌指核酸酶构建与筛选系统并不考虑所设计的锌指核酸酶在体内所能获得的突变模式、以及如何高效地实现子代的筛选。因此，以基于现有方法设计筛选得到的锌指核酸酶对基因组进行定向诱变，存在有诸如切割诱变效率低下、操作周期长的缺陷。发明概述本发明涉及利用一种定向诱变动物基因组的方法。具体来说，本发明提供一种新的利用锌指核酸酶定向改造动物基因组的特定基因的方法。一方面，本发明提供一种定向改造动物基因组中特定基因的方法，包括根据目标动物靶基因区的序列设计特异识别并切割靶基因的锌指核酸酶，使用独立的表达系统验证所述锌指核酸酶对靶基因的定向切割能力和效率，利用选定的锌指核酸酶对目标动物的胚胎的靶基因进行定向遗传改造并获得稳定的遗传性状。进一步，本发明还涉及使用所述的独立表达系统，筛选利用所设计的锌指核酸酶所获得的主要的基因突变模式，并利用选定的突变模式高效筛选定向遗传改造所获得的子代。根据本发明的一个方法，所述的独立的表达系统为模式动物的卵母细胞或胚胎。所述的模式动物可以为小鼠、大鼠、非洲爪蛙、斑马鱼、青鏘鱼、黑腹果蝇和/或秀丽隐杆线虫等常用的实验动物。在一个实施例中，所述的独立表达系统为斑马鱼的胚胎。根据本发明的另一方法，所述突变模式的筛选将根据在所述独立表达系统中获得的突变模式的出现频率来决定。例如，选定的主要的突变模式为在所有获得的突变模式中的出现频率最高的突变模式。在一个实施例中，利用选定的主要的突变模式筛选定向遗传改造所获得的子代的方法包括基于所选定的突变模式设计聚合酶链式反应(PCR)的引物，然后利用所设计的引物，用PCR的方法检测所获得的子代的基因型并筛选出阳性反应的子代。在本发明的另一方法中，本发明还涉及利用所述方法对黄颡鱼的肌肉生长抑制素基因进行定向诱变。其中，利用所述方法分析选定的黄颡鱼的肌肉生长抑制素基因的主要基因突变模式包含如SEQ IDNOs. 18-55所示的核苷酸序列的任意一种。另一方面，本发明还涉及一种人工获得的特异性识别并切割黄颡鱼肌肉生长抑制素基因的锌指核酸酶或其具有相同或相似功能的衍生物，其所包含的多肽序列从氨基端到羧基端的方向上包 含三个锌指基序，分别为SEQ ID NOs. 11、12和13或SEQ ID NOs. 14、15和16。在本发明中，这些锌指核酸酶或其衍生物的多肽序列可以包含如SEQID NOs. 2、3、5、或6所示的氨基酸序列。进一步，本发明也提供包含编码前述锌指核酸酶或其衍生物的核苷酸序列或其互补序列的多核苷酸序列。根据本发明的另一应用，本发明还提供包含如SEQ ID NO. 2、3、5、或6所示的氨基酸序列的分离多肽及其功能衍生物，而编码这些多肽及其衍生物的核苷酸序列或其互补序列也包含在本发明中。本发明还提供重组表达载体，所述载体由本发明提供的多核苷酸序列和质粒，病毒，或运载体构建而成。与现有技术相比较，利用本发明可以更有效地进行对动物基因组的定向诱变，尤其是对于所得到的锌指核酸酶的切割诱变效率低下、操作周期长、或者需操作的细胞数目巨大的情况下，本发明具有特别的优势。利用这一方法，本发明确定了能对黄颡鱼的肌肉生长抑制素基因进行定向突变的锌指核酸酶并成功获得了含有突变的肌肉生长抑制素基因
的黄颡鱼。
图Ia和图Ib分别表示锌指核酸酶的核苷酸和氨基酸序列，其中下划线部分为锌指结构骨架，小写部分为锌指基序，斜体部分为接头，加粗部分为Fok I内切功能域。发明详述为了本发明的目的，下列术语应具有下述的含义“核酸”、“核酸序列”或“碱基序列”是指核苷酸，寡核苷酸或多核苷酸及其片段或部分。本发明的核酸能够以RNA (例如，mRNA)的形态、或DNA的形态(例如，cDNA或基因组DNA)存在。DNA可以是双链，也可以是单链。单链DNA或RNA可以是编码链(有义链)、或非编码链(反义链)中任一种。另外，本发明的多核苷酸也可以在其5’侧或3’侧融合编码标签标记(标签序列或标记物序列)的多核苷酸。它们可以是合成的或是从天然来源获得的(例如，分离和/或纯化)，其可以包含天然的、非天然的或者修饰过的核苷酸。类似地，“氨基酸序列”、“多肽序列”或“多肽”是指肽，寡肽，多肽或蛋白质及其片段或部分，其为通过肽键相连接的氨基酸。当本发明中的“氨基酸序列”涉及一种天然存在的蛋白质分子的氨基酸序列时，这种“多肽”或“蛋白质”并不意味着将氨基酸序列限制为与所述蛋白质分子相关的完整的天然氨基酸序列。本发明的氨基酸序列可以含有附加的肽。作为附加的肽，可以是，例如，多组氨酸标签(His-tag)、或Myc、FLAG等表位标记肽。“缺失”是指在氨基酸序列或核苷酸序列中一个或多个氨基酸或核苷酸的缺失。“插入”或“添加”是指在氨基酸序列或核苷酸序列中的改变导致与天然存在或改变前的分子相比，一个或多个氨基酸或核苷酸的增加。“置换”是指由不同的氨基酸或核苷酸替换一个或多个氨基酸或核苷酸。“缺失、置换或添加一个或多个氨基酸或核苷酸”则是指，利用定位诱变法等公知的突变核酸或多肽的制作法缺失、置换或添加能够缺失、置换或添加的程度的数目的氨基酸或核苷酸。上述突变不限于利用公知的突变制作法而人为导入的突变，也可以是对天然存在的核酸或蛋白质的突变进行分离纯化而得到的。多肽的“衍生物”是指基本上保持 如所述多肽或氨基酸序列相同或相似的生物学功能或活性的氨基酸序列，它们可以包括，例如，D原氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基有缺失和/或一个或多个氨基酸残基被添加；或者2)原氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基取代；或者3)原氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基上的某个基团被其它基团取代；或者4)原氨基酸序列和另外的分子或化合物(比如糖、脂类、聚乙二醇等)的融合；或者5)原有的氨基酸序列与添加的氨基酸序列融合进而形成的多肽序列(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列等)；或者6)以上各种情况的混
