专利名称：一种来源于新疆沙冬青的钼辅助因子硫酸化酶的基因序列及其克隆方法
技术领域：
本发明涉及一种来源于新疆沙冬青的钥辅助因子硫酸化酶的基因及其对应编码的氨基酸，此外本发明也涉及到该基因的克隆方法。
背景技术：
新疆沙冬青新疆沙冬青(Ammopiptanthus nanus Cheng f.)又名矮沙冬青、小沙冬青、矮黄花木，属于豆科(Leguminosae)、黄华族(Thermopsideae)、沙冬青属(Ammopiptanthus Cheng f.),为第三纪孔遗植物,被列为国家一级保护植物。主要分布在海拔1800 2800m的干旱荒山和石质戈壁类型的内蒙古西部和宁夏、甘肃、新疆的部分沙漠、荒漠地带，是该区唯一的常绿阔叶灌木，分布区内气候干旱，降水量远小于蒸发量，年平均气温6. 8°C，气温变化极值可达70°C以上。沙冬青具有很强的抗逆性，在相对瘠薄的土壤条件下仍能在高达70°C左右的地表沙温和低至零下20°C 30°C的环境中正常生长发育。有很强的抗寒、抗旱和耐盐碱等抗逆特性。国内外关于沙冬青属植物的报道包括生理生化特性的研究、抗寒、抗旱机理及相关的超微结构；染色体数目及核型、减数分裂期染色体行为、开花物候、和引种栽培试验等。这些研究都证实了沙冬青抗旱耐冻的特性，因此它是珍贵的抗旱耐冻遗传资源。钥辅助因子硫酸化酶是脱落酸生物合成过程中的关建酶。被硫酸化后的钥辅助因子是植物脱落酸生物合成途径中参与最后一步反应的脱落酸醛氧化酶所必需的辅助因子，因此能够调节脱落酸介导的植物寒冷和渗透逆境反应的相关基因表达。新疆沙冬青作为优秀的抗逆植物，克隆以上抗逆基因对基础和应用研究具有重要意义。
发明内容
本发明的主要目的就是针对荒漠抗逆植物新疆沙冬青的抗逆基因开发研究的局限性，提供一种来源于植物新疆沙冬青的钥辅助因子硫酸化酶的基因序列，以期应用于其它转基因作物中使之具有相应的优良抗逆性能。本发明的另一个目的是提供一种上述基因序列的克隆方法。为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下一种来源于新疆沙冬青的钥辅助因子硫酸化酶的基因序列，该序列具有如SEQ IDNO. I所述的核苷酸序列以及该基因对应的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所述。上述核苷酸序列，可通过包括下述步骤的方法，从植物新疆沙冬青叶片中提取总RNA、设计引物、进行PCR扩增、测序等克隆得到(I)总RNA的提取和纯化可采用各种通用的RNA提取方法和纯化方法，从植物新疆沙冬青叶片中提取得到纯化的新疆沙冬青叶片总RNA;常用的RNA提取方法很多，如试剂盒法、热硼酸法、异硫氰酸胍法、苯酚法、十二烷基硫磺酸钠法、十六烷基三甲基溴化铵法、及各种改进方法等，均可用于新疆沙冬青叶片总RNA的提取；本发明中可优选试剂盒法(北京天恩泽基因科技有限公司的柱式植物RNA.2. O提取试剂盒，CAT#90404-50)，进行新疆沙冬青叶片总RNA提取。纯化主要是为了去除总RNA中的DNA污染，获得纯化的新疆沙冬青叶片总RNA，以满足后续对目的基因的表达进行定量检测等需要。常用的RNA纯化方法包括DNA酶消化法(简称D法)、酸酚变性法(简称S法)、EDTA法(简称E法)等；本发明中可优选DNA酶(北京天恩泽基因科技有限公司的柱式植物RNAqut2. O提取试剂盒，CAT#90404-50)消化法。(2)中间片段的克隆A、中间片段cDNA第一链的合成
以上述步骤(I)纯化的新疆沙冬青叶片总RNA作为模板，使用TaKaRa公司3' -Full RACE Core Set Ver. 2. 0 (Code D314)试剂盒中 3' RACE Adaptor 进行反转录，得到的cDNA第一链，作为下述步骤B中PCR扩增的模板；B、PCR 扩增以前述步骤A所得中间片段的cDNA第一链作为模板，利用下述兼并上游引物(jfl)和兼并下游引物(jxl)，进行PCR扩增。钥辅助因子硫酸化酶基因中间片段扩增兼并引物jfl 5/ -GTCGGAGAGRCKTTTCCRTGG-3'，jxl 5/ -TGCACAWGCDCCWGGATTR-3'；扩增得到新疆沙冬青的钥辅助因子硫酸化酶基因cDNA中间片段，通过克隆测序，得到中间片段序列。本步骤中，扩增体系可优选为TaqPlusPCR Master Mix 20 μ L,cDNA 模板2 μ L，2X 引物(jxl/jfl)luL,ddH2016 μ L。