一种来源于矮沙冬青的甜菜碱醛脱氢酶基因序列及其克隆方法
【专利摘要】本发明公开了一种来源于矮沙冬青的甜菜碱醛脱氢酶基因序列，该序列具有如SEQIDNO.1所述的核苷酸序列。该序列是一种新的BADH基因序列，使人们对BADH基因的研究对象从微生物及常见植物体进一步扩展到濒危灭绝的荒漠植物。并且，根据该BADH基因在植物体内催化合成的甜菜碱所表现出的优良的抗旱、耐盐等性能可以预料：如果将其通过转基因技术导入玉米等其他植物，将可以培育出具有相应的优良的抗旱、耐盐等性能的植物新品种。本发明还公开了一种上述来源于矮沙冬青的甜菜碱醛脱氢酶基因序列的克隆方法。
【专利说明】一种来源于矮沙冬青的甜菜碱醛脱氢酶基因序列及其克隆方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物基因工程【技术领域】，特别涉及一种来源于矮沙冬青的甜菜碱醛脱氢酶基因序列及其克隆方法。
【背景技术】
[0002]矮沙冬青(Ammopiptanthus nanus Cheng f.)又名新疆沙冬青、小沙冬青、矮黄花木，属于豆科沙冬青属，是第三纪古地中海消失后残遗在塔里木盆地边缘荒漠的超旱生常绿阔叶灌木，间断性分布于西天山与昆仑山的结合部。由于自然历史原因和人类经济活动的影响，特别是过度放牧及樵采，矮沙冬青种群衰退严重，被列为国家一级濒危保护植物，其分布区内气候干旱，降水量远小于蒸发量，年平均气温6.8°C，气温变化极值可达70°C以上。沙冬青具有很强的抗逆性，在相对瘠薄的土壤条件下仍能在高达70°C左右的地表沙温和低至零下20°C~30°C的环境中正常生长发育。有很强的抗寒、抗旱和耐盐碱等抗逆特性。国内外关于沙冬青属植物的报道包括生理生化特性的研究、抗寒、抗旱机理及相关的超微结构；染色体数目及核型、减数分裂期染色体行为、开花物候、和引种栽培试验等。这些研究都证实了沙冬青具有抗旱耐冻的特性，因此它是珍贵的抗旱耐冻遗传资源。
[0003]甜菜碱醛脱氢酶是催化合成甜菜碱的关键酶之一，其催化合成产物(甜菜碱)是植物体内重要的渗透调节物质，对细胞渗透势的调节、生物大分子的稳定具有重要作用。甜菜碱醛脱氢酶基因的表达能显著提高植物耐盐能力；此外，还可以增强植物对干旱胁迫的耐受力。属于优良的抗逆基因资源，在植物抗逆基因工程中广泛利用。
[0004]矮沙冬青作为优秀的抗逆植物，克隆上述抗逆基因对基础和应用研究具有重要意义。
【发明内容】
[0005]本发明的主要目的就是针对荒漠抗逆植物矮沙冬青的抗逆基因开发研究的局限性，提供一种来源于植物矮沙冬青的甜菜碱醛脱氢酶基因序列，以期应用于其它转基因作物中使之具有相应的优良的抗逆性能。
[0006]本发明的另一个目的是提供一种上述基因序列的克隆方法。
[0007]为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下:
一种来源于矮沙冬青的甜菜碱醛脱氢酶基因序列，该序列具有如SEQ ID N0.1所述的核苷酸序列。
[0008]该基因对应的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所述。
[0009]上述核苷酸序列，可通过包括下述步骤的方法，从植物矮沙冬青叶片中提取总RNA、设计引物、进行PCR扩增、测序等克隆得到。
[0010](I)总RNA的提取和纯化:
可采用各种通用的RNA提取方法和纯化方法，从植物矮沙冬青叶片中提取得到纯化的矮沙冬青叶片总RNA。
[0011]常用的RNA提取方法很多，如试剂盒法、热硼酸法、异硫氰酸胍法、苯酚法、十二烷基硫磺酸钠法、十六烷基三甲基溴化铵法、及各种改进方法等，均可用于矮沙冬青叶片总RNA的提取；本发明中可优选试剂盒法(北京天恩泽基因科技有限公司的柱式植物RNA0UT2.0提取试剂盒，CAT#90404-50)，进行矮沙冬青叶片总RNA提取。
[0012]纯化主要是为了去除总RNA中的DNA污染，获得纯化的矮沙冬青叶片总RNA，以满足后续对目的基因的表达进行定量检测等需要。常用的RNA纯化方法包括:DNA酶消化法(简称D法)、酸酚变性法(简称S法)、EDTA法(简称E法)等；本发明中可优选DNA酶(北京天恩泽基因科技有限公司的柱式植物RNAqut2.0提取试剂盒，CAT#90404-50)消化法。
[0013](2)中间片段的克隆:
A、中间片段cDNA第一链的合成
以上述步骤(1)纯化的矮沙冬青叶片总RNA作为模板，使用TaKaRa公司3' -Full RACECore Set Ver.2.0 (Code:D314)试剂盒中 3Λ RACE Adaptor 进行反转录,得到的 cDNA 第一链，作为下述步骤B中PCR扩增的模板。
[0014]B、PCR 扩增
以前述步骤A所得中间片段的cDNA第一链作为模板，利用下述上游引物(jf)和下游引物(jx)，进行PCR扩增:
jf: 5,-CTGTGAATGGCGACACGGAAG -3,，
jx: 5、GATTGTTCCACGCTCGCTCTTAG-3,；
扩增得到矮沙冬青的甜菜碱醛脱 氢酶基因cDNA中间片段，通过克隆测序，得到中间片段序列。
[0015]本步骤中，扩增体系可优选为:
TaqPlusPCR Master Mix20 μ L ,
cDNA 模板2 μ L ,
2Χ 引物(jx/jf)I UL ,
ddH2016 μ L ο
[0016]扩增程序可优选为:
95°C,3min ；
95°C, 30 s，58 °C, 30 s,72°C,40 s (30 个循环);
72°C，8 min ;12°C保温。
[0017](3)3'端的克隆:
C、3Λ-outer PCR 扩增
根据上述步骤(2)得到的中间片段序列，设计并合成特异性上游引物GSP-3'-outer，以前述步骤(2)A所得的cDNA第一链为模板，利用特异性上游引物GSP-3' -outer和TaKaRa公司:T-Full RACE Core Set Ver.2.0 (Code:D314)试剂盒中:T 端下游引物:T-RACEouter,进行 3'端 outer PCR 扩增:
GSP-3'-outer: 5'-ACTGGAAGCTCTGCAACTGGGACCAAGA-3'；
3Λ-RACE outer: 5^- TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT -3^ ；
扩增得到的产物为cDNA 3'端。[0018]本步骤中，扩增体系可优选为:
IXcDNA Dilution Buffer II8 yL ,
cDNA 模板2 μ L ,
2Χ 引物(GSP-3,-outer/3,-RACE-outer)I yL ,
10XLA PCR Buffer II (Mg2+ Free)4 yL ,
MgCl2 (25 mM)3 μ L，
TaKaRa LA Taq (5 U/μ I)0.25 μ L ,
ddH2028.75 μ L。
[0019]扩增程序可优选为:
95。。，3 min ；
95 °C, 30 s ；55°C,30 s ；72°C, I min 30 s (30 个循环)；
72°C，8 min ;12°C保温。
[0020]D、3,-1nner PCR 扩增
根据前述步骤(2)所得中间片段端序列，设计并合成特异性上游引物GSP-3'-1nner，以前述步骤C所得3'端的oute`r PCR产物模板，利用特异性上游引物GSP-3、inner和TaKaRa 公司:T-FulI RACE Core Set Ver.2.0 (Code:D314)试剂盒中:T 端下游引物3Λ -RACE inner,进行 3Λ 端 inner PCR 扩增:
GSP-3、inner: 5^-TCAAGCCTGTTTCACTAGAGCTCGGTGG-3^ ；
3Λ-RACE inner: 5^- CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG -3^ ；
扩增得到的产物为cDNA 端inner PCR产物，通过克隆测序，得到3'端完整序列。
[0021]本步骤中，扩增体系可优选为:
dNTP Mixture (2.5 mM each)8 μ L ,
3r-outer PCR 产物2 μ L，
2X 引物(GSP-3,-1nner/3,-RACE-1nner)I yL ,
10XLA PCR Buffer II (Mg2+ Free)4 yL ,
MgCl2 (25 mM)3 μ L，
TaKaRa LA Taq (5 U/μ I)0.25 μ L ,
ddH2028.75 μ L。
[0022]扩增程序可优选为:
95。。，3 min ；
95 °C, 30 s ；55°C,30 s ；72°C, I min 30 s (30 个循环)
72°C，8 min ;12°C保温。
[0023](4) 5'端的克隆:
E、合成5'端的cDNA第一链:
以上述步骤(1)纯化的矮沙冬青叶片总RNA作为模板,经过Ambion公司FirstChoice?RLM-RACE Kit, SKU #:AM1700 试剂盒对 RNA 处理，加入下述 Y RACE Adapter 后，以 RandomDecamers进行反转录:
5r RACE Adapter:5Λ-GCUGAUGGCGAUGAAUGAACACUGCGUUUGCUGGCUUUGAUGAAA -3^ ；
合成得到反转录产物5'端的cDNA第一链。[0024]F、5r-outer PCR 扩增 根据上述步骤(2)得到的中间片段序列，设计并合成特异性下游引物GSP-5'-outer，以前述步骤E所得反转录产物的cDNA第一链为模板，利用特异性下游引物GSP-5'-outer和FirstChoice? RLM-RACE Kit试剂盒中的5Λ 端上游引物5、RACE outer，进行5Λ 端outerPCR扩增:
GSP-5' -outer: 5'-GCACCAGCTTCAGGACCTAATCCAGTGA-3'；
5Λ-RACE outer: 5^- GCTGATGGCGATGAATGAACACTG -3^ ；
扩增得到的产物为cDNA 5,端。
[0025]本步骤中，扩增体系可优选为:
cDNA 模板IyL,
IOX PCR Buffer5 μ L ,
dNTP Mix4 μ L ,
2X 引物(GSP-5,-outer/V-RACE outer)2 yL ,
ThermostabLe DNA poLymerase (0.25 μ L of 5U/μ L) 1.25 μ L , ddH2034.75 μ L。
[0026]扩增程序可优选为:
95。。，3 min ；
95 °C, 30 s ；60°C,30 s ；72°C, I min 30 s (30 个循环)；
72°C，7 min ;12°C保温。
[0027]G、5,-1nner PCR 扩增
根据前述步骤(2)所得中间片段序列，设计并合成特异性下游引物GSP-5'-1nner，以前述步骤F所得5'端的outer PCR产物模板，利用特异性下游引物GSP-5、inner和FirstChoice? RLM-RACE Kit 试剂盒中 Y 端上游引物 Y-RACE inner，进行 Y 端 inner PCR扩增:
GSP-5inner: 5Λ-CCAGCTCCAAACAGGTCACAGATGCCAA-3Λ ；
5Λ-RACE inner: 5^- CGCGGATCCGAACACTGCGTTTGCTGGCTTTGATG -3^ ；
扩增得到的产物为cDNA 5'端inner PCR产物，通过克隆测序，得到5'端完整序列。
[0028]本步骤中，扩增体系可优选为:
5r-outer PCR 产物I μ L，
10Χ PCR Buffer5 μ L ,
dNTP Mix4 μ L ,
2X 引物(GSP-5,-1nner/V-RACE inner)2 yL ,
ThermostabLe DNA poLymerase (0.25 μ L of 5U/μ L)) 1.25 μ L ,
ddH2034.75 μ L。
[0029]扩增程序可优选为:
95°C，3 min ；
95 °C, 30 s ；60°C,30 s ；72°C, I min 30 s (30 个循环)；
72°C，7 min，12°C保温。
[0030](5)全长序列拼接和ORF克隆:将上述步骤(2)所得中间片段、步骤(3)所得:T端inner PCR扩增序列和述步骤(4)所得5Λ端inner PCR扩增序列进行拼接,cDNA全长作为ORF (Open Reading Frame)扩增的cDNA模板。
[0031]以下述上游引物ORF-S和下游引物0RF-A，并进行PCR扩增:
【权利要求】
1.一种来源于矮沙冬青的甜菜碱醛脱氢酶基因序列，该序列具有如SEQ ID N0.1所述的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的序列，其特征在于:所述的核苷酸序列对应的氨基酸序列如SEQ ID N0.2 所述。
3.—种权利要求1所述的来源于矮沙冬青的甜菜碱醛脱氢酶基因序列的克隆方法，包括下述主要步骤: (1)总RNA的提取和纯化: 可采用各种通用的RNA提取方法和纯化方法，从植物矮沙冬青叶片中提取得到纯化的矮沙冬青叶片总RNA ； (2)中间片段的克隆: A、中间片段cDNA第一链的合成 以上述步骤(1)纯化的矮沙冬青叶片总RNA作为模板，使用TaKaRa公司3' -Full RACECore Set Ver.2.0 (Code:D314)试剂盒中 3Λ RACE Adaptor 进行反转录,得到的 cDNA 第一链，作为下述步骤B中PCR扩增的模板； B、PCR扩增 以前述步骤A所得中间片段的 cDNA第一链作为模板，利用下述上游引物jf和下游引物jx，进行PCR扩增:
jf: 5,-CTGTGAATGGCGACACGGAAG -3,，
jx: 5、GATTGTTCCACGCTCGCTCTTAG-3'； 扩增得到矮沙冬青的甜菜碱醛脱氢酶基因cDNA中间片段，通过克隆测序，得到中间片段序列； (3)3,端的克隆: C、3Λ-outerPCR 扩增 根据上述步骤(2)得到的中间片段序列，设计并合成特异性上游引物GSP-3'-outer，以前述步骤(2)A所得的cDNA第一链为模板，利用特异性上游引物GSP-3' -outer和TaKaRa公司:T-Full RACE Core Set Ver.2.0 (Code:D314)试剂盒中:T 端下游引物:T-RACEouter,进行 3'端 outer PCR 扩增:
GSP-3'-outer: 5'-ACTGGAAGCTCTGCAACTGGGACCAAGA-3'；
3Λ-RACE outer: 5^- TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT -3^ ； 扩增得到的产物为cDNA 端outer PCR产物； D、3Λ-1nnerPCR 扩增 根据前述步骤(2)所得中间片段端序列，设计并合成特异性上游引物GSP-3'-1nner，以前述步骤C所得3'端的outer PCR产物模板，利用特异性上游引物GSP-3、inner和TaKaRa 公司:T-FulI RACE Core Set Ver.2.0 (Code:D314)试剂盒中:T 端下游引物3Λ -RACE inner,进行 3Λ 端 inner PCR 扩增:
GSP-3inner: 5^-TCAAGCCTGTTTCACTAGAGCTCGGTGG-3Λ ；
3Λ-RACE inner: 5^- CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG -3^ ； 扩增得到的产物为cDNA 3'端inner PCR产物，通过克隆测序，得到3'端完整序列； (4)5'端的克隆:E、合成5'端的cDNA第一链: 以上述步骤(1)纯化的矮沙冬青叶片总RNA作为模板,经过Ambion公司FirstChoice?RLM-RACE Kit, SKU #:AM1700 试剂盒对 RNA 处理，加入下述 Y RACE Adapter 后，以 RandomDecamers进行反转录: . 5r RACE Adapter:5'-GCUGAUGGCGAUGAAUGAACACUGCGUUUGCUGGCUUUGAUGAAA -3'；
合成得到反转录产物5'端的cDNA第一链； F、5'-outerPCR 扩增 根据上述步骤(2)得到的中间片段序列，设计并合成特异性下游引物GSP-5'-outer，以前述步骤E所得反转录产物的cDNA第一链为模板，利用特异性下游引物GSP-5'-outer和FirstChoice? RLM-RACE Kit试剂盒中的5' 端上游引物5'-RACE outer，进行5' 端outerPCR扩增:
GSP-5'-outer: 5'-GCACCAGCTTCAGGACCTAATCCAGTGA-3'； . 5'-RACE outer: 5'- GCTGATGGCGATGAATGAACACTG -3' ； 扩增得到的产物为cDNA 端outer PCR产物； G、5'-1nnerPCR 扩增 根据前述步骤(2)所得中间片段序列，设计并合成特异性下游引物GSP-5'-1nner，以前述步骤F所得5'端的outer PCR产物模板，利用特异性下游引物GSP-5、inner和FirstChoice? RLM-RACE Kit 试剂盒中 Y 端上游引物 Y-RACE inner，进行 Y 端 inner PCR扩增:
GSP-5inner: 5'-CCAGCTCCAAACAGGTCACAGATGCCAA-3' ； . 5'RACE inner: 5^- CGCGGATCCGAACACTGCGTTTGCTGGCTTTGATG -3' ； 扩增得到的产物为cDNA 5'端inner PCR产物，通过克隆测序，得到5'端完整序列； (5)全长序列拼接和ORF克隆: 将上述步骤(2)所得中间片段、步骤(3)所得:T端inner PCR扩增序列和述步骤(4)所得5'端inner PCR扩增序列进行拼接,cDNA全长作为ORF (Open Reading Frame)扩增的cDNA模板； 以下述上游引物ORF-S和下游引物ORF-A，并进行PCR扩增:
ORF-S: 5' -GTGGATCC (BamH I ) ATGGCAACCCCAATACCGAATORF-A: 5'-CATCAAGCTT (Hind III)CCTATCACAGCTTTGAAGGAGACTG扩增得到的产物为完整的矮沙冬青甜菜碱醛脱氢酶基因，通过克隆测序，即得其基因序列。
4.根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于:所述的步骤(1)中，采用的RNA提取方法为试剂盒法；纯化方法为DNA酶消化法。
5.根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于:所述的步骤(2)中进行PCR扩增时，扩增体系为: TaqPlusPCR Master Mix20 μ L , cDNA 模板
2 μ L , .2X 引物(jx/jf)
