专利名称：一种用于制定个体化减重方案的分子标记试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种试剂盒，尤其涉及ー种用于制定个体化减重方案的分子标记试剂盒。
背景技术：
2007年2月，世界卫生组织发布ー项各国肥胖比例的调查报告。报告显示，当今65亿人ロ中，全球约有17亿人超重，其中3亿为肥胖。据统计显示中国目前超重者高达2亿，其中肥胖者也已超过9000万名。专家预測，中国在未来十年里肥胖人群将会超过2亿。
在过去几十年中，由人们体力活动水平逐步减少和食物变得过于丰富，导致人们的生活方式发生改变，从而引发了肥胖在世界范围内的蔓延。然而，事实上，尽管人们处于相同的环境中，但并不是不是每个人都变得肥胖，这表明遗传因素在也会对人类的体重变化产生一定影响。也就是说，遗传能够决定不同的个体在处于相同的环境中时，是否具有肥胖的易感性，同时，也决定了不同的个体对不同的饮食与运动干预的响应程度。因此，实现个体化体重管理不仅是营养学的发展方向，而且具有十分重要的社会意义和经济价值。与肥胖相关度较大的基因如下FTO基因=FTO基因是最近被发现的能够编码一种修饰DNA的酶。另ー项研究还发现，在肥胖人群中，FTO基因在脂肪组织中的水平増加。但目前仍然还不能准确的了解到该基因是如何影响BMI的。这个基因区域的SNP位点似乎都与BMI有关，但还不能够了解这些SNP位点对BMI的影响是直接的还是间接地。FTO基因的SNP位点几乎都只与脂肪组织相关。这就意味着该基因的风险等位基因是人体体重増加的途径是使脂肪组织增加，而不是増加肌肉的体积或者骨骼密度。研究数据表明人FTO基因变异可能会导致FTO基因表达的上调或者失调，而携帯风险等位基因者可能在不改变能量消耗的情况下通过过量摄食造成肥胖。Cecil等研究了FTO基因变异与肥胖、能量消耗和食物摄入的可能联系，发现FTO基因的变异虽然导致了肥胖的易感性却没有显示出其可直接调控能量消耗，而是可能在控制食物摄取和食物选择中发挥作用，表明FTO基因与食欲过剩的表型或者喜好高能量食物有关系。如果FTO基因只有ー个副本变异，与无变异副本的人相比，肥胖的几率也要高出30%。发生微小变异在肥胖个体中很普遍。携帯两个变异拷贝的人，平均体重比拥有正常拷贝的个体重三公斤。而另ー项关于FTO基因的研究发现，携帯FTO基因但积极參加体育锻炼的人，他们的体重与非肥胖基因携帯者一祥，这意味着，携帯FTO的人群，体育锻炼将是最好的减肥手段。FABP2基因FABP2基因编码小肠脂肪酸结合蛋白，在小肠腔内脂肪酸吸收和转运的过程中起着重要的作用。这种蛋白在小肠上皮细胞中被发现(小肠上皮细胞的对脂肪的吸收具有強烈的影响)。而该基因的突变能够导致其编码的脂肪酸结合蛋白结合脂肪酸的能力大大增加，换句话说，这种突变造成了人体吸收脂肪的能力的大大增加。
已经有很多临床研究证明，携帯风险等位基因的个体，其肠道吸收膳食脂肪酸的能力得到了加強。且风险等位基因与BMI、体脂的升高、腹部脂肪的増加、肥胖以及瘦素分泌水平有夫。许多临床膳食干预研究表明，风险等位基因携帯者餐后体内的甘油三酯和14-18碳长链脂肪酸的浓度水平大大超过不正常个体。因此，风险等位基因携帯者，需要严格控制脂肪摄入量。PPARG基因过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)是核激素受体(NHR)超家族成员，它们是配体激活转录因子且与脂类代谢，血糖稳态以及细胞增生与分泌等多种通路相关。过氧化物酶体増殖物激活受体G(PPARG)在脂肪细胞中高表达并在脂肪的形成中起着非常重要的作用，多种參与脂肪酸转运和代谢的基因在转录水平受PPARG调控，如脂肪细胞脂肪酸结合蛋白(AFABP)、脂肪酸转运蛋白(FATP)、脂蛋白脂酶(LPL)等，可以增加脂肪酸转运蛋白和脂肪酸转运酶的表达，刺激细胞对脂肪酸的摄取和向脂酰辅酶A的转化。
到目前为止，大约有30多个高水平科研论文指出，PPARG基因与肥胖存在密切的关联，其中，该基因的Prol2Ala多态位点与肥胖的关联性也成为最具代表性的ー个发现。Memisoglu等人的研究发现，Pro等位基因携带个体,对食物中脂肪的总量更敏感。相比于那些摄入膳食脂肪较少的Pro/Pro纯合子等位基因携带个体来说，摄入膳食脂肪较多的个体，其平均BMI显著增高，而这种情况在Ala等位基因携帯者群体中则没有发生。在芬兰的一项关于糖尿病的大型研究中，科学家们得到了基因型影响膳食干预效果的有力证据。在这项为期3年的运动膳食干预实验中，Ala/Ala等位基因携帯者(-8. 3Kg)，减重效果优于Pro/Ala等位基因携带者(-4. OKg);而后者又优于Pro/Pro等位基因携带者(-3. 4Kg)。这些研究指出，Ala等位基因携帯者在脂肪的储存以及转移方面，具有更好的代谢灵活性。