扩增程序可优选为95 °C, 3min ；95°C，30s，60°C，30s，72°C，50s(35 个循环)；72°C，8min ;4°C 保温。(3)3'端的克隆C、3' -outer PCR 扩增根据上述步骤(2)得到的中间片段序列，设计并合成特异性上游引物GSP1-3' -outer,以前述步骤(2)A所得的cDNA第一链为模板，利用特异性上游引物GSP1-3' -outer 和 TaKaRa 公司 3' -Full RACE Core Set Ver. 2· 0 (Code :D314)试剂盒中3'端下游引物3' -RACE outer,进行3'端outer PCR扩增:钥辅助因子硫酸化酶基因3'端的特异性上游outer引物GSPl-3/ -outer 5/ -GCATGGCGATGGATCTAGCATGTGCAT-3'；3'端下游引物 3' -RACE outer
3' -RACE outer 5/ -TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3'；扩增得到的产物为cDNA 3'端；本步骤中，扩增体系可优选为IXcDNA Dilution Buffer II8 μ L,cDNA 模板2yL，2X 引物(GSP1-3, -outer/3' -RACE-outer)I μ L, 10XLA PCR Buffer II(Mg2+Free)4μ L,MgCl2 (25mM)3 μ L,TaKaRa LA Taq(5U/μ I)0. 25 μ L,ddH2028. 75 μ L0扩增程序可优选为95 °C, 3min ；95°C，30s ；55°C, 30s ；72°C，Imin 30s (35 个循环)72°C, 8min ；4°C 保温。D、3' -inner PCR 扩增根据前述步骤⑵所得中间片段端序列，设计并合成特异性上游引物GSPl-Si-inner，以前述步骤C所得:V端的outer PCR产物模板，利用特异性上游引物GSP1-3'-inner 和 TaKaRa 公司 3' -Full RACE Core Set Ver. 2· 0 (Code :D314)试剂盒中3'端下游引物3' -RACE inner,进行3'端inner PCR扩增钥辅助因子硫酸化酶基因3'端的特异性上游inner引物GSP1-3' -inner 5/ -GGCTCTTGGTATGGATACCGTGAAGTGG-3'；3'端下游引物 3' -RACE inner 3' -RACE inner 5/ -CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3'；扩增得到的产物为cDNA 3'端inner PCR产物，通过克隆测序，得到3'端完整序列；本步骤中，扩增体系可优选为dNTP Mixture (2. 5mM each)8 μ L,31 -outer PCR 产物2 μ L,2X 引物(GSP1-3, -inner/3' RACE-inner)I μ L,10XLA PCR Buffer II(Mg2+Free)4μ L,MgCl2 (25mM)3 μ L,TaKaRa LA Taq(5U/μ I)0. 25 μ L,ddH2028. 75 μ L0扩增程序可优选为95 °C, 3min ；95°C，30s ；55°C, 30s ；72°C，Imin 30s (35 个循环)72°C,8min ;4°C保温。(4)5'端的克隆E、合成5'端的cDNA第一链
以上述步骤(I)纯化的新疆沙冬青叶片总RNA作为模板，经过Ambion公司FirstChoice RLM-RACE Kit，SKU# :AM1700 试剂盒对 RNA 处理，加入下述 5' RACE Adapter后，以Random Decamers进行反转录5 ' RACE Adapter 5 ' -GCUGAUGGCGAUGAAUGAACACUGCGUUUGCUGGCUUUGAUGAAk-3'；合成得到反转录产物5'端的cDNA第一链；F、5' -outer PCR 扩增根据上述步骤(2)得到的中间片段序列，设计并合成特异性下游引物GSP1-5' -outer,以前述步骤E所得反转录产物的cDNA第一链为模板，利用特异性下游引物 GSP1-5' -outer 和FirstChoice RLM-RACE Kit 试剂盒中的 5'端上游引物 5' -RACEouter,进行 5'端 outer PCR 扩增 钥辅助因子硫酸化酶基因5'端的特异性下游outer引物GSPl-5/ -outer 5/ -TTCACCAAGTCAAGGCCAAATCTC-3'；5'端上游引物 5' -RACE outer 5' -RACE outer 5/ -GCTGATGGCGATGAATGAACACTG-3'；扩增得到的产物为cDNA 5'端；本步骤中，扩增体系可优选为