八
口 o本发明中，核苷酸序列的“简并变异体”是这样的多核苷酸序列，其与亲本核苷酸序列有区别，但编码的蛋白质和多肽和亲本核苷酸序列所编码的蛋白质或多肽一样。核苷酸的“互补序列”是这样的多核苷酸序列，其是以亲本核苷酸序列为模板根据碱基互补规则形成的多核苷酸序列，或是亲本核苷酸序列的互补链通过转录或反转录形成多核苷酸序列。氨基酸序列或核苷酸序列的“相同性”或“同一性”百分率是指在两种或多种氨基酸或核苷酸序列比较中，序列相同或相似的百分率。有很多本领域技术人员熟知的方法测定相同性百分率，如通过 MEGALIGN 程序(Lasergene software package, DNASTA, Inc.,Madison, WI)。MEGALIGN程序可根据不同的方法如Cluster法比较两种或多种序列(参见Higgins & Sharp，1988，Gene 73 :237-244)，Gluster法通过检查所有配对之间的距离将各组序列排列成簇，然后将簇以成对或成组分配。两个氨基酸序列如序列A和序列B之间的相同性百分率可以通过下式计算[(序列A与序列B之间匹配的残基个数)/(序列A的残基数-序列A中间隔残基数-序列B中间隔残基数)]XlOO %同理，也可以通过Cluster法或用本领域周知的方法如Jotun Hein的方法(参见Hein, 1990, Methods in Emzumology 183 :625-645)来测定核酸序列的相同性百分率。“重组表达载体”是指遗传修饰的寡核苷酸或多核苷酸构建体，该构建体包括编码mRNA、肽、多肽、或蛋白的核苷酸序列，以及病毒、质粒以及其他运载体；该构建体在足以使所述mRNA、肽、多肽或蛋白在宿主细胞内表达的条件下与所述细胞接触，可允许宿主细胞表达所述mRNA、蛋白、多肽、或肽。本发明中，重组表达载体可以包含任意类型的核苷酸序列，包括但不限于，DNA和RNA，其可以是单链的或双链的，合成的或部分获自天然来源，并且其可以包括天然的、非天然的或改变的核苷酸。“定向改造”也即定向诱变，是指通过遗传学方法例如重组对存在于宿主细胞或生物体中的特定DNA的靶基因座进行遗传改造的方法。“重组”或“遗传重组”用来指通过与其他遗传物质相互作用而使遗传物质在给定的基因座被修改的方法。“同源重组”用来表明重组以同源或同一的遗传物质片段之间相互作用的结果的形式发生。相对应的，“非同源重组”用来表明重组以非同源或非相同的遗传物质片段之间相互作用的结果的形式发生。非同源末端连接(NHEJ)是非同源重组的实例。“定向遗传重组”指其中重组发生在存在于宿主细胞或生物体中的特定DNA靶基因座内部的方法。“宿主细胞”或“宿主生物体”或“目标宿主”指的均是已被选择用于基因转化并携带可表达本发明方法中某项功能的一种或多种基因的细胞或生物体。宿主可进一步是已通过本发明的定向遗传重组或突变方法转化的生物体或细胞。“靶”、“靶基因”、“靶基因座”或“靶区域”在此指被选择用于通过本发明的定向遗传重组方法而修饰的基因或DNA片段。通常，这种靶是宿主生物体的内源基因、编码片段、调控区域、内含子、夕卜显子或其部分。然而，靶也可以是宿主DNA的一部分或任何部分。“标记”指其存在或缺少使得宿主细胞或生物体表现出可检测表型的基因或序列。可以有多种类型的标记，例如，选择性标记、筛选标记和分子标记。选择性标记通常是其被表达后使生物体表现对特定的一组环境条件具有抗性或敏感的表型的基因。筛选标记也可以表现为易观察和可分辨特性的表型，例如绿色荧光蛋白(GFP)、GUS或β -半乳糖苷酶。分子标记是例如可以被寡核苷酸探针唯一鉴定的序列特性，如RFLP(限制性片段长度多态性)，或SSR标记(简单序列重复)。“供体”或“供体构建体”指作为功能组被导入宿主细胞或生物体的全套的DNA片段，而“供体DNA”指的是与靶基因座区域足够同源的DNA片段，其可以参与靶双链断裂(DSB)位点处的重组。“基因”指包括编码蛋白质的翻译序列(“外显子”)、不翻译的间隔序列(“内含子”)、以及5’和3’端不翻译的区域和任何与前述序列结合的调控元件。“目标动物”是指靶基因所在的动物，包括人、哺乳动物、爬行动物、脊椎动物和无脊椎动物，例如，猪、马、牛、羊、狗、猫、兔子、鱼类、禽类、鸟类、大鼠、小鼠、昆虫等，鱼类例如
黄颡鱼、斑马鱼等。 “模式动物”是指在研究人类疾病中或基因在动物发育和遗传中的作用中，为了在增进对疾病的了解的同时避免对人类产生更多风险或揭示基因在动物发育和遗传中的作用机制而常规使用的活的、非人的动物。“胚胎”是指处于从受精卵形成到幼体从卵壳膜中孵化前或从母体中分娩前的发育过程中的幼体。“锌指基序” (zinc finger motif)是指由肽链的保守序列中的一对组氨酸加一对半胱氨酸(His2/Cys2)或2对半胱氨酸(Cys2/Cys2)与一个锌离子形成配位键,这些氨基酸对之间的多肽链成环状突出、折叠成的指形结构。本发明中所使用的许多遗传构建体是根据多种遗传因子彼此间的相对位置描述的。其中，“邻近的”用来表明两个元件彼此相邻而不是指两个元件的实际融合；此外，“侧面的”序列仅用来表明存在于给定序列两侧的相同、相似或相关的序列，其不是必须直接与给定序列融合，其与给定的序列之间可插入非特异的DNA。