并通常具有容易发胖、饮食及运动干预对其减重更为有效、胰岛素敏感性较好以及II型糖尿病低发病风险。因此，Pro等位基因为风险等位基因。ADRB2基因ADRB2基因编码的蛋白肾上腺素能受体蛋白广泛分布于脂肪细胞。它与儿茶酚胺结合后激活腺苷酸环化酶(AC)使环磷酸腺苷(cAMP)生成增多，进ー步激活蛋白激酶A，作用于多种脂代谢相关的酶类、离子通道及转录因子，从而促进脂肪分解。该基因的多个导致氨基酸变化的突变位点已经被识别出来。一些较长周期的临床研究表明，ADRB2等位基因的携帯者，无论是从儿童期到成年期的体重增长，还是成年期的体重增长都更多。一项临床研究表明，高碳水化合物饮食能够导致ADRB2基因的SNP位点27Glu等位基因的女性携带者的肥胖风险明显增加，同时，该饮食方式与未携带该等位基因的女性的肥胖风险无关，这表示，27Glu等位基因増加了个体肥胖的风险，当该个体长期采取高碳水化合物的因素方式。ADRB3基因ADRB3受体分布在人的棕色和白色脂肪组织、腹内网膜细胞、胆囊等组织，因为这些组织含有丰富的交感神经，它们主要是通过释放去甲肾上腺素来激动ADRB3受体，从而激活线粒体上的偶联蛋白，刺激脂肪酸氧化和磷酸化而消耗体内过多的脂肪，该受体机能下降与肥胖的病理生理有夫.β 3肾上腺素受体基因在人群中呈多态性表达，目前已发现该受体基因上有4个单核苷酸多态性，其中一个为功能性变异，这可能是ADRB3基因变异通过绑定ADRB3受体蛋白实现功能发挥造成活性下降，降低内脏脂肪分解和能量产生，导致脂肪在内脏及腹部的堆积。Beta-3肾上腺素能受体蛋白主要表达在脂肪细胞，尤其在内脏脂肪细胞，參与调节腹腔内脂肪组织的脂解及产热过程。该基因序列上的T — C突变，导致氨基酸多肽序列上的色氨酸被精氨酸取代，由于这ー突变正好位于受体的第一个细胞内功能区，可致机体内脂肪分解能力下降，生热作用减弱。ー项研究中，76个日本妇女參加了一个预防肥胖的研究，包括饮食的改变(在减少能量摄入)和体力活动(歩行)，以及个性化的监测和支持性団体治疗。结果表明，携两个A等位基因的妇女，其体重减轻与減少能量摄入和增加步行量直接相关。然而，有ー个或两个风险等位等位基因的妇女没有有明显的体重减轻，尽管明显减少了她们的能量摄入，増加了她们的歩行量。因此，需要建立一套以个体对肥胖的遗传易感性为參考的个性化的减肥方案，以改善减肥和保持体重的成效。而要了解个体对肥胖的遗传易感性、不同饮食和运动方式的反应的差异，就需要建立一套检测方法，分辨与人体能量代谢相关的基因的基因型。通过检测这些基因位点，可了解个体对肥胖的遗传易感性、不同饮食和运动方式的反应的差异，并向被检人提供个性化的体重管理方案。
目前，商业用的基因分型方法主要包括有l)MiCix)array芯片虽然可以高通量、较为准确地检测分型，但成本较高，且仪器价格昂贵；2)全基因组测序，虽然能很好分型，但是机器昂贵，成本高，同时，用于特异的SNP位点分型显然过于浪费。3)荧光PCR系统虽然较前两种方法更经济ー些，但检测规模有限，不利于商业化。相比较而言，酶切及PCR-SSCP SNP位点分型法更适合商业机构进行目标模板的基因分型1)需要的成本较低；2)灵敏度相对较高；3)特异性强；4)能够同时进行大量样品的检测，有利于规模化检测，适合于商业应用。酶切分型法PCR-RFLP 限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。5' ...G I AATTC...3'3'…CTTAA f G…5'如果SNP产生或消除了某个限制性内切酶位点，则可以通过对PCR产物酶切，电泳后检测。该方法可以针对已知DNA序列的SNP位点，利用特定限制性内切酶特异的识别SNP位点的不同碱基，从而精确分析出该SNP位点的基因型。结合序列分析，可做到对大批量样品的目的DNA片度的“全扫描”分析，不仅成本低，而且自动化程度高，因此，在进行基因诊断和多态性分析，包括单核苷酸多态(SNP)的检测中，PCR-RFLP技术不失为ー种准确、快速、简便、经济的技术手段。PCR-SSCP 分型法DNA 单链构象多态性(Single Strand Conformation Polymorphism, SSCP)SSCP是指等长的单链DNA因核昔酸序列的差异而产生构象变异，在非变性聚丙烯酞胺中的表现为电泳迁移率的差別。单链DNA构象分析对DNA序列的改变非常敏感，常常一个碱基差别都能显示出来。在SSCP分析中，利用PCR技术定点扩增基因组DNA中某一目的片段，将扩增产物进行变性处理，双链DNA分开成单链，再用非变性聚丙烯酞胺凝胶电泳分离，根据条带位置变化来判断目的片段中是否存在突变。