cDNA 模板I μΙ_
10Χ PCR Buffer5 μ
dNTP Mix4 μ
2χ引物(GSPl-5'-outer/5'-RACE outer)2 μι
ThermostabLe DNA poLymeraset (0.25 μΙ_ of 5υ/μ ) 1.25 μ
ddH2034.75 μ 。扩增程序可优选为95 °C, 3min ；95°C，30s ；60°C，30s ；72°C，lmin/kbp (35 个循环)；72°C，8min ;12°C保温。G、5' -inner PCR 扩增根据前述步骤(2)所得中间片段序列，设计并合成特异性下游引物GSPl-Si-inner，以前述步骤F所得Y端的outer PCR产物模板，利用特异性下游引物GSP1-5'-inner 和FirstChoice RLM-RACE Kit 试剂盒中 5'端上游引物 5' -RACE inner,进行5 ’端inner PCR扩增钥辅助因子硫酸化酶基因5'端的特异性下游inner引物GSP1-5' -inner 5/ -CATCACCTGTTGGCTCTCCCTC-3'；5'端上游引物 5' -RACE inner 5' -RACE inner 5/ -CGCGGATCCGAACACTGCGTTTGCTGGCTTTGATG-3'；
扩增得到的产物为cDNA 5/端inner PCR产物，通过克隆测序，得到5'端完整序 列；本步骤中，扩增体系可优选为
5'-outerPCR 产物1叫
10X PCR Buffer5 叫
dNTP Mix4 \xl
2x引物(GSPl-S'-inner/S'-RACE inner)2 \xl
ThermostabLe DNA poLymerase+ (0.25 nL of 5U/[iL)1.25 pL
ddH2034.75 nL。扩增程序可优选为95 °C, 3min ；95。。，30s ；60°C，30s ；72°C，lmin/kbp (35 个循环)；72°C，8min，12°C 保温。(5)全长序列拼接和基因分析将上述步骤⑵所得中间片段、步骤(3)所得3'端inner PCR扩增序列和述步骤 (4)所得5'端inner PCR扩增序列用DNAman软件进行完整序列的拼接，然后通过NCBI里 ORFfinder工具分析开放阅读框，即完整的基因序列。(6)钥辅助因子硫酸化酶基因的克隆将上述步骤(5)所分析的完整基因序列作为模板，设计上游引物0RF1-S和下游引 物0RF1-A，并进行PCR扩增钥辅助因子硫酸化酶基因扩增引物0RF1-S 5' -ATGGACGACGCCAAAAAAGAG-3'，0RF1-A 5' -TTAAATTGCACAATAGCATGAACTT-3'；扩增得到的产物为完整的新疆沙冬青的钥辅助因子硫酸化酶基因，通过克隆测 序，即得其基因序列。本步骤中，扩增体系可优选为dNTP Mixture (2. 5mM each)4 u L,2X 引物(0RF1-S/0RF1-A)1 u L,cDNA 模板luL，5XPrimeSTAR Buffer (Mg2+plus)10 u L,PrimeSTAR HS DNA PLoymerase (2. 5U/ u L)0. 5 u L,ddH2032. 5 u L0钥辅助因子硫酸化酶基因扩增程序可优选为98°C,30s ；61°C,30s ；72°C,2min 30s (35 个循环)；与现有技术相比，本发明的有益效果是本发明是一种来源于植物新疆沙冬青的钥辅助因子硫酸化酶的基因序列是新的基因序列，使人们对这些基因的研究对象从细菌及其他植物体进一步扩展到新疆沙冬青。并且，根据在新疆沙冬青植物的这些基因所具备的优良的抗旱、耐盐等性能可以预料如果将其通过转基因技术导入玉米等其他植物的基因中，将可培育出具有相应的优良的抗旱、耐盐等性能的植物新品种。
图I为AnMCSU基因电泳检测结果图，图2为AnMCSU基因中间片段电泳检测结果图，