这些描述相对位置的术语和其他类似的术语，均符合遗传学领域中的通常用法。本发明中，“包含”、“包括”和“具有”可互换使用。此外，化合物“选自”指随后所、列出的一种或多种化合物，其中包括两种或多种化合物的混合物(即组合物)。本发明中，分离的化合物是已经从其自然环境中移出的化合物。因而，“分离的”未必反映该化合物已被纯化的程度。本发明的分离化合物可以是从天然来源获得的，也可以是利用分子生物学技术或通过化学合成生产的。锌指核酸酶本发明的锌指核酸酶(zinc finger nuclease或“ZFN”)是一种核酸内切酶,其能够在宿主细胞内特异识别特定基因序列并在该基因序列处促进形成双链断裂(DSB)，从而弓I导产生定向遗传重组或突变的嵌合蛋白质分子。本发明的锌指核酸酶包括DNA结合域和DNA切割域,其中该DNA结合域由至少一个锌指(zinc finger)组成并且可操作地连接到DNA切割域上(见图I)。该锌指DNA结合域在嵌合蛋白质分子的N-末端而该DNA切割域位于所述分子的C-末端。本发明的锌指核酸酶具有至少一个锌指。在一个优选的实施方案中，本发明的锌指核酸酶具有至少三个锌指，以在用于宿主细胞或生物体的定向遗传重组中具有充分的特异性。包含多于三个锌指的锌指核酸酶也在本发明的范围内。具有多个锌指的锌指核酸酶，尽管需要更多耗时地构建，但随着每个增加的锌指其具有逐渐增大的特异性。本发明的锌指结构可衍生自任何种类或类型的锌指。在一个特定的实施方案中，所述锌指结构包含Cys2His2类型的锌指，该类锌指在转录因子TFIIIA或Spl均存在。改变DNA结合域的锌指，可以改变锌指核酸酶的DNA识别和/或结合的特异性，从而可以实现在细胞DNA的任何选择位点实现定向遗传重组。这种改变可利用已知的分子生物学和/或化学合成技术来实现。本发明的锌指核酸酶可以包含对多种DNA具有识别和/或结合特异性的锌指。当锌指核酸酶的锌指的数目、类型及其空间相对位置确定后，它对DNA识别和/或结合的特异性也就随之确定。不同的锌指基序(zinc finger motif)决定了不同的锌指。相对应地，在锌指核酸酶的多肽序列中，代表锌指结构的锌指基序的数目，其氨基酸序列，以及在DNA结合域骨架多肽序列中的排列，帮助决定了锌指核酸酶的对DNA识别和/或结合的特异性。本发明的锌指核酸酶的DNA切割域衍生自非特异性的DNA内切酶，例如II型限制性内切酶的非特异性DNA切割域。在一个特定的实施方案中，该DNA切割域可以得自IIS型限制性内切酶Fok I。在本发明的一个应用中，锌指核酸酶可以包含三个Cys2His2类型的锌指，而其DNA-切割域来源于限制性内切酶Fok I。每个锌指直接接触3个连续的DNA碱基对，从而形成9bp的锌指核酸酶DNA的识别序列。在该优选实施方案中，需要两个锌指核酸酶DNA-切割域形成的二聚体以有效切割双链DNA。因此，需要两个紧密相邻的转化识别(靶DNA)位点以实现有效的靶基因定向切割。如果该靶位点的所有位置都是与锌指核酸酶特异接触的，那么需要总共18个碱基对进行识别。在两个识别位点之间可以有间隔。本发明锌指核酸酶识别位点之间的间隔可以是相当于6-35bp的DNA。在一个优选的实施方案中，两个识别位点之间的间隔为6bp。如果在锌指核酸酶的切割和识别结构区之间存在接头，则该接头可以包含选定的 氨基酸残基序列以使得所得的接头是可变的。或者为了最大的靶点特异性，可以构建无接头的构建体。无接头的构建体具有结合6bp间隔的识别位点并能随后对其进行切割的能力。然而，具有接头长度为0-18个氨基酸残基长度的锌指核酸酶介导的DNA切割发生在5-35bp间隔的识别位点之间。对于给定的接头长度，识别位点之间的间隔距离是有限制的。在一个优选方案中，接头长度为6个氨基酸残基长度。在本发明的一个具体实施方案中，切割域和识别区之间没有接头，并且靶基因座包含通过一个6bp间隔分开的相互之间方向相反的两个9bp的识别序列。为了根据本发明的优选实施方案定向遗传重组或突变，两个9bp锌指DNA识别序列必须在宿主DNA中被鉴定出来。这些识别位点彼此之间是相反方向的并且被大约6bp的间隔DNA分隔。然后设计产生在靶基因座特异地结合所述DNA识别序列的锌指组合物，然后将该锌指组合物连接到限制性内切酶的切割域上。动物基因的定向改造锌指核酸酶可识别并切割特定的基因或染色体基因座，并在此位点产生一个DNA双链切口(DSB)，而后通过DNA修复机制，利用同源重组或非同源末端连接将切口修复，从而达到靶基因定向改造的目的。本发明的方法利用了锌指核酸酶的上述特性，其可用于任何细胞或者生物体的定向遗传改造。这些方法的最低要求包括根据靶基因区域的序列信息设计识别并切割靶基因座的锌指核酸酶；采用独立的表达系统检验所设计的锌指核酸酶对靶基因区域的定向切割能力和效率，并分析所获得的基因的突变模式；利用选定的锌指核酸酶在细胞或生物体内对靶基因进行定向遗传改造，利用选定的基因突变模式筛选获得的突变细胞或突变体，从而高效地获得具有稳定的遗传性状的突变细胞或突变体。优选地，本发明的方法可用于动物基因组的定向遗传重组或突变，以定向改造动物基因组的特定基因，建立疾病的遗传模式或研究特定基因功能或使被改造的动物具备特定的经济性状。本发明的锌指核酸酶可以包括不同的DNA锌指结合域和/或DNA切割域。根据本发明的一个应用，基于所选择的内源性靶基因区域的序列信息、不同种类锌指蛋白对DNA的特异性识别以及二聚体锌指核酸酶导致双链断裂的规律，设计出锌指核酸酶的DNA锌指结合域，其与靶基因区域指定序列有特异结合作用的。锌指核酸酶的DNA切割域可以得自不同来源的非特异性DNA切割域。