专利名称：一种鉴定山羊早期胚胎性别的方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，涉及利用PCR技术扩增山羊AMEL基因进行早期胚胎性别鉴定的方法。
背景技术：
早期胚胎性别鉴定技术，是家畜胚胎移殖技术的一项重要内容，也是实现家畜后代性别控制的主要途径之一。早期的一些性别鉴定方法如免疫学方法、细胞学方法等，由于所需时间较长、或者对胚胎伤害较大、鉴定的准确率不高等种种原因而无法应用于生产实践中。近年来，随着性别鉴定技术的不断发展，性别控制主要采取两条途径x精子与Y精子的分离和早期胚胎性别的鉴定；虽然流式细胞仪已能成功分离X、Y精子，但其成本高，分离效率低，暂时还难以在规模化生产中应用。而随着胚胎移植技术的发展，特别是PCR技术的出现，使早期胚胎性别鉴定成为目前最具实用价值的一项性别控制技术。用于胚胎性别鉴定的PCR法有多种，起初，利用PCR反应体系对哺乳动物进行性别鉴定是对SRY基因(位于Y染色体上的特有序列)的扩增。然而，SRY基因只显示一条带，当实验过程中SRY基因条带没有出现时，不能判定是雌性样本还是实验过程中出现了错误。虽然有同时存在于雌性和雄性中的基因(像ZFX/Y)作阳性对照，但需要增加时间和材料。利用AMEL基因进行性别鉴定可以克服上述缺点。AMEL基因同时存在于X和Y染色体上的同源区，根据其内含子长度在两条性染色体上的不同，能扩增出不同长度的基因片段，在牛上已用于性别鉴定。根据AMEL基因在X和Y染色体同源区上存在不同程度碱基缺失的特点，设计巢式引物，雌性PCR产物经过电泳检验只得到对应X染色体的一条雌雄共有条带，而雄性得到分别对应于X染色体的雌雄共有条带和对应于Y染色体的雄性特有条带。目前，多采用SRY基因对山羊进行性别鉴定，采用AMEL基因的却鲜有报道。
发明内容
针对现有技术中存在的问题与缺陷，本发明的目的是提供一种鉴定山羊早期胚胎性别的方法，该方法是利用引物对山羊AMEL基因巢式PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳检测，出现两条带者为雄性样品，出现一条带者为雌性样品，不需要另外设计内标引物作为阳性对照。实现上述发明目的的技术方案是一种鉴定山羊早期胚胎性别的方法，具体包括下列步骤1)取少量山羊发情后第7 8天胚胎做为样品；2)将胚胎样品用无钙镁的磷酸缓冲液中洗涤三次，在100°C灭菌超纯水煮沸 lOmin，然后5000g离心3min，钭上清液直接作为模板进行PCR反应；3)在15 μ L PCR Mix液中加入上下游巢式外引物和5 μ L模板，预变性94°C 5min ； 94°C 30s, 62°C 30s, 72°C 30s，共 22 个循环；最后 72°C延伸 5min ；所述的上游巢式外引物5'-CATGGT GCCAGCTCAGCAG-3‘
所述的下游巢式外引物5'-CCGCTTGGTCTTGTCTGTTGC-3‘4)在3yL PCR产物中加入7yL PCR Mix和上下游巢式内引物，预变性94°C 5min ；94°C 30s, 62°C 30s, 72°C 30s，共 40 个循环；最后 72°C延伸 5min，停止反应；上游巢式内引物5‘ -CAGCAACCAATGATGCCAGTTC-3 ‘下游巢式内引物5'-GTCTTGTCTGTTGCTGGCCA-3‘5)将扩增产物于1. 5%的琼脂糖凝胶电泳后于凝胶成像仪中观察，出现两条带者为雄性样品，一条带者为雌性样品。所述的PCR Mix 液中包括 50mmol/L KCl、20mmol/L Tris-HC 1,3mmo 1 /LMgSO4, 400mmol/L dNTPs 和 0. IU/ μ L Taq DNA 聚合酶。所述的电泳条件是75V，30min。本实验采用AMEL基因对山羊早期胚胎进行性别鉴定，目的是建立一种更加快捷、 准确的山羊胚胎性别鉴定方法，推进山羊性别控制技术在生产中的应用。