专利名称：伊氏锥虫与路氏锥虫二重pcr检测试剂盒及制备方法
技术领域：
本发明公开一种伊氏锥虫与路氏锥虫二重PCR检测试剂盒，用于伊氏锥虫与路氏锥虫快速PCR检测，本发明还提供了该试剂盒的制备方法，属于寄生虫检测技术领域。
背景技术：
锥虫(Trypanosoma)是哺乳动物血液中的一种常见鞭毛虫，是一类具有广泛宿主的人畜共患寄生原虫，流行于亚非拉美各大洲。在不同洲流行种类也有所不同，在亚洲及我国主要流行伊氏锥虫(Trypanosoma evansi)和路氏锥虫(Trypanosoma lewisi)。伊氏锥虫传播途径主要经吸血昆虫机械性传播和胎盘感染。在畜牧养殖业中可引起家畜的伊氏锥虫病，造成家畜日渐消瘦，甚至死亡。Joshi等报道印度有感染人的病例。此外，路氏锥虫在世界各地啮齿动物的感染也较为普遍，主要寄生在褐鼠体内，自然条件下通过媒介蚤传播， 国外已有人体感染病例报道，2007年有报道泰国确诊病例为路氏锥虫感染；印度也有类似报道。有调查报道我国东北部地区人群中路氏锥虫抗体阳性，人群中可能存在亚临床或误诊病例，目前给我国畜牧业和公共卫生也带来了新的威胁。
发明内容
本发明提供一种伊氏锥虫与路氏锥虫二重PCR检测试剂盒，可用于伊氏锥虫与路氏锥虫的同时快速鉴别和检测。本发明进一步提供了上述试剂盒的制备方法。本发明的多种重要水源性人兽共患原虫同时检测试剂盒，包括以下部分 (1)样本裂解液与DNA提取试剂
样本裂解液NaCl、Tris-HCl, EDTA、SDS和蛋白酶K的混合溶液；其中，浓度配比为 NaCl IOOmM, Tris-HCKpH 7. 5) 20Mm、EDTA 25 Mm、SDS 2% (w/v)和蛋白酶 K 0. 1 μ g/ μ 1 ； DNA提取试剂为酚氯仿异戊醇(24:25:1)。(2)PCR反应液含反应终浓度各100_300μΜ的4种dNTPs，反应终浓度各 IO-IOOpmol/μ 1的引物，1.5-4. 5mM的Mg2+浓度；DNA聚合酶，灭菌蒸馏水。(3) 二重 PCR 引物
伊氏锥虫引物TE-a与TE-s，路氏锥虫引物TL-a与TL_s ； (4)阳性对照阳性对照为伊氏锥虫DNA和路氏锥虫DNA。(5)阴性对照取灭菌蒸馏水为阴性对照样本。本发明的试剂盒可以含有琼脂糖Agarose (99. 0%)、溴酚蓝点样缓冲液(5U/μ L) 和Taq酶(5U/ μ L)，溴化乙锭(10 μ g/ μ L)；还可以含有PCR反应管。本发明所述试剂盒的制备方法，包括以下步骤 (1)样本裂解液与DNA提取试剂
样本裂解液将NaCl、Tris-HCl、EDTA、SDS和蛋白酶K制成混合溶液；其中，浓度配比为NaCl IOOmM, Tris-HCl(pH 7. 5) 20Mm、EDTA 25 Mm、SDS 2% (w/v)和蛋白酶 K 0. 1 μ g/μl；
DNA提取试剂为酚氯仿异戊醇(25:Μ: 1)。(2) 二重 PCR 引物
在GeneBank上比对选取伊氏锥虫和路氏锥虫特异诊断基因，分别Roht 1.2 VSG基因和18S rRNA基因。伊氏锥虫(扩增片段大小为482bp) TE-a 5'CGGGTCGTCTGCTAAAGT3'
TE-s 5'GCCCGCAGTTGCCTAT3' 路氏锥虫(扩增片段大小为^lbp) TL-a 5'GAGCTCAAGCGGCAGGTTA3' TL-s 5' TGCGCGAGAAGAGAGGACT 3'
(3)PCR反应液，含反应终浓度各100-300μ M的4种dNTPs，反应终浓度各IO-IOOpmol/ μ 1的引物，1. 5-4. 5mM的Mg2+浓度；DNA聚合酶，灭菌双蒸水；