在本发明的一个实施方案中，根据NCBI公布的IIS型限制性内切酶Fok I的氨基酸序列，找到限制性内切酶Fok I的切割结构域，作为本发明的锌指核酸酶的DNA切割域的氨基酸序列。将所述DNA锌指结合域的氨基酸序列与限制性内切酶Fok I的切割结构区的氨基酸序列通过特定接头序列连接而得到本发明所用的锌指核酸酶的全序列。在本发明的一个优选实施例中，上述锌指核酸酶的设计可以通过计算机软件，例如 ZiFiT(http://zifit. partners, org/)来实现。本发明还包含一独立高效的筛选系统或步骤。在利用设计得到的锌指核酸酶对目标细胞的靶基因，如动物的生殖细胞的靶基因，进行定向改造之前，可以用它来检验设计的锌指核酸酶对靶基因区域的定向切割能力和效率；进一步，该系统可以用来预先分析设计的锌指核酸酶通过切割靶基因所能得到的突变模式，并帮助确定预期的目标突变模式。尽管不同的锌指核酸酶对靶基因造成的突变类型不可预计，但是发明人在本发明中发现， 用对目标动物的特定基因具特异识别的锌指核酸酶在斑马鱼胚胎内对目标动物的特定基因进行切割后所获得的主要的基因突变类型在不同批次的实验中是保守的，也即可重复出现。更进一步，将这样的锌指核酸酶注射到目标动物的胚胎后，它在目标动物的基因组中也可形成相同的主要突变类型。发明人认为这种特定基因锌指核酸酶在不同动物的胚胎细胞中切割特定基因所导致主要突变类型的重复出现是基于1)特定基因锌指核酸酶的切割点是出现在左右锌指基序组合识别的特定序列之间的特定位置上，与其它侧翼序列无关；2)针对这种切割造成的DSB所进行的NHEJ修复是一个高度保守的修复系统，其所包含的修复机器在不同动物的胚胎细胞中是高度保守的。因此，利用一独立高效的筛选系统，预先分析所设计的锌指核酸酶可能造成的各种突变模式，对确认所设计的锌指核酸酶是否可以识别特定的靶基因，是否可以诱发出预期的突变模式，以及选用哪一种突变模式用来筛选子代以获得稳定可遗传突变的性状，均具有十分重要的意义。目前已知的锌指核酸酶构建与筛选方法包括模块组装(Modular Assembly) >寡聚物化集中工程(Oligomerized Pool Engineering, OPEN)和背景参照组装(Context-Dependent Assembly, CoDA)。模块组装方法将位于不同载体上的锌指编码序列通过限制性酶切和连接的方法连接为完整的锌指结构域编码序列，并连入筛选用表达载 体，与筛选用靶载体共同转入细菌中，以细菌或酵母双杂交的方式鉴定锌指结构域的特异性结合能力。在鉴定结果为有一定的结合能力后，将锌指结构域编码序列与FokI内切功能域编码序列相连，形成完整的锌指内切酶单体基因。寡聚物化集中工程将位于不同载体上的锌指编码序列以重叠聚合酶链式反应的方法连接为完整的锌指结构域编码序列，筛选方法与模块组装相同。这些筛选方法的优点在于可以针对一对具切割功能的锌指核酸酶二聚体中的一个锌指核酸酶的锌指结构域的识别能力进行筛选，并且OPEN方法适宜进行大批量筛选。但其缺点在于按这些方法筛选锌指结构域费时费力，对一个给定基因并不总是能够筛选到有效的锌指核酸酶，且筛选出来的锌指结构域的结合能力与在体内该对锌指核酸酶能否有效切割靶基因并不完全匹配。本发明中，结合针对靶基因位点的锌指核酸酶的设计，采用了一高效的筛选系统直接确定设计的锌指核酸酶对靶基因区域的定向切割能力和效率，从而可以直接有针对性地筛选出能进行有效切割的锌指核酸酶，以更好地进行下游定向修饰动物基因组中特定基因的操作。同时，已有的锌指核酸酶构建与筛选系统并不考虑所设计的锌指核酸酶在体内所能获得的突变模式、以及如何高效地实现子代的筛选。因此，尤其是对于所得到的锌指核酸酶的切割诱变效率低下、操作周期长、或者操作的细胞数目巨大的情况下，本发明具有特别的优势。根据本发明的一个应用，所述的独立筛选系统可以是独立的表达系统。在该表达系统中，上述设计的能识别并切割靶基因的锌指核酸酶对靶基因的定向切割能力和效率可以直接得到验证。更进一步，还可以比较和分析所设计的锌指核酸酶诱发得到的一系列突变模式。基于对突变目的是否得到实现的判断，以及对突变模式出现频率的比较，可以选定将来用来筛选得到突变的子代的突变模式。上述的独立的表达系统可以为任何模式动物的卵母细胞、受精卵、I-细胞期胚胎或其他发育时期的胚胎。这些模式动物可以为小鼠，大鼠，非洲爪蟾，斑马鱼，青鏘鱼，黑腹果蝇，秀丽隐杆线虫等。优选地，所述独立表达系统可以为爪蟾卵母细胞，或斑马鱼胚胎。更优选的，所用的独立的表达系统为斑马鱼胚胎，特别是受精卵或I-细胞期胚胎。在本发明中，可以通过多种本领域公知的方法将靶基因与锌指核酸酶递送进入该独立表达系统中进行转化表达。优选地，可以将包含靶基因座的基因的表达载体如质粒，以及锌指核酸酶的mRNA，注射进所述独立表达系统，以验证所设计的锌指核酸酶对靶基因座的定向切割能力和效率，并检测所能得到的突变模式。选定的锌指核酸酶以及突变模式可用于细胞或生物体的定向遗传重组或突变，尤其是对动物基因组的定向突变。根据本发明的一个应用，设计并选定的锌指核酸酶可以注射进动物分离的受精卵中，再让其在离体或植入雌性体内发育，以期得到锌指核酸酶介导的DNA切割并产生定向的突变。为得到稳定的可遗传的突变性状，上述方法得到的子代需要进行筛选。可以应用上述步骤中选定的突变形式对子代进行筛选。在本发明的一个实施例中，基于选定的突变模式设计针对突变后的靶基因的PCR引物，利用该引物对子代进行PCR，筛取具有阳性反应的子代进一步进行遗传育种培养以最终获得具有稳定的预期遗传性状的后代。作为本发明的一个应用，本发明的方法还可用于在动物中实现生殖系基因治疗。