图3为AnMCSU基因:V端inner PCR电泳检测结果图，图4为AnMCSU基因Y端inner PCR电泳检测结果图。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明的上述发明内容作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。在下述各实施例中，将新疆沙冬青的钥辅助因子硫酸化酶基因简称为AnMCSU。通过各实施例，最终得到来源于新疆沙冬青的钥辅助因子硫酸化酶基因核苷酸序列(如SEQID NO. I所述)及其对应的氨基酸序列(如SEQ ID NO. 2所述)。实施例I本实施例为新疆沙冬青叶片总RNA的提取和纯化，总RNA提取使用北京天恩泽基因科技有限公司的柱式植物RNAOUIVci提取试剂盒，CAT#90404-50，包括下述步骤(I)估算组织细胞的用量。每次微量提取一般需要100-200mg植物叶片或50-100mg植物种子或200-500mg植物果实。 (2)先将新鲜植物组织剪切成小块(保存在RNAL0CKER中的植物组织需用纸吸去RNAL0CKER液体后再剪切成小块)，放入10_15mL塑料离心管中，加入ImL 65°C预热的溶液A(用前需要摇晃混匀)，然后用匀浆器匀浆5-20秒。匀浆时会产生泡沫，但不影响提取效果。也可以使用液氮砚磨法破碎植物组织，砚磨完后加入ImL溶液A,但效果比较差，因为研钵本质是二氧化硅，在溶液A存在时会吸附RNA。(3)将匀浆物或砚磨物转移至干净的I. 5mL塑料离心管中(可以不必转移非液体的细胞碎片)。有的植物组织(比如果实)含有大量水份，匀浆液会多于lmL，转移时也只取 ImL。(4)在离心管中加入O. 3mL的溶液B和O. 2mL自备氯仿，在振荡器上振荡30秒混匀，此时溶液呈均匀的乳浊状。振荡器振荡时必须使管底溶液震荡起来。(5)室温12000rpm离心3-5分钟，两相间有约5mm厚的细胞破碎物。(6)将上清液(约0.6mL)转移到另一干净的I. 5mL塑料离心管中，下层有机相和中间层含有DNA、蛋白质和其他杂质，避免触及或吸取。最好留下IOOuL上清液不取。(7)加入等体积的溶液C，充分颠倒混匀。(8)将一半溶液转移到离心吸附柱(60911B)中，12000rpm室温离心半分钟，弃穿透液。注意不要跟用于RNA提取的吸附柱(60911D)混用。(9)将剩下的一半溶液转移到同一离心吸附柱中，12000rpm室温离心半分钟，弃
穿透液。(10)将O. 7mL通用洗柱液加入到离心吸附柱中，12000rpm室温离心10-30秒，弃
穿透液。(11) 12000rpm室温离心10秒以便去除残留液体。 (12)将 IOuL(IOU)的 RNase-free DNase 加入到 50uL37°C预热的DNA膜反应液中，吹打混匀配制成DNase工作液。(13)将DNase工作液在37°C预热I分钟，然后全部加入到离心吸附柱中，室温放置5分钟。注意5分钟一般足够降解大多数情况下的DNA污染。如果DNA没有彻底降解(可能由于样品中残留的杂质抑制了 DNase的活性)，此步的保温时间可以适当延长到10分钟或15分钟。(14)直接在离心吸附柱中加入O. 7mL通用洗柱液，盖上盖后颠倒数次混匀。(15) 12000rpm室温离心半分钟,弃穿透液。(16)再加O. 3mL通用洗柱液到离心吸附柱，12000rpm室温离心半分钟,弃穿透液。(17) 12000rpm室温离心半分钟。此步十分重要，否则残留乙醇会影响RNA的使用。(18)将离心吸附柱转移到RNase-free收集管中，加入30_50uL RNA洗脱液，室温放置1-2分钟。(19) 12000rpm室温离心半分钟，离心管中溶液即为RNA样品。本产品提供的离心吸附柱吸附力较强，一次洗脱不能全部将膜上RNA洗下，如有必要，可以再加入30-50uLRNA洗脱液一次。实施例2本实施例为新疆沙冬青总RNA的反转录，其反转录得到的cDNA第一链用于基因中间片段和3'端扩增的模板，按照Takara公司的3' -Full RACE Core Set Ver. 2. 0, Code D314试剂盒说明书进行cDNA第一链合成。实施例3本实施例为AnMCSU基因中间片段的克隆，方法如下以拟南芥ABA3/L0S5(NM_101519. 2)为询问序列，参考豆科植物中与其序列其保守性较高的大豆(XM_003534387. I)序列设计一对兼并引物jfl/jxl jfl 5/ -GTCGGAGAGRCKTTTCCRTGG-3'；jxl 5/ -TGCACAWGCDCCWGGATTR-3'。以实施例2的cDNA第一链为模板，以设计的兼并引物jfl和jxl进行AnMCSU基因cDNA中间片段的扩增。
