专利名称：沙冬青抗旱基因的筛选方法
技术领域：
本发明涉及基因的筛选方法，尤其涉及一种沙冬青抗旱基因的筛选方法。
背景技术：
非生物胁迫是现代农业的严重危害，特别是干旱，成为影响农业的最重要的因素之一。近年来，由于我国工业发展迅速，环境遭到污染，温室效应日趋严重。随着温度的不断升高及沙漠化扩大的影响，我国农业受到了干旱的严重的影响。目前我国有超过50%的可耕种农地受到干旱影响，有20%的可耕种农地的旱情严重。即使是在降水量较多的华中及其华南地区，由于降水量分布不均匀，这些地区的农作物比如水稻几乎每年都在扬花的关键时期受到干旱影响，从而直接影响产量，旱情严重的甚至颗粒无收；而我国北方大部分地区，本来降水量就偏低，再加上日趋严重的旱情，农业的发展状况更是不容乐观。我国作 为农业大国，供养着接近世界人口的四分之一的人口，因此农业对于我国乃至全世界都是重中之重。对于抗旱，世界各种的植物学研究工作者们一直将其作为重点研究课题，为此做了大量的工作，也取得了长足的进步。目前，对于植物抗旱，一般倾向于筛选抗旱基因，然后采用抗旱基因进行抗旱植株育种的方式得到抗旱性好的植株，因而通过筛选，获得良好的抗旱基因就成为抗旱育种的关键。
发明内容
本发明的目的在于克服上述不足，提供一种沙冬青抗旱基因的筛选方法，它能够迅速有效地筛选出沙冬青的抗旱基因。为了达到上述技术目的，本发明采用以下技术方案一种沙冬青抗旱基因的筛选方法，其中，包括以下步骤I)取干旱处理的沙冬青2)采用2 X CTAB的方法提取RNA3) RNA 纯化4)反转录合成cDNA5)高通量测序6)获取差异表达序列7)检索及软件分析获得抗旱基因。沙冬青具有很低的水势和蒸腾强度，而束缚水含量很高，沙冬青不但水势低，吸水能力很强，而且从叶到茎都具有抑制蒸腾失水的旱生结构。可见沙冬青抗旱性优秀，选用沙冬青来筛选抗旱基因，能够获得优良的抗旱基因。上述沙冬青抗旱基因的筛选方法，其中，所述沙冬青的种子使用70%体积比的乙醇浸泡，然后用10%质量比的次氯酸钙消毒后，使用无菌水冲洗。上述沙冬青抗旱基因的筛选方法，其中，步骤2)提取RNA经过以下流程
(I)将沙冬青真叶或茎段于-20°C研磨成粉，加入预热65°C的缓冲液，震荡，于65°C水浴(2)加入苯酚/氯仿/异戊醇，于4°C离心，取上清(3)加入 LiCl，-20°C放置(4)弃上清，70 %体积比乙醇漂洗沉淀(5)除去乙醇，加入无水乙醇_20°C放置(6)于4°C离心，采用DEPC处理的水溶解沉淀(7)琼脂糖凝胶电泳，电压检测，-70°C贮藏。上述沙冬青抗旱基因的筛选方法，其中，所述步骤(2)、(3)重复两次。上述沙冬青抗旱基因的筛选方法，其中，所述步骤5)测序后进行污染分析，随机选取若干条读长组装后，于NCBI NR数据库进行比对。上述沙冬青抗旱基因的筛选方法，其中，所述步骤5)测序后使用DNASTARNGEN软件将测序结果和野生型测序结果进行组合组装。上述沙冬青抗旱基因的筛选方法，其中，所述步骤6)中将获得差异表达基因进行初步筛选，选取差异表达4倍以上的基因。上述沙冬青抗旱基因的筛选方法，其中，所述步骤6)、7)中应用DNASTAR:ArrayStar软件对转录组进行了差异表达分析。本发明相比现有技术具有以下优点(I)本发明沙冬青抗旱基因的筛选方法，选用沙冬青来筛选抗旱基因，能够获得优良的抗旱基因。(2)本发明沙冬青抗旱基因的筛选方法，对沙冬青的转录组进行分析以筛选抗旱基因，能够全面、准确地筛选出优良的抗旱基因。
图I为野生型沙冬青测序结果污染鉴定2为本发明干旱处理沙冬青测序结果污染鉴定图。
具体实施例方式下面结合附图及实施例对本发明进行进一步的说明本发明沙冬青抗旱基因的筛选方法较佳依次含有以下步骤I、实验材料处理选用取自于内蒙古阿拉善沙漠地区沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)种子作为实验材料。沙冬青种子在不使用的情况下于4°C密封保存。对于本文中使用的实验材料，首先将存放于4°C冰箱的沙冬青种子取出，在超净工作台中，使用70%的乙醇将其浸泡30s，然后用10%次氯酸钙消毒20min后,使用无菌水冲洗3_5次,之后将其播种于MS固体培养基上，培养一个月，将幼苗从培养基中取出移栽，生长一个月后，干旱缺水一个月，然后收集它们的叶片与茎段，将其置于液氮中，然后放入_80°C冰箱中保存备用。2、RNA 提取RNA的提取采用2XCTAB的方法。RNA提取试剂见表I、表2。RNA提取流程如下、