锌指核酸酶介导的DNA切割可在有或没有供体DNA时发生。根据本发明的一些应用，例如在造成遗传重组时，供体DNA也可能是需要的。供体DNA可以是和靶基因同源或同一的DNA，也可以是非同源或同一的DNA。这些同源或异源DNA可以包含突变，核酸插入或 者多缺失。编码可识别标记的DNA可包括在DNA供体内，这种标记可包括其存在或缺少使宿主细胞或生物体表现可检测表型的基因或序列，以确定基因重组或突变的产生。多种类型的标记包括但不限于选择性标记、筛选标记和分子标记。选择性标记通常是其被表达后使生物体表现对特定的一组环境条件具有抗性或敏感的表型的基因。筛选标记可以表现出易观察和可分辨特性的表型，例如绿色荧光蛋白(GFP)、β-葡糖醛酸酶(GUS)或β-半乳糖苷酶。分子标记可以是，例如，只被寡核苷酸探针鉴定出的序列特性，例如RFLP(限制性片段长度多态性)，或SSR标记(简单序列重复)。本发明中，由锌指核酸酶切割双链DNA所诱发的重组可用于在细胞或染色体基因组中诱发各类突变，包括但不限于i) “敲除”(删除)特定的基因；ii) “敲入”(插入)用于表达的特定基因；iii)提供用于鉴定该事件的选择标记等。本发明中，依赖于每个细胞或生物体的特定条件，核酸以及核酸载体通过细胞膜/核膜的递送以及转化可通过多种已知技术进行，这些技术已被用于许多生物体和细胞，例如包括形成DNA或RNA与阳离子类脂、脂质体或其他载体材料的复合物，微量注射、粒子枪轰击、电穿孔和将转化DNA或RNA并入病毒载体等。这些技术是本领域众所周知的。
实施例应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件(如《分子克隆实验指南(第三版)》(Sambrook等著，黄培堂等译，科学出版社2002年))中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例一、定向敲除黄颡鱼基因组中肌抑素基因在渔业生产上，获得大规格成品鱼及提高成品鱼中的肌肉含量是鱼类基因工程育种的主要目标之一。肌肉生长抑制素(简称“肌抑素”)是一种肌肉生长的负调节因子，肌抑素基因突变会导致动物生长出更多的肌肉从而使动物变得更大。如肌抑素基因天然突变的牛肌肉增多，成为双肌牛(double muscle cattle);小鼠肌抑素基因敲除后肌肉增多、体型变大，成为超级鼠(supermice);斑马鱼肌抑素基因敲落后鱼个体体重增加约40%以上。相应地，敲除其它鱼类如黄颡鱼的肌抑素基因，去除该基因对肌肉发生的抑制功能，使鱼的生长速度加快、肌细胞增生与肌纤维增大，是本实施例的目的。I、识别黄颡鱼肌抑素基因的特异性锌指基序组合的设计及黄颡鱼肌抑素基因锌指核酸内切酶左链和右链全基因序列的克隆。(I)利用可自由使用的公开软件(ZiFiT http://zifit. partners, org/)设计一对可特异识别黄颡鱼基因组第一外显子(含起始密码子ATG)肌抑素基因(GENEBANK登录号DQ767967，l-3114bp)的锌指基序组合。所得的锌指基序组合分别为SEQ ID NOs. 11,12和13或SEQ ID NOs. 14、15和16。上述每对组合中的三个锌指基序被设计成在序列分别为SEQ ID NO. 2与SEQ ID NO. 5的骨架多肽上依从多肽氨基端到羧基端的方向依次排列；相应cDNA序列分别为SEQ ID NO. I与SEQ IDN0. 4。上述每对组合中的三个特定的锌指基序还可以依照相同的排列次序，分别排列在不同的骨架多肽序列上，而仍保持其对特定DNA的识别/结合特异性。例如，上述锌指基序组合SEQ ID NOs. 11、12和13或锌指基序组合SEQ ID NOs. 14、15和16还可以被设计成以从多肽氨基端到羧基端的方向，分别排列在如SEQ ID NO. 3与SEQ ID NO. 6所示的多肽序 列上。(2)使用 Vector NTI 软件(Invitrogen, Carlsbad, CA,美国)将含上述特定锌指基序组合的cDNA(SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 5)和FokI核酸内切酶基因重组形成一对特定的锌指核酸内切酶，分别称为黄颡鱼肌抑素基因锌指核酸内切酶左链(ycMYZFN-L) (DNA序列见SEQID NO. 7，氨基酸序列见SEQ ID NO. 8)和黄颡鱼肌抑素基因锌指核酸内切酶右链(ycMYZFN-R) (DNA 序列见 SEQ ID NO. 9，氨基酸序列见 SEQ ID NO. 10)。(3)依据上述黄颡鱼肌抑素基因锌指核酸内切酶左链和右链基因序列，采用人工合成的方法合成编码黄颡鱼肌抑素基因锌指核酸内切酶左链和右链的全基因DNA。(4)将上述黄颡鱼肌抑素基因锌指核酸内切酶左链和右链全基因DNA分别克隆到pST1374 载体(购自 Addgene, Cambridge, MA,美国)与 pcDNA (-) 3. I 载体(购自 Addgene,Cambridge, MA，美国)中(两个基因位于载体上17启动子的控制下，新获得的克隆载体分别称为 pST1374-ycMYZFN-L、pcDNA3. I (-)-ycMYZFN-R。2、在斑马鱼胚胎内验证如上设计的黄颡鱼肌抑素基因锌指核酸内切酶(含左链和右链)具有可特异切割黄颡鱼肌抑素基因造成该基因移码突变的能力。(I)利用美国英杰生命技术有限公司(Invitrogen, Carlsbad, CA,美国)mMessage mMachine T7 Ultra试剂盒(AM1345)，以上述两个克隆载体pST1374-ycMYZFN_L、pcDNA3. I (-) -ycMYZFN-R为模板进行体外转录合成相应的mRNA。