TaqPIusPCR Master Mix20 μ
cDNA 模板2 μ 扩增体系为
2χ引物(jxl/jfl)1μ1_
ddH2016 μ!_扩增程序为95°C，3min；
95°C，30s，60°C，30s，72°C，50s(35 个循环)；72°C，8min ;4°C 保温。取所得扩增产物20 μ L经I %非变性琼脂糖凝胶100V电泳30min，GoLdenView染色后紫外线检测扩增片段，结果如图2所示。扩增得到的产物为AnMCSU基因cDNA中间片段，通过包括下述步骤的方法克隆测序，得到的中间片段序列如SEQ ID NO. 3所述:①目的片段的回收与纯化将扩增出来的特异条带用干净刀片在紫外光下快而准确的从琼脂糖中挖出，置于
I.5mL离心管中，用凝胶回收试剂盒(OMEGA公司的E. Z. N. A. TM GeL Extraction Kit)回收胶中的DNA片段；②连接反应将回收的DNA片段克隆于TaKaRa公司的pMD19_T载体中。连接反应采用连接试剂盒(Takara公司)，扩增体系总体积10 μ L，16°C连接过夜；③感受态细胞的制备I、从LB平板上挑取新活化的E. coLi DH5 α单菌落，接种于3_5mL LB液体培养基中，37°C，225r/min振荡培养12h左右，直至对数生长后期。将该菌悬液以I : 100-1 50的比例接种于IOOmL LB液体培养基中，37°C振荡培养2_3h至0D600 = O. 35-0. 5左右；II、将培养液转入离心管，冰上放置lOmin，然后于4°C下3000r/min离心IOmin ；III、弃去上清，用预冷的O. 05moL/L的CaCL2溶液IOmL轻轻悬浮细胞，冰上放置15_30min 后，4°C下 3000r/min 离心 IOmin ；IV、弃去上清，加入4mL预冷含15%甘油的0.051110171的0&(^2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液；V、感受态细胞分装成100μ L的小份，贮存于-70°C可保存半年；④质粒DNA的转化I、从-80°C冰箱中取出一管大肠杆菌感受态细胞DH5ci，置于冰上融化；II、在无菌条件下加入10 μ L连接反应液，轻轻震摇混匀后，在冰上放置30min ；III、42°C水浴热击90s，不要摇动，之后迅速放入冰浴冷却2_3min ；IV、加入890 μ L无Amp的LB液体培养基，混匀后，37°C、150r/min摇床振摇培养，温育Ih ；V、取100 μ L已转化的菌液涂于一个LB/Amp的培养平板上，正面朝上放置30min，待菌液完全被培养基吸收后，用封口膜封住，然后倒转培养皿，37°C避光培养12-16h ;随后筛选阳性菌落；⑤重组菌落的鉴定与保存从外观上看，一般白色且圆的菌落为阳性，通过菌液PCR进一步鉴定I、在过夜培养的平板上用灭菌的小枪头挑取几个白色菌落，分别点种于含0. Ig/LAmp的LB液体培养基的I. 5mL离心管中，37°C，150r/min振摇培养4_6h ；II、取I μ L菌悬液作为模板，用引物jfl/jxl进行PCR扩增，PCR反应条件中裂解时间延长至5min，用I %的非变性琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。如果产物为目的条带时，此菌落为阳性克隆，否则为阴性。同时设不加菌悬液的阴性对照；
III、取已经鉴定的阳性克隆的菌落悬浮液750 μ L，加入250 μ L的灭菌甘油，混匀后，用液氮速冻，置于-80°C冰箱中保存备用；IV、最后送英俊生物技术公司测序，所得序列在NCBI的BLastn进行比对分析，验证克隆片段是否正确。实施例4本实施例为AnMCSU基因:V端的克隆，方法如下(1)3/ -outer PCR 扩增根据实施例3得到的中间片段序列，设计并合成特异性上游引物GSP1-3'-outer,以实施例2所得反转录产物的cDNA第一链为模板，利用特异性上游引物GSP1-3'-outer 和 TaKaRa 公司 3' -Full RACE Core Set Ver. 2· 0 (Code :D314)试剂盒中3'端下游引物3' -RACE outer,进行3'端outer PCR扩增:GSPl-3/ -outer 5/ -GCATGGCGATGGATCTAGCATGTGCAT-3'；3' -RACE outer 5/ -TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3'；扩增体系为IXcDNA Dilution Buffer II8 μ L,cDNA 模板2yL，2X 引物(GSP1-3, -outer/3' -RACE-outer)I μ L,