(I)取0. 2g干旱处理的沙冬青真叶及茎段放入在_20°C预冷的研钵中，液氮中研磨成粉，加事先经65°C预热的RNA提取缓冲液800 ill。震荡，65°C水浴5min，震荡3次。
(2)将离心管从水浴中取出，冷却至室温，加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇，震荡IOmin0 4°C, 12000rpm 离心 lOmin。(3)取上清，氯仿/异戊醇重复抽提一次。(4)取上清，加入 1/5 体积 10mmol/L 的 LiCl，_20°C放置 lh。(5) 4°C, 12000rpm 离心 20min。
(6)弃上清，吸干净底部残留的液体。(7) 400 u I DEPC 水溶解沉淀，再加入 1/5 体积 10mmol/L 的 LiCl，_20°C放置 lh。(8)4°C，12000rpm离心15min，弃上清，70%乙醇漂洗沉淀2-3次。(9)4°C, 12000rpm离心IOmin,除去乙醇,于室温通风橱中自然风干,约15min。(10)将溶液转至I. 5mL的离心管中，加2倍体积预冷的无水乙醇，_20°C放置3h。(11)于 4°C, 12000rpm 离心 20min。(12) 20 u L DEPC处理的水溶解沉淀。(13) I %琼脂糖凝胶电泳，120V电压检测。-70°C贮藏备用。表I 2 X CTAB RNA提取缓冲液
权利要求
1.一种沙冬青抗旱基因的筛选方法，其特征在于包括以下步骤 1)取干旱处理的沙冬青 2)采用2X CTAB的方法提取RNA 3)RNA纯化 4)反转录合成cDNA 5)高通量测序 6)获取差异表达序列 7)检索及软件分析获得抗旱基因。
2.根据权利要求I所述沙冬青抗旱基因的筛选方法，其特征在于所述沙冬青的种子使用70%体积比的乙醇浸泡，然后用10%质量比的次氯酸钙消毒后，使用无菌水冲洗。
3.根据权利要求I所述沙冬青抗旱基因的筛选方法，其特征在于所述步骤2)提取RNA经过以下流程 (1)将沙冬青真叶或茎段于-20°C研磨成粉，加入预热65°C的缓冲液，震荡，于65°C水浴 (2)加入苯酚/氯仿/异戊醇，于4°C离心，取上清 (3)加入LiCl，-20°C放置 (4)弃上清，70%体积比乙醇漂洗沉淀 (5)除去乙醇，加入无水乙醇_20°C放置 (6)于4°C离心，采用DEPC处理的水溶解沉淀 (7)琼脂糖凝胶电泳，电压检测，-70°C贮藏。
4.根据权利要求3所述沙冬青抗旱基因的筛选方法，其特征在于所述步骤(2)、(3)重复两次。
5.根据权利要求1-4任意一项所述沙冬青抗旱基因的筛选方法，其特征在于所述步骤5)测序后进行污染分析，随机选取若干条读长组装后，于NCBI NR数据库进行比对。
6.根据权利要求1-4任意一项所述沙冬青抗旱基因的筛选方法，其特征在于所述步骤5)测序后使用DNASTAR NGEN软件将测序结果和野生型测序结果进行组合组装。
7.根据权利要求1-4任意一项所述沙冬青抗旱基因的筛选方法，其特征在于所述步骤6)中将获得差异表达基因进行初步筛选，选取差异表达4倍以上的基因。
8.根据权利要求1-4任意一项所述沙冬青抗旱基因的筛选方法，其特征在于所述步骤6)、7)中应用DNASTAR =ArrayStar软件对转录组进行了差异表达分析。
全文摘要
本发明提供一种沙冬青抗旱基因的筛选方法，其包括以下步骤1)取干旱处理的沙冬青，2)采用2×CTAB的方法提取RNA，3)RNA纯化，4)反转录合成cDNA，5)高通量测序，6)获取差异表达序列，7)检索及软件分析获得抗旱基因；本发明采用沙冬青进行转录组分析，筛选沙冬青抗旱基因，对抗旱植株育种具有重要指导意义。
文档编号C12N15/10GK102732527SQ20111009351
公开日2012年10月17日 申请日期2011年4月14日 优先权日2011年4月14日
发明者夏新莉, 尹伟伦, 庞涛, 郭丽丽 申请人:北京林业大学