PCR-SSCP技术是检测DNA突变最为直观而精确的实验技术手段之一，该方法对长度在100-300bp之间的DNA片度突变检测的灵敏度可达100%，结合序列分析，可做到对大批量样品的目的DNA片度的“全扫描”分析，不仅成本低，而且自动化程度高，因此，在进行基因诊断和多态性分析，包括单核苷酸多态(SNP)的检测中，PCR-SSCP技术不失为ー种准确、快速、简便、经济的技术手段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于制备个体化减重方案的分子标记试剂盒，其包含SEQ ID NO :1-10所示的核苷酸。所述试剂盒还包含限制性内切酶Hha I、Msp I和Bbvl。所述试剂盒还包含DNA提取液。所述DNA提取液包含缓冲液GA、缓冲液GB、缓冲液GD、漂洗液PW、洗脱缓冲液TB和蛋白酶K。所述试剂盒还可以包含吸附柱、收集管和离心管。具体地，SEQ ID NO :1_10所示的核苷酸可用于制备个体化减重方案的分子标记试剂盒，其可用作引物。其中，引物SEQ ID NO :1-2用于扩增FTO基因；引物SEQ ID NO 3-4用于扩增FABP2基因；引物SEQ ID NO :5_6用于扩增ADRB3基因；引物SEQ ID NO :7_8用于扩增PPARG基因；引物SEQ ID NO :9_10用于扩增ADRB2基因。通过本发明提供的试剂盒，对检测者SNPs基因型的分析，出具综合遗传体质分析报告単，由营养师向被测者推荐适合其减重的饮食方式(低脂饮食、低碳水化合物饮食、平衡饮食)，井根据被测者的实际情況，分析其每天需要的摄入热量，个体化地安排三餐中3大营养元素(脂肪、蛋白质、碳水化合物)的比例，从而达到健康、科学、有效减重的目的。而且，本发明采用的试剂盒，其可以通过酶切及PCR-SSCP SNP位点分型法更适合商业机构进行目标模板的基因分型1)需要的成本较低；2)灵敏度相对较高；3)能够同时进行大量样品的检测，有利于规模化检测，适合于商业应用。为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。
图I是本发明的试验流程示意图；图2是PCR扩增结果，其中M，600bp DNA marker，泳道I为引物SEQ IDNO 1~2对FTO基因扩增的片度；泳道2为引物SEQ ID NO :3_4对FABP2基因扩增的片度；泳道3为引物SEQ ID NO :5-6对ADRB3基因扩增的片度；泳道4为引物SEQID NO :7_8对PPARG基因扩增的片度；泳道5为引物SEQ ID NO 9-10对ADRB2基因扩增的片度；图3是FABP2基因的rs 1799883位点酶切判型图，其中M，600bp DNAmarker ;泳道1-3为G等位基因的纯合子；泳道4-6为A等位基因的纯合子；泳道7-9为G/A等位基因的杂合子；图4是ADRB3rs4994位点的酶切判型图，其中，M，600bp DNAmarker泳道1_2为T等位基因的纯合子；泳道3为T/C等位基因的杂合子；图5是ADRB2rsl042714位点的酶切判型图，其中，M泳道为DNAMarkerDL 1000，泳道1-2为CC纯合型；泳道3-4为GC杂合型；泳道5为GG纯合型；
图6是FTO rs9939609位点的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图，泳道2、5，A/A等位基因纯合子；泳道1、3、6、7，A/T等位基因杂合子；泳道4，T/T等位基因纯合子(泳道2、4为參考物)；图7是FTO rs9939609的A/A等位基因的纯合子测序图；图8是FTO rs9939609的T/T等位基因的纯合子测序图；图9是PPARG rsl801282位点的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图，其中，泳道1、3、7，C/C等位基因纯合子；泳道2、5、6，C/G等位基因杂合子；泳道4，G/G等位基因纯合子(泳道
1、4为參考物);图10是PPARG rsl801282的C/C等位基因的纯合子测序图； 图11是PPARG rsl801282的G/G等位基因的纯合子测序图。
具体实施例方式请參考图I，其是本发明的试验流程示意图，其基本试验流程为I、提取DNA模板；2、PCR扩增含有特定SNP位点的片段；3、利用酶切法分别对FABP2基因的rs 1799883位点，ADRB3基因的rs4994位点，以及ADRB2基因的rsl042714位点进行分型；利用PCR-SSCP分型法对FTO基因的rs9939609位点，PPARG基因的rsl801282位点进行分型；最后根据分型结果对受试者给出合理的减肥方案。实施例I :提取口腔黏膜细胞DNA用ロ腔黏膜拭子采集受检者口腔内的黏膜细胞，利用上海天根生物生产的ロ腔拭子基因组DNA提取试剂盒提取受检者的基因组DNA。步骤如下I.处理材料将在面颊内擦拭过的拭子转置于2ml离心管中，用剪刀将棉签部分从其杆上剪下，加入400 μ I缓冲液GA。2.加入20 μ I蛋白酶K溶液，涡旋10秒混匀，56°C放置60分钟，其间每15分钟涡