胚胎性别鉴定技术与MOET(超数排卵和胚胎移植)技术结合，可使早期胚胎性别鉴定成为目前最具实用价值的一项性别控制技术。与目前的性别鉴定技术相比，本发明的优点在于1)利用该巢式PCR引物进行PCR鉴定时，出现两条带者为雄性样品，一条带者为雌性样品，不需要另外设计内标引物这样就不存在性控引物和内标引物扩增效率不同的问题，同时由于只需使用2条引物，一能简化实验操作，二能降低实验成本，三能减少引物太多导致交叉产生引物二聚体等不良因素。2)该方法与其他胚胎生产技术相结合进行山羊的繁育，可提高山羊的繁育效率， 迅速增加良种山羊的数量，提高山羊种群质量，加速品种选育工作。3)本发明采用的巢式PCR引物具有较高的特异性、准确性和敏感性，适合少量样品的扩增，便于在生产中应用。
图1为山羊基因组DNA AMEL基因片段巢式引物的扩增性别鉴定图；图2为山羊基因组DNA AMEL基因扩增部分结果图；图3 IOpg量山羊基因组DNA AMEL基因片段巢式引物的扩增性别鉴定图；图4山羊胚胎AMEL基因片段巢式扩增性别鉴定图。
具体实施例方式以下通过发明人给出的具体实施例来进一步说明本发明鉴定山羊早期胚胎性别的方法的有益效果。通过对已知性别的山羊基因组DNA进行性别鉴定，检测引物的特异性及敏感性。实验例1 引物特异性检测1)取新鲜山羊血液，用酚/氯仿法提取基因组DNA ；2) PCR反应体系中10 μ L PCR Mix，10 μ mol/L上下游巢式外引物各0. 8 μ L，灭菌超纯水 7. 4yL，lyL DNA 模板量为 20ng，共 20 μ L。预变性 94°C IOmin ；94 °C 30s, 62 °C 30s, 72°C 30s，共 30 个循环；72°C 5min，停止反应；
3)取IyL PCR反应产物加入新PCR管中，再加入IOyL PCR Mix，0. 8 μ L引物，灭菌超纯水 7. 4yL，共 20yL;预变性 94°C IOmin -MV 30s, 62°C 30s, 72°C 30s 共 30 个循环，最后72°C延伸5min，停止反应。4)取5 μ L PCR扩增产物于1. 5%的琼脂糖凝胶中进行电泳，电压75V，电泳时间 30min，紫外透射仪观察扩增结果，PCR扩增产物中出现两条带者判定为雄性，出现一条带者判定为雌性。鉴定结果与实际性别完全符合。如附图1和图2所示，其中图1中M:DL-2000 DNA分子量标记；1 巢式外引物无模版阴性对照；2 雄性山羊巢式外引物扩增X和Y两条带；3 雌性山羊巢式外引物扩增X—条带；4 无模版阴性对照；5 雄性山羊内引物扩增X 和Y两条带；6 雌性山羊内引物扩增X 一条带；图2中M为DL2000 DNA Marker ； 1、3、5、7、 9为雄性；2、4、6、8、10为雌性。实验例2 引物敏感性检测1)将模板梯度稀释至 IOOpg/ μ L，IOpg/ μ L ；2)第一轮PCR扩增，其中4μ L PCR Mix，10 μ mol/L上下游巢式外引物各0. 15 μ L， IyL模板，14. 7yL 灭菌超纯水，共 20yL;预变性 94°C 5min ；然后 94°C 30s,62°C 30s， 72°C 30s，共22个循环；最后72°C延伸5min。3)第二轮PCR反应其中4μ L Taq mix、10 μ mol/L上下游巢式内引物0. 3 μ L，取 3 μ L第一次PCR产物作模板，循环参数为94°C 5min ；94°C 30s,62°C 30s, 72°C 30s，共 40 个循环；最后72°C延伸5min，停止反应。4)取5 μ L PCR扩增产物点样于1. 5%的琼脂糖凝胶中进行电泳，电压75V，电泳时间30min，紫外透射仪观察扩增结果，均出现明显条带。如附图3所示，图中M:DL2000 DNA Marker ；1、3、5 为雄性；2、4、6 为雌性。实验例3 山羊胚胎性别鉴定1)供体于发情后第7 8天回收胚胎。