10XLA PCR Buffer II(Mg2+Free)4μ L,MgCl2 (25mM)3 μ L,TaKaRa LA Taq (5U/ μ L)0. 25 μ L,ddH2028. 75 μ L0扩增程序为95 °C, 3min ；95°C, 30s ；55°C, 30s ；72°C, Imin 30s (35 个循环)72°C,8min 4°C保温。(2) 3' -inner PCR 扩增根据实施例3得到的中间片段序列，设计并合成特异性上游引物GSP1-3 '-inner,以上述⑴所得outer PCR产物为模板，利用特异性上游引物GSP1-3'-inner 和 TaKaRa 公司 3' -Full RACECore Set Ver. 2· O (Code :D314)试剂盒中3'端下游引物3' -RACE inner,进行3'端inner PCR扩增GSP1-3' -inner 5/ -CATCACCTGTTGGCTCTCCCTC-3'；3' -RACE inner 5/ -CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3 ；扩增体系为dNTP Mixture (2. 5mM each)8 μ L,cDNA 模板2 μ L，2X 引物(GSP1-3, -inner/3' -RACE-inner)I μ L,10XLA PCR Buffer II(Mg2+Free)4μ L,MgCl2 (25mM)3 μ L,TaKaRa LA Taq (5U/ μ I)0. 25 μ L,
ddH2028. 75 μ L0扩增程序为95 °C, 3min ；95°C, 30s ；60°C, 30s ；72°C, Imin 30s (35 个循环)；72°C，8min ;4°C 保温。取所得扩增产物经I %琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示。扩增得到的产物为AnMCSU基因3'端cDNA完整序列inner PCR产物，通过克隆测序(同实施例3)，得到的3'端cDNA完整序列如SEQ ID NO. 4所述。 实施例5本实施例为5^端扩增的cDNA第一链合成以实施例I纯化的新疆沙冬青叶片总RNA作为模板，经过Ambion公司FirstChoiceeRLM-RACE Kit, SKU# AM1700 试剂盒对 RNA 处理，加入下述 5' RACE Adapter 后，以 RandomDecamers进行反转录5 ' RACE Adapter 5 ' -GCUGAUGGCGAUGAAUGAACACUGCGUUUGCUGGCUUUGAUGAAk-3'；合成得到反转录产物5'端的cDNA第一链；实施例6本实施例为AnMCSU基因Y端的克隆，包括下述步骤(I) 5' -outer PCR 扩增根据实施例3得到的中间片段序列，设计并合成特异性下游引物GSP1-5' -outer,以实施例5所得反转录产物的cDNA第一链为模板，利用特异性下游引物GSP1-5' -outer 和试剂盒FirstChoice RLM-RACE Kit, SKU# AM1700 中上游引物 5' -RACEouter,进行 5'端 outer PCR 扩增GSPl-5/ -outer 5/ -TTCACCAAGTCAAGGCCAAATCTC-3'；5' -RACE outer 5/ -GCTGATGGCGATGAATGAACACTG-3'；扩增体系为
cDNA 模板I μ
10Χ PCR Buffer5 μ
dNTP Mix4 μ
2χ引物(GSPl-5、outer/5,-RACE outer)2 μ
ThermostabLe DNA poLymeraset (0.25 μ of 5υ/μ ) 1.25 μ
ddH2034.75 μ 。扩增程序为95 °C, 3min ；95°C，30s ；60°C，30s ；72°C，2min 30s (35 个循环)；72°C，8min ;12°C保温。