旋混匀数次。3.加入400 μ I缓冲液GB，充分颠倒混匀，70°C放置10分钟，此时溶液应变清亮，
简短离心以去除管盖内壁的液滴。4.加200 μ I无水こ醇，充分颠倒混匀，简短离心以去除管盖内壁的液滴。5.将上一歩所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CR中(吸附柱CR放入收集管中)，12，000rpm ( 13，400Xg)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR放回收集管中。6.向吸附柱CR中加入500μ I缓冲液⑶(使用前请先检查是否已加入无水こ醇)，12，OOOrpm( 13，400Xg)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR放回收集管中。7.向吸附柱CR中加入700μ I漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水こ醇)，12，OOOrpm( 13，400Xg)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR放回收集管。8.向吸附柱CR中加入500 μ I漂洗液Pff, 12，OOOrpm( 13，400 Xg)离心30秒，倒掉收集管中的废液。
9.将吸附柱CR放回收集管中，12，OOOrpm( 13，400Xg)离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CR室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。10.将吸附柱CR转入ー个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20-50 μ I洗脱缓冲液TB，室温放置2-5分钟，12，OOOrpm ( 13，400 Xg)离心2分钟。11.离心后便得到了还有基因组DNA的洗脱液，可直接作为DNA模板使用。实施例2 =PCR扩增含有特定SNP位点的片段I.引物的制备依次为SEQ ID NO :卜10以下第I号至第5号引物由深圳华大基因合成表I
权利要求
1.一种用于制定个体化减重方案的分子标记试剂盒，其特征在于，包含SEQID NO:1-10所示的核苷酸。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含限制性内切酶HhaI、Msp I 和 BbvIo
3.根据权利要求I或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含DNA提取液。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA提取液包含缓冲液GA、缓冲液GB、缓冲液GD、漂洗液PW、洗脱缓冲液TB和蛋白酶K。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含吸附柱、收集管和离心管。
6.SEQ ID NO :1-10所示的核苷酸在制备个体化减重方案的分子标记试剂盒中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述核苷酸用作引物。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，引物SEQID NO :1-2用于扩增FTO基因；引物SEQ ID NO :3-4用于扩增FABP2基因；引物SEQ ID NO :5_6用于扩增ADRB3基因；引物SEQ ID NO :7-8用于扩增PPARG基因；引物SEQID NO :9_10用于扩增ADRB2基因。
全文摘要
本发明涉及一种用于制定个体化减重方案的分子标记试剂盒。该试剂盒包含SEQ ID NO1-10所示的核苷酸。还可以包含限制性内切酶Hha I、Msp I和BbvI。应用该试剂盒，对检测者SNPs基因型的分析，出具综合遗传体质分析报告单，由营养师向被测者推荐适合其减重的饮食方式(低脂饮食、低碳水化合物饮食、平衡饮食)，并根据被测者的实际情况，分析其每天需要的摄入热量，个体化地安排三餐中3大营养元素(脂肪、蛋白质、碳水化合物)的比例，从而达到健康、科学、有效减重的目的。
文档编号C12Q1/68GK102676639SQ20111005485
公开日2012年9月19日 申请日期2011年3月8日 优先权日2011年3月8日
发明者鲁浪 申请人:重庆卡农科技有限公司