(2)将合成所得的两种mRNA等量混合、加无核酸酶水稀释至浓度分别为200ng/U L，成为锌指核酸内切酶注射液，预备于步骤3 (2)中使用。(3)将黄颡鱼肌抑素基因基因组DNA的全长(Genbank登录号DQ767967，l-3114bp)通过TA克隆方法克隆到pGEM-T载体(购自PROMEGA，Madison，WI，美国)上，新得到的克隆称为pGEM-T_yc_mstn。(4)将含pGEM-T-yC_mstn克隆载体的溶液用蛋白酶K去除核酸酶然后再去除蛋白酶K后与两种锌指内切酶mRNA溶液加水混合至终浓度分别为50ng/ U I和200ng/ U I。(5)将上述核酸混合液注射入斑马鱼I-细胞期胚胎，24小时后用苯酚氯仿抽提方法提取全胚胎DNA作为PCR模板(将胚胎浸泡在500 u I含有IOmM Tris (pH = 8)、
0.IM EDTA,0. 5% SDS和10 y g/ml蛋白酶K的裂解液中，在50摄氏度温浴I小时，其间经常震荡。加入500iil I I的苯酚氯仿，震荡后离心10分钟(12，OOOg)，吸取400 ill上清液，加入40 ill 3M NaCl,以及800 无水乙醇，混匀后离心10分钟(2，OOOg)，用75%的乙醇洗涤沉淀，将沉淀晾干后加入IOOiU去离子水溶解)。以被打靶的黄颡鱼肌抑素基因的锌指内切酶靶位点附近序列作为PCR引物(正、反向引物序列分别为5，-gatcccaaggtgttcctgtt-3，(SEQ ID NO. 56)和 5，-cttgaagacggagctgcttg-3，(SEQ IDNO. 57))进行PCR扩增。PCR反应条件为94摄氏度2分钟，30个循环(94摄氏度30秒，60摄氏度30秒，72摄氏度30秒)，72摄氏度5分钟。(6)将上述PCR产物经柱层析纯化后TA克隆连接到pGEM_T载体上，将5 U I所得的连接产物加入50 u I DH5 a感受态细胞，在冰上静置30分钟，在42摄氏度热激90秒，在冰上静置2分钟后涂布到含有100ng/ml氨苄青霉素的培养基平板上，在37摄氏度培养14 小时后随机挑取克隆进行PCR鉴定(条件同上)，最后随机选取100个含目标片段的克隆进 行测序鉴定，确定黄颡鱼肌抑素基因基因组DNA被黄颡鱼肌抑素基因锌指核酸内切酶切割后形成的独特的基因重组方式。3、在经人工授精获得的黄颡鱼体外受精卵中，验证该对特异锌指核酸内切酶可特异切割黄颡鱼基因组中肌抑素基因造成该基因移码突变。(I)通过人工授精技术，获得黄颡鱼体外受精卵(参考MWesterfield(2000)，斑马鱼书斑马鱼实验手册，第4版Univ. of Oregon出版社)。其具体方法为，在预定进行显微注射的前一天晚上9点进行激素催产，即将黄颡鱼任一侧胸鳍展开，用注射器从暴露出的胸鳍基部刺入，向体内注射溶于0. 68% NaCl溶液中的3 ii g黄体生成素释放激素(LHRH-A2)和150IU人绒毛膜促性腺激素(hCG)，向雌鱼注射6 y g黄体生成素释放激素(LHRH-A2)和300IU人绒毛膜促性腺激素(hCG)。在进行显微注射当天，监视雌鱼排卵情况，用手指轻轻挤压雌鱼腹部，如果卵即从泄殖腔孔排出，则雌鱼已进入排卵理想状态，此时从鱼体前部向后部滑动挤压雌鱼腹部将卵尽量挤出并盛接在装有0. 68% NaCl溶液的玻璃培养皿中。剖开雄鱼腹部,取出精巢,研磨至看不到明显的组织小块,加3ml 0.68% NaCl溶液在研磨物中，搅动以悬浮研磨物，用滴管吸取此人工精液，滴入盛有卵的培养皿中迅速混匀。然后将这些受精卵用滴管吸取分散到装有已曝气的自来水或去离子水的培养皿中在解剖镜下立即用于显微注射。(2)利用显微注射技术将黄颡鱼肌抑素基因锌指核酸内切酶注射液(浓度200ng/UL)注入黄颡鱼I-细胞期的体外受精卵中。(3)将注射后的黄颡鱼受精卵在室温25摄氏度下培养3天，随机选取40个胚胎按苯酚氯仿抽提法提取基因组DNA作为PCR模板。以被打靶的黄颡鱼肌抑素基因的锌指内切酶靶位点附近序列作为PCR引物(正反向引物序列分别为5，-gatcccaaggtgttcctgtt-3J (SEQ ID NO. 56)和 5，-cttgaagacggagctgcttg-3，(SEQ IDNO. 57))进行PCR扩增。PCR反应条件为94摄氏度2分钟，30个循环(94摄氏度30秒，60摄氏度30秒，72摄氏度30秒)，72摄氏度5分钟。将产物在含0. 02%溴化乙锭(EB)的1%琼脂糖中的水平电泳槽中进行电泳。电泳15分种后，在254nm波长的紫外灯下观察电泳胶分子量289bp左右的条带。
(4)将上述PCR产物经切胶纯化后TA克隆连接到pGEM_T载体上，将5 μ I所得的连接产物加入到50 μ I DH5 α感受态细胞，在冰上静置30分钟，在42摄氏度热激90秒，在冰上静置2分钟后涂布到含有50 μ g/ml氨苄青霉素的培养基平板上，在37摄氏度培养14小时后随机挑取克隆进行PCR鉴定(条件同上)，最后随机选取100个含目标片段的克隆进行测序鉴定，确定黄颡鱼基因组肌抑素基因被黄颡鱼肌抑素基因锌指核酸内切酶切割后形成的独特的基因重组方式。4、分析移码突变肌抑素基因的突变类型，确定含移码突变肌抑素基因的鱼创建者的基因型。