(4)阳性对照为伊氏锥虫DNA和路氏锥虫DNA，比较PCR产物以及监测PCR操作过程是否正确；
(5)阴性对照取灭菌蒸馏水为阴性对照样本，目的在排除反应液中的核酸污染和操作过程中的假阳性问题。本发明的积极效果在于利用二重PCR特异性检测方法，根据伊氏锥虫和路氏锥虫种特异基因序列设计引物，通过优化PCR反应体系和条件来提高其敏感性，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后观察结果。本发明可同时对伊氏锥虫和路氏锥虫进行快速准确的检测与鉴别，具有简单方便、灵敏度高、特异性强等特点。
图1为本发明二重PCR特异性验证图2为本发明二重PCR检测伊氏锥虫灵敏度图； 图3为本发明二重PCR检测路氏锥虫灵敏度图。
具体实施例方式为了便于理解本发明，特例举以下实施例。其作用被理解为是对本发明的阐释而非对本发明的任何形式的限制。实施例1
1、二重PCR鉴别检测试剂盒的引物设计根据选取的特异基因利用生物软件设计二重PCR引物如下 伊氏锥虫
TE-a 5'CGGGTCGTCTGCTAAAGT3' TE-s 5'GCCCGCAGTTGCCTAT3' 路氏锥虫
TL-a 5'GAGCTCAAGCGGCAGGTTA3' TL-s 5' TGCGCGAGAAGAGAGGACT 3'以上两对引物在同一体系中(二重PCR反应体系)能同时扩增检测出伊氏锥虫和路氏锥虫特异基因片断，能够实现同时检测和鉴别伊氏锥虫与路氏锥虫的目的。、样本裂解液与DNA提取试剂的配制
按照下列浓度配比 NaCl IOOmM, Tris-HCl(pH 7. 5) 20Mm、EDTA 25 Mm、SDS 2% (w/v) 和蛋白酶K O.lyg/μ 进行混合，制备样本裂解液；DNA提取试剂体积比为25:24: 1的酚氯仿异戊醇。、PCR反应液的配制
含反应终浓度各100-300μΜ的4种dNTPs，反应终浓度各IO-IOOpmol/μ 1的引物， 1. 5-4. 5mM的Mg2+浓度；DNA聚合酶，灭菌双蒸水；
4、对照
阳性对照为伊氏锥虫DNA和路氏锥虫DNA ；阴性对照为灭菌双蒸水；
5、反应体系优化
二对引物各自浓度的优化设置引物在体系的终浓度梯度为0.5μΜ、1μΜ、1.5μΜ、 2 μ Μ、2. 5 μ Μ、3 μ Μ，用此区间的引物尝试都得到相应的扩增，其中当引物量为IOpmol (引物的贮存浓度为20ρπιΟ1/μ L，取0. 5μ L)终浓度为0. 5 pmol/yL时效果最佳。二对引物各自退火温度的优化设置引物的退火温度分别为47°C、50°C、53°C、 55 °C、57 °C、59 °C、61V、63 °C，在梯度PCR仪上进行扩增，结果在55 °C时两引物都有最优化的扩增。此外，本发明的试剂盒还可以含有琼脂糖(Agarose)、溴酚蓝点样缓冲液和Taq 酶，其浓度优选为溴化乙锭IOyg/μ L ；溴酚蓝点样缓冲液和Taq酶5U/yL。还可以含有 PCR反应管。实验例1、二重PCR鉴别检测方法特异性实验
取1 ng日本血吸虫、杜氏利氏曼原虫与瑟氏泰勒虫作为阴性模板按照该PCR反应体系和扩增条件扩增，验证其特异性。结果显示对照样本均无扩增，符合属特异检测标准，图1。实验例2
二重PCR鉴别检测方法敏感性实验