(2) 5' -inner PCR 扩增根据实施例3得到的中间片段序列，设计并合成特异性下游引物GSP1-5丨-inner,以上述⑴所得outer PCR产物为模板，利用特异性下游引物GSP1-5' -inner 和试剂盒FirstChoice RLM-RACE Kit, SKU# AM1700 中上游引物 5' -RACEinner,进行 5'端 inner PCR 扩增GSP1-5' -inner 5/ -CATCACCTGTTGGCTCTCCCTC-3'；5' -RACE inner 5/ -CGCGGATCCGAACACTGCGTTTGCTGGCTTTGATG-3 ；扩增体系为
5'-outerPCR 产物I μ1_
IOX PCR Buffer5 μ
dNTP Mix4 μ
2x引物(GSPl-5'-inner/5'-RACE inner)2 μ
ThermostabLe DNA poLymeraset (0.25 μ of 51Ι/μ ) 1.25 μΙ_
ddH2034.75 μι。扩增程序为95°C，3min;95°C，30s ；60°C，30s ；72°C，2min 30s (35 个循环)；72°C，8min ;12°C 保温。取所得扩增产物经I %琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示。扩增得到的产物为AnMCSU基因5丨端cDNA完整序列inner PCR产物，通过克隆测序(同实施例3)，得到的5'端cDNA完整序列如SEQ ID NO. 5所述。实施例7本实施例为AnMCSU基因全长序列拼接和基因分析，包括下述步骤将上述实施例3所得中间片段、实施例4所得3'端inner PCR扩增序列和实施例6所得5'端inner PCR扩增序列用DNAman软件进行完整序列的拼接，然后通过NCBI里ORF finder工具分析开放阅读框，即完整的基因序列。 实施例8本实施例为AnMCSU基因克隆，方法如下以实施例7的基因分析设计上游引物ORFl-S和下游引物0RF1-A，以实施例5所得反转录产物的cDNA第一链为模板进行PCR扩增ORFl-S 5/ -ATGGACGACGCCAAAAAAGAG-3'，ORFl-A 5/ -TTAAATTGCACAATAGCATGAACTT-3'；扩增体系为dNTP Mixture (2. 5mM each)4 μ L,2Χ 引物(0RF1-S/0RF1-A)I μ L，cDNA 模板lyL，
5 X PrimeSTAR Buffer (Mg2+plus)10 μ L,PrimeSTAR HS DNA PLoymerase (2. 5U/ μ L) 0. 5 μ L,ddH2032. 5 μ L0
扩增程序为98°C,30s ；61°C,30s ；72°C,2min 30s (35 个循环)；取所得扩增产物经I %琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图I所示。扩增得到的产物为完整的AnMCSU基因序列，如SEQ ID NO. I所述；其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所述。
权利要求
1.一种来源于新疆沙冬青的钥辅助因子硫酸化酶的基因序列，该基因具有如SEQ IDNO. I所述的核苷酸序列。
2.根据权利要求I所述的序列，其特征在于该基因所述的核苷酸序列对应的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所述。
3.依照权利要求I所述的一种来源于新疆沙冬青的钥辅助因子硫酸化酶基因序列的克隆方法，包括下述主要步骤 (1)总RNA的提取和纯化 采用各种通用的RNA提取方法和纯化方法，从植物新疆沙冬青叶片中提取得到纯化的新疆沙冬青叶片总RNA ； (2)中间片段的克隆 A、中间片段cDNA第一链的合成 以上述步骤(I)纯化的新疆沙冬青叶片总RNA作为模板，使用TaKaRa公司3' -FullRACE Core Set Ver. 2· 0 (Code :D314)试剂盒中 3' RACE Adaptor 进行反转录，得到的 cDNA第一链，作为下述步骤B中PCR扩增的模板； B、PCR扩增 以前述步骤A所得中间片段的cDNA第一链作为模板，利用下述上游引物(jfl)和下游引物(jxl)，进行PCR扩增。
钥辅助因子硫酸化酶基因中间片段扩增引物 jfl 5/ -GTCGGAGAG RCKTTTCCRTGG-3'， jxl 5/ -TGCACAWGCDCCWGGATTR-3'； 扩增得到新疆沙冬青的钥辅助因子硫酸化酶基因cDNA中间片段，通过克隆测序，得到中间片段序列。