(I)同时分析在斑马鱼胚胎中和黄颡鱼体外受精卵中，黄颡鱼基因组肌抑素基因被黄颡鱼肌抑素基因锌指核酸内切酶切割后形成的独特的基因重组方式。在预期的切割位点，相比较野生型的基因序列(如SEQ ID NO. 17所示)，锌指核酸酶切割后引发的NHEJ修复造成多种不同的突变形式如SEQ ID NOs. 18-55所示。其中，无论是在斑马鱼胚胎中还是在黄颡鱼体外受精卵中，锌指酶造成的主要的突变类型均一致(总结于表I)。特别是，如SEQ ID NO. 35所示的移码突变的出现频率在两者中均占了所有获得的突变类型的50%以上。并且，该突变可形成无功能的截短肌抑素蛋白，符合本实验敲除肌抑素基因的目的。因此，该移码突变类型被确定为所设计的锌指核酸酶诱发的主要突变类型，并被作为以下将要筛选的创建者的基因型。(2)针对上述选定的主要突变类型,设计PCR引物,序列分别为5’ -ccaacagtccaacagctcctct-3，(SEQ ID NO. 58)和 5，-cgcttcacgctcctccgtcactcac-3，(SEQ ID NO. 59)。然后在特定的PCR条件下(94摄氏度2分钟，30个循环(94摄氏度30秒，70摄氏度30秒，72摄氏度30秒)，72摄氏度5分钟)分别以含黄颡鱼肌抑素基因主要突变类型的克隆载体和含黄颡鱼肌抑素基因基因组DNA (Genebank登录号DQ767967)为模板进行PCR扩增，并将产物在含O. 02%溴化乙锭(EB)的1%琼脂糖中的水平电泳槽中进行电泳。电泳15分种后，在254nm波长的紫外灯下观察电泳胶，以含黄颡鱼肌抑素基因主要突变类型的克隆载体为模板的泳道出现290bp左右分子量的条带，而含黄颡鱼肌抑素基因基因组DNA为模板的泳道无扩增条带。从而确定上述引物可特异扩增黄颡鱼肌抑素基因主要突变类型。(3)将注射了黄颡鱼肌抑素基因锌指核酸内切酶后的黄颡鱼受精卵在室温25摄氏度下培养两个月，剪取所孵化幼鱼的部分尾鳍或胸鳍或背鳍，提取基因组DNA用作PCR模板。用上述设计的PCR引物在上述特定的条件下进行PCR反应，并将一半产物进行电泳。在254nm波长的紫外灯下观察电泳胶，出现290bp左右分子量的条带。将该条带对应的另一半PCR产物经柱层析纯化后TA克隆重组到pGEM-T载体中，在对阳性克隆测序后确定该PCR扩增片段来自移码突变肌抑素基因。从而确定提供该模板的幼鱼为黄颡鱼肌抑素基因被改造的创建者(founder)。5、筛选含移码突变肌抑素基因的黄颡鱼创建者的子一代，并以子一代为亲本自交，获得含去除肌抑素功能的突变肌抑素基因的纯合体的新品系黄颡鱼。(I)将所得的携带移码突变肌抑素基因的黄颡鱼创建者饲养至性成熟，每个个体分别与野生黄颡鱼通过人工授精方式进行人工繁殖获得体外受精卵。将体外受精卵在室温下培养至受精后4小时，随机选取50个胚胎一组(其余胚胎继续培养发育)，按常规方法提取胚胎基因组DNA作为PCR模板，然后用在3 (3)中所描述的方法进行鉴定，如果PCR产物含有阳性条带，则将该PCR产物克隆测序确定其是否来自含突变的肌抑素基因的模板。共检测最多1000个胚胎，一旦确定在选取的胚胎中含突变的肌抑素基因，就将其余胚胎培养至两个月大的幼鱼，然后按4(3)所描述的方法通过剪取部分鱼鳍确定每个幼鱼的基因型。含突变的肌抑素基因的子一代即为携带突变肌抑素基因的杂合子黄颡鱼。
(2)将携带突变等位基因杂合子的黄颡鱼饲养至性成熟，然后相互交配。对得到的后代饲养至两个月后用4 (3)进行基因型鉴定，并通过定量PCR对幼鱼基因组中含突变肌抑素基因的拷贝数进行定量，在基因组中含两份拷贝的幼鱼即为突变肌抑素基因纯合子的黄颡鱼。将此基因型的黄颡鱼饲养至性成熟，纯合子自交后可达到形状可稳定遗传的含突变肌抑素基因的新品系黄颡鱼。该品系黄颡鱼个体的肌肉含量、体格或生长速度比野生型黄颡鱼显著增大。表I野生型黄颡鱼肌抑素基因(Genbank登录号DQ767967)外显子I部分序列(自起始密码子计，5-199号核苷酸)(长度为195bp) ATTTAGCGCAGGTTGTGATTTCTCTGGGCTTCGTGGTGGCTTTCGCCCCTATTGCGCGCACTGACACCGGCGCACCGGAGCACCAGCAGCAGCACCAACAACAACCCACTGCCGTGACGGAGGAGCGTGAAGCGCAGTGTTCAGCGGCCAGCGCGTGCGCTTTCCGCCAGCACAGCAAGCAGCTCCGTCTTCAAG(SEQ ID NO. 17)经黄颡鱼肌抑素基因锌指核酸酶切割后形成的突变的黄颡鱼肌抑素基因外显子序列的主要类型(选定的突变类型用下划线标出)ATTTAGCGCAGGTTGTGATTTCTCTGGGCTTCGTGGTGGCTTTCGCCCCTATTGCGCGCACTGACACCGGCGCACCGGAGCACCAGCAGCAGCACCAACAACAACCCACTGCCGTGA-GAGGAGCGTGAAGCGCAGTGTTCAGCGGCCAGCGCGTGCGCTTTCCGCCAGCACAGCAAGCAGCTCCGTCTTCAAG(SEQ ID NO. 18)ATTTAGCGCAGGTTGTGATTTCTCTGGGCTTCGTGGTGGCTTTCGCCCCTATTGCGCGCACTGACACCGGCGCACCGGAGCACCAGC AGCAGCACCAACAACAACCCACTGCCGTGA—AGGAGCGTGAAGCGCAGTGTTCAGCGGCCAGCGCGTGCGCTTTCCGCCAGCACAGCAAGCAGCTCCGTCTTCAAG(SEQ ID NO. 19)ATTTAGCGCAGGTTGTGATTTCTCTGGGCTTCGTGGTGGCTTTCGCCCCTATTGCGCGCACTGACACCGGCGCACCGGAGCACCAGCAGCAGCACCAACAACAACCCACTGCCGT——GAGGAGCGTGAAGCGCAGTGTTCAGCGGCCAGCGCGTGCGCTTTCCGCCAGCACAGCAAGCAGCTCCGTCTTCAAG(SEQ ID NO. 20)ATTTAGCGCAGGTTGTGATTTCTCTGGGCTTCGTGGTGGCTTTCGCCCCTATTGCGCGCACTGACACCG