取血样经计数后，将每mL血液含锥虫虫体数1 X IO5个、1 X IO4个、1 X IO3个、1 X IO2个、 10个、1个、0. 5个浓度以PBS缓冲液稀释，按照模板处理方法进行提取基因组，并进行PCR 扩增检测，验证其灵敏度。结果显示路氏锥虫与伊氏锥虫二重PCR检测方法最低检测限可以达到1个虫体/反应，属高灵敏度检测方法，符合敏感性检测标准，见图2-3。实验例3
试剂盒的稳定性和重复性实验
阳性模板，PCR反应液可在-20°C条件下长期贮存，溶解后4°C条件4°C保存即可，应避免反复冻融。当贮存时间为30天、60天、100天、150天、200天时取出各组分，按照检测体系检测试剂盒稳定性。取15份阳性样本用此试剂盒重复试验3次，15份PCR阴性样本同样重复3次。结果表明在以上各时段取出的组分在稳定性和重复性试验中无假阳性与假阴性结果出现，故此试剂盒稳定性和重复性良好。实验例4试剂盒的保质期试验
将分别在4°C和-20°C贮存1个月、3个月、5个月、7个月和10个月的试剂盒取出，按照检测体系对已知样本进行检测。结果表明在4°C和-20°C条件下保存达10月之久的试剂盒仍能对样本作出准确的检测。检测例1
分别采集16份伊氏锥虫感染小鼠血样和19份路氏锥虫感染大鼠血样，用经典的瑞氏染色方法作对比结合二重PCR方法对样品进行检测。(一)瑞氏染色法
将每个样本以PBS稀释3-5倍后滴片，滴加瑞氏染液使染液铺满血涂面，染色Imin ；以蒸馏水轻柔冲洗表面5min，晾干后置于显微镜下观察镜检。(二)二重 PCR 检测 1、样本的预处理
取样本0. 5mL，水平离心机3000g离心沉淀。2、样本DNA的提取
(1)将上述沉淀转移到1. 5mL离心管中，加入ImL裂解液，在液氮和65°C水浴中反复冻
融三次。(2)将冻融后的样品加入5-6 μ 1 (20mg/mL)蛋白酶K，使其终浓度为100 μ g/mL。 混勻后在65°C水浴中浸泡lh。(3)用酚氯仿:异戊醇(24:25:1)进行抽提两次，12000g离心十分钟。(4)将上面的水相小心的吸取到灭菌的EP管中，注意不要吸取中层变性的蛋白层。(5)在水相中加入3M醋酸钠(PH5. 2)60-70 μ 1，再加入2倍体积的冷乙醇在_20°C 冰箱中沉淀lh。(6)将沉淀完全的样品在4°C冷冻离心机中12000g离心30min，弃上清后再用75%
酒精洗涤一遍。(7)弃酒精后在晾干，用TE缓冲液或是灭菌4蒸水溶解保存，待检。3、PCR 扩增
(1)按待检样品数+2的PCR反应管取PCR反应液、Taq酶等，混于一管中，建立20 μ 1 体系，在涡旋器上混勻备用。(2)取阴性和阳性对照各1 μ L分别加入标记好的管中，然后取样品各1 μ L依次加入并标记好，置于PCR仪中。(3 ) PCR扩增条件为95 °C预变性5min，95 °C变性30s，55 °C退火40s，72 °C延伸 30s，扩增30个循环，72°C最终延伸lOmin。4、PCR产物观察
称取琼脂糖，配制0. 8%的琼脂糖凝胶，按0. 5 μ g/mL加入Ε. B.，用电泳液混勻后 (0. 8%-1. 0%)在微波炉中加热2分钟。等胶冷却后在加样孔中分别加样，IOOV电压下电泳 10分钟，之后在紫外灯下观察实验结果，如果出现482bp扩增条带证明是伊氏锥虫感染；如果出现^lbp扩增条带证明是路氏锥虫感染。(三)、瑞氏染色法和二重PCR检测结果经瑞氏染色法和二重PCR检测比较，发现16份伊氏锥虫血样中瑞氏染色法检出14例伊氏锥虫，二重PCR法检出16例伊氏锥虫；19份路氏锥虫血样中瑞氏染色法检出18例路氏锥虫，二重PCR法检出19例路氏锥虫。同时瑞氏染色法未能对伊氏锥虫和路氏锥虫作出准确的鉴别，而二重PCR检测法可对二者进行区分。