I UL , ddH20
16 yL ；扩增程序为:
95°C,3min ；
95°C, 30 s，58 °C, 30 s,72°C,40 s (30 个循环); 72°C，8 min ;12°C保温。
6.根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于:所述的步骤(3)中进行IT-outerPCR扩增时，扩增体系为: IXcDNA Dilution Buffer II8 yL ,cDNA 模板2 μ L , 2Χ 引物(GSP-3,-outer/3,-RACE-outer)I yL , IOXLA PCR Buffer II (Mg2+ Free)4 yL , MgCl2 (25 mM)3 μ L， TaKaRa LA Taq (5 U/μ I)0.25 μ L , ddH2028.75 μ L ; 扩增程序为:
95。。，3 min ；
95°C, 30 s ；55°C,30 s ；72°C, I min 30 s (30 个循环)； 72°C，8 min ;12°C保温。
7.根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于:所述的步骤(3)中进行:T-1nnerPCR扩增时，扩增体系为: dNTP Mixture (2.5 mM each)8 μ L , 3r-outer PCR 产物2 μ L， 2X 引物(GSP-3,-1nner/3,-RACE-1nner)I yL , 10XLA PCR Buffer II (Mg2+ Free)4 yL , MgCl2 (25 mM)3 μ L， TaKaRa LA Taq (5 U/μ I)0.25 yL , ddH2028.75 μ L ; 扩增程序为:
95。。，3 min ；
95°C, 30 s ；55°C,30 s ；72°C, I min 30 s (30 个循环) 72°C，8 min ;12°C保温。
8.根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于:所述的步骤(4)中进行5,-outerPCR扩增时，扩增体系为:cDNA 模板IyL, IOX PCR Buffer5 μ L , dNTP Mix4 μ L , 2X 引物(GSP-5,-outer/V-RACE outer)2 yL , ThermostabLe DNA poLymerase (0.25 μ L of 5U/μ L) 1.25 μ L , ddH2034.75 μ L ; 扩增程序为:.95。。，3 min ； . 95°C, 30 s ；60°C,30 s ；72°C, I min 30 s (30 个循环)；. 72°C，7 min ;12°C保温。
9.根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于:所述的步骤(4)中进行5,-1nnerPCR扩增时，扩增体系为:. 5r-outer PCR 产物I μ L， IOX PCR Buffer5 μ L , dNTP Mix4 μ L , . 2X 引物(GSP-5,-1nner/V-RACE inner)2 yL , ThermostabLe DNA poLymerase (0.25 μ L of 5U/μ L)) 1.25 μ L , ddH2034.75 μ L ; 扩增程序为: . 95。。，3 min ； . 95°C, 30 s ；60°C,30 s ；72°C, I min 30 s (30 个循环)； . 72。。，7 min，12°C保温。
10.根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于:所述的步骤(5)中进行PCR扩增时，扩增体系为: dNTP Mixture (2.5 mM each)4 μ L , .2 X 引物(0RF-S/0RF-A)I μ L， cDNA 模板I μ L , . 5XPrimeSTAR Buffer (Mg2+ plus)10 μ L , PrimeSTAR HS DNA PLoymerase (2.5 U/μ L)0.5 μ L， ddH2032.5 μ L ;
扩增程序为:98°C,30 s ；63°C,30 s ；72°C,1 min 30 s (30 个循环)，12°C保温。
【文档编号】C12N9/04GK103497957SQ201310505243
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年10月24日 优先权日:2013年10月24日
【发明者】李晚忱, 于好强, 付凤玲, 刘艳萍, 雍太明 申请人:四川农业大学