GCGCACCGGAGCACCAGCAGCAGCACCAACAACAACC-ACTGCCG-----GAGGAGCGTGAAGCGCAGTGTTCAGCGGCCAGCGCGTGCGCTTTCCGCCAGCACAGCAAGCAGCTCCGTCTTCAAG(SEQ ID NO. 21)ATTTAGCGCAGGTTGTGATTTCTCTGGGCTTCGTGGTGGCTTTCGCCCCTATTGCGCGCACTGACACCG
GCGCACCGGAGCACCAGCAGCAGCACCAACAACAACCCACTGCC-------------GTGAAGCGCAGTGTTCAGCGGCCAGCGCGTGCGCTTTCCGCCAGCACAGCAAGCAGCTCCGTCTTCAAG(SEQ ID NO. 22)ATTTAGCGCAGGTTGTGATTTCTCTGGGCTTCGTGGTGGCTTTCGCCCCTATTGCGCGCACTGACACCG
GCGCACCGGAGCACCAGCAGCAGCACCAACAACAACCCACTG----------------------------------
----------------TTCCGCCAGCACAGCAAGCAGCTCCGTCTTCAAG(SEQ IDNO. 23)ATTTAG---------------------------------------------------------------
——GGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGTTAGGGTTAGGGTT-GTGACGGAGGAGCGTGAAGCGCAGTGTTCAGCGGCCAGCGCGTGCGCTTTCCGCCAGCACAGCAAGCAGCTCCGTCTTCAAG(SEQ ID NO. 24)
权利要求
1.一种定向改造动物基因组中特定基因的方法，包括根据目标动物靶基因区的序列设计特异识别并切割靶基因的锌指核酸酶，使用独立的表达系统验证所述锌指核酸酶对靶基因的定向切割能力和效率，利用选定的锌指核酸酶对目标动物的胚胎的靶基因进行定向遗传改造并获得稳定的遗传性状。
2.权利要求I的方法，还包括使用独立的表达系统筛选所获得的基因突变模式，并利用选定的突变模式筛选定向遗传改造所获得的子代。
3.权利要求I的方法，所述独立的表达系统为模式动物的卵母细胞或胚胎。
4.权利要求3的方法，所述模式动物为小鼠、大鼠、非洲爪蛙、斑马鱼、青鏘鱼、黑腹果蝇和/或秀丽隐杆线虫等常用的实验动物。
5.权利要求3的方法，所述独立的表达系统为斑马鱼的胚胎。
6.权利要求2的方法，所述突变模式的筛选根据在所述独立表达系统中获得的突变模式的出现频率来决定。
7.权利要求6的方法，所述选定的突变模式在所有获得的突变模式中的出现频率最闻。
8.权利要求2的方法，所述利用选定的突变模式筛选定向遗传改造所获得的子代的方法包括基于所选定的突变模式设计PCR引物；利用所设计的PCR引物，采用PCR的方法检测所获得的子代的基因型。
9.权利要求I的方法，其中目标动物为黄颡鱼，靶基因为肌肉生长抑制素基因。
10.权利要求8的方法，其中所选定的基因突变模式包括如SEQIDNOs. 18-55所示的核苷酸序列的任意一种。
11.一种特异性识别并切割黄颡鱼肌肉生长抑制素基因的锌指核酸酶或其衍生物，其多肽序列从氨基端到羧基端的方向包含三个锌指基序，分别为SEQ ID NOs. 11、12和13或SEQ ID NOs. 14、15 和 16。
12.权利要求11的锌指核酸酶或其衍生物，其多肽序列包含如SEQID NOs. 2、3、5、和6所示的氨基酸序列中的任意一种。
13.分离的多肽及其衍生物，其包含如SEQID NOs. 2、3、5、和6所示的氨基酸序列中的任意一种。
14.分离的多核苷酸，其包含编码如权利要求11所述的锌指核酸酶多肽或其衍生物的核苷酸序列或其互补序列。
15.分离的多核苷酸，其包含编码如权利要求12所述的锌指核酸酶多肽或其衍生物的核苷酸序列或其互补序列。
16.分离的多核苷酸，其包含编码如权利要求13所述多肽及其衍生物的核苷酸序列或其互补序列。
17.—种含有外源多核苷酸的重组表达载体,其由权利要求13-16中任一项所述的多核苷酸与质粒，病毒，或运载体构建而成。
全文摘要
本发明涉及利用一种定向诱变动物基因组的方法。具体来说，本发明提供一种新的利用锌指核酸酶定向改造动物基因组的特定基因的方法，包括根据目标动物靶基因区的序列设计特异识别并切割靶基因的锌指核酸酶，使用独立的表达系统验证所述锌指核酸酶对靶基因的定向切割能力和效率，利用选定的锌指核酸酶对目标动物的胚胎的靶基因进行定向遗传改造并获得稳定的遗传性状。进一步，本发明还涉及使用所述的独立表达系统，筛选利用所设计的锌指核酸酶所获得的主要的基因突变模式，并利用选定的突变模式高效筛选定向遗传改造所获得的子代。另一方面，本发明还涉及利用所述方法，获得能特异识别黄颡鱼肌肉生长抑制素基因的锌指核酸酶，并定向地敲除了黄颡鱼的肌肉生长抑制素基因。
文档编号C12Q1/02GK102653756SQ20111005237
公开日2012年9月5日 申请日期2011年3月4日 优先权日2011年3月4日
发明者董张及, 赵庆顺 申请人:南京大学