用显微操作仪或手工切割法取得少量胚胎样品，取样后的胚胎于鉴定后移植或进行冷冻保存；2)胚胎样品用无钙镁的磷酸缓冲液中洗涤三次，转入PCR管中100°C灭菌超纯水煮沸lOmin，然后5000g离心3min，取上清液直接作为模板进行PCR反应；3)在新的PCR管中加入4 μ L PCR Mix液、10 μ mol/L上下游巢式外引物各 0. 15 μ L、5 μ L模板、8 μ L灭菌超纯水，共20 μ L，在PCR仪中预变性94°C 5min ；然后94°C 30s, 62°C 30s, 72°C 30s，共 22 个循环；最后 72°C延伸 5min。4)取出6yL PCR产物加入新管中，再加入10 μ L PCR Mix、10 μ mol/L上下游巢式内引物各0.6 μ L、加灭菌超纯水补足20 μ L，在PCR仪中预变性94°C 5min;然后94°C 30s, 62°C 30s, 72°C 30s，共40个循环；最后72°C延伸5min，停止反应；5)将扩增产物于1. 5%的琼脂糖凝胶电泳后于凝胶成像仪中观察。凡出现两条带者为雄性样品，只有一条带者为雌性样品。如附图4所示，图中M:DL2000 DNA分子量标记； 早雌性，X —条带；汐雄性，X和Y两条带。
权利要求
1.一种鉴定山羊早期胚胎性别的方法，其特征在于，包括下列步骤1)取少量山羊发情后第7 8天胚胎做为样品；2)将胚胎样品用无钙镁的磷酸缓冲液中洗涤三次，在100°C灭菌超纯水煮沸lOmin，然后5000g离心3min，取上清液直接作为模板进行PCR反应；3)在新的PCR管中加入4yLPCR Mix液、10 μ mol/L上下游巢式外引物各0. 15 μ L、 5 μ L模板、8 μ L灭菌超纯水，共20 μ L，在PCR仪中预变性94°C 5min ；然后94°C 30s, 62°C 30s, 72°C 30s，共22个循环；最后72°C延伸5min ；所述的上游巢式外引物5' -CATGGT GCCAGCTCAGCAG-3‘所述的下游巢式外引物5' -CCGCTTGGTCTTGTCTGTTGC-3‘4)在3yLPCR产物中加入7yL PCR Mix和上下游巢式内引物，预变性94°C 5min ； 94°C 30s, 62°C 30s, 72°C 30s，共 40 个循环；最后 72°C延伸 5min，停止反应；上游巢式内引物5 ‘ -CAGCAACCAATGATGCCAGTTC-3 ‘下游巢式内引物5 ‘ -GTCTTGTCTGTTGCTGGCCA-3 ‘5)将扩增产物于1.5%的琼脂糖凝胶电泳后于凝胶成像仪中观察，出现两条带者为雄性样品，一条带者为雌性样品。
2.根据权利要求1所述的鉴定山羊早期胚胎性别的方法，其特征在于，所述的PCRMix 液中包括 50mmol/L KCl、20mmol/L Tris-HCl,3mmo 1 /LMgSO4,400mmo 1 /L dNTPs 禾口 0. IU/μ L Taq DNA聚合酶。
3.根据权利要求1所的鉴定山羊早期胚胎性别的方法，其特征在于，所述的电泳条件是 75V，30min。
全文摘要
本发明公开了一种鉴定山羊早期胚胎性别的方法，包括1)取少量山羊发情后第7～8天胚胎做为样品；2)将胚胎样品、洗涤、灭菌超纯水煮沸10min、然后5000g离心3min，取上清液直接作为模板进行PCR反应；3)在新的PCR管中加入4μL PCR Mix液、10μmol/L上下游巢式外引物各0.15μL、5μL模板、8μL灭菌超纯水，共20μL，扩增；4)在3μL PCR产物中加入7μL PCRMix和上下游巢式内引物，扩增；5)将扩增产物于1.5％的琼脂糖凝胶电泳，出现两条带者为雄性样品，一条带者为雌性样品。该方法能够稳定地扩增出相应基因序列，具有较高的准确定和敏感性。
文档编号C12Q1/68GK102181523SQ20111005499
公开日2011年9月14日 申请日期2011年3月9日 优先权日2011年3月9日
发明者唐纪伟, 韩春梅, 高庆华 申请人:塔里木大学