权利要求
1.一种伊氏锥虫与路氏锥虫二重PCR检测试剂盒，包括以下部分(1)样本裂解液与DNA提取试剂样本裂解液NaCl、Tris-HCl, EDTA、SDS和蛋白酶K的混合溶液；其中，浓度配比为 NaCl IOOmM, Tris-HCKpH 7. 5) 20Mm、EDTA 25 Mm、SDS 2% (w/v)和蛋白酶 K 0. 1 μ g/ μ 1 ； DNA提取试剂为酚氯仿异戊醇(24:25:1)；(2)PCR反应液含反应终浓度各100-300μ M的4种dNTPs，反应终浓度各IO-IOOpmol/ μ 1的引物，1. 5-4. 5mM的Mg2+浓度；DNA聚合酶，灭菌蒸馏水；(3)二重PCR引物 伊氏锥虫引物TE-a与TE-s， 路氏锥虫引物TL-a与TL-s ；(4)阳性对照阳性对照为伊氏锥虫DNA和路氏锥虫DNA；(5)阴性对照取灭菌蒸馏水为阴性对照样本。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于还可以含有琼脂糖(99. 0%)、溴酚蓝点样缓冲液(5U/y L)和Taq酶(5U/y L)，溴化乙锭 (lOyg/yL)；还可以含有PCR反应管。
3.权利要求1所述试剂盒的制备方法，包括以下步骤(1)样本裂解液与DNA提取试剂样本裂解液将NaCl、Tris-HCl、EDTA、SDS和蛋白酶K制成混合溶液；其中，浓度配比为NaCl IOOmM, Tris-HCl(pH 7. 5) 20Mm、EDTA 25 Mm、SDS 2% (w/v)和蛋白酶 K 0. 1 μ g/ μ ；DNA提取试剂为酚氯仿异戊醇(25:Μ: 1)(2)二重PCR引物在GeneBank上比对选取伊氏锥虫和路氏锥虫特异诊断基因，分别Roht 1.2 VSG基因和18S rRNA基因；伊氏锥虫(扩增片段大小为482bp) TE-a 5'CGGGTCGTCTGCTAAAGT3' TE-s 5'GCCCGCAGTTGCCTAT3' 路氏锥虫(扩增片段大小为^lbp) TL-a 5'GAGCTCAAGCGGCAGGTTA3' TL-s 5' TGCGCGAGAAGAGAGGACT 3'(3)PCR反应液，含反应终浓度各100-300μ M的4种dNTPs，反应终浓度各IO-IOOpmol/ μ 1的引物，1. 5-4. 5mM的Mg2+浓度；DNA聚合酶，灭菌双蒸水；(4)阳性对照为伊氏锥虫DNA和路氏锥虫DNA，比较PCR产物以及监测PCR操作过程是否正确；(5)阴性对照取灭菌蒸馏水为阴性对照样本；(6)组装试剂盒。
全文摘要
本发明公开一种伊氏锥虫与路氏锥虫二重PCR鉴别检测试剂盒，用于伊氏锥虫与路氏锥虫快速PCR检测，本发明还提供了该试剂盒的制备方法，利用二重PCR特异性检测方法，根据伊氏锥虫和路氏锥虫种特异基因序列设计引物，通过优化PCR反应体系和条件来提高其敏感性，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后观察结果。本发明可同时对伊氏锥虫和路氏锥虫进行快速准确的检测与鉴别，具有简单方便、灵敏度高、特异性强等特点。
文档编号C12Q1/68GK102191324SQ20111009387
公开日2011年9月21日 申请日期2011年4月14日 优先权日2011年4月14日
发明者任文陟, 宫鹏涛, 张国才, 张楠, 张西臣, 李建华, 李淑红, 李 赫, 杨举, 王明山, 王景林, 苏利波 申请人:吉林大学