(3)3'端的克隆 C、3'-outer PCR 扩增 根据上述步骤⑵得到的中间片段序列，设计并合成特异性上游引物GSP1-3' -outer，以前述步骤(2) A所得的cDNA第一链为模板，利用特异性上游引物GSP1-3' -outer 和 TaKaRa 公司 3' -Full RACE Core Set Ver. 2· 0 (Code :D314)试剂盒中3'端下游引物3' -RACE outer,进行3'端outer PCR扩增: 钥辅助因子硫酸化酶基因3'端的特异性上游outer引物GSP1-3' -outer 5/ -GCATGGCGATGGATCTAGCATGTGCAT-3'； 3'端下游引物3' -RACE outer 3' -RACE outer 5/ -TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3'； 扩增得到的产物为cDNA 3'端； D、3'-inner PCR 扩增 根据前述步骤⑵所得中间片段端序列，设计并合成特异性上游引物GSPl-Si -inner，以前述步骤C所得:V端的outer PCR产物模板，利用特异性上游引物GSP1-3' -inner 和 TaKaRa 公司 3' -Full RACE Core Set Ver. 2· 0 (Code :D314)试剂盒中3'端下游引物3' -RACE inner,进行3'端inner PCR扩增 钥辅助因子硫酸化酶基因3'端的特异性上游inner引物GSP1-3' -inner :5' -GGCTCTTGGTATGGATACCGTGAAGTGG-3'； 3'端下游引物3' -RACE inner 3' -RACE inner 5; -CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3'； 扩增得到的产物为cDNA 3'端inner PCR产物，通过克隆测序，得到3'端完整序列； (4)5'端的克隆 E、合成5'端的cDNA第一链 以上述步骤⑴纯化的新疆沙冬青叶片总RNA作为模板，经过Ambion公司FirstChoice RLM-RACE Kit, SKU# :AMl700 试剂盒对 RNA 处理，加入下述 5 ' RACE Adapter 后，以RandomDecamers进行反转录5' RACE Adapter 5/ -GCUGAUGGCGAUGAAUGAACACUGCGUUUGCUGGCUUUGAUGAAA-3,；合成得到反转录产物5'端的cDNA第一链； F、5'-outer PCR 扩增 根据上述步骤⑵得到的中间片段序列，设计并合成特异性下游引物GSP1-5' -outer,以前述步骤E所得反转录产物的cDNA第一链为模板，利用特异性下游引物 GSP1-5' -outer 和 FirstChoiceeRLM-RACE Kit 试剂盒中的 5'端上游引物 5' -RACEouter,进行 5'端 outer PCR 扩增 钥辅助因子硫酸化酶基因5'端的特异性下游outer引物GSPl-5/ -outer 5/ -TTCACCAAGTCAAGGCCAAATCTC-3'； 5'端上游引物5' -RACE outer 5' -RACE outer 5/ -GCTGATGGCGATGAATGAACACTG-3'； 扩增得到的产物为cDNA 5'端； G、5'-inner PCR 扩增 根据前述步骤(2)所得中间片段序列，设计并合成特异性下游引物GSP1-5' -inner,以前述步骤F所得Y端的outer PCR产物模板，利用特异性下游引物GSP1-5' -inner和FirstChoice RLM-RACE Kit 试剂盒中 Y 端上游引物 Y -RACE inner，进行 Y 端 inner PCR扩增 钥辅助因子硫酸化酶基因5'端的特异性下游inner引物GSP1-5' -inner 5/ -CATCACCTGTTGGCTCTCCCTC-3'； 5'端上游引物5' -RACE inner 5' -RACE inner 5/ -CGCGGATCCGAACACTGCGTTTGCTGGCTTTGATG-3'； 扩增得到的产物为cDNA 5'端inner PCR产物，通过克隆测序，得到5'端完整序列； (5)全长序列拼接和基因分析 将上述步骤(2)所得中间片段、步骤(3)所得3'端inner PCR扩增序列和步骤(4)所得5'端inner PCR扩增序列用DNAman软件进行完整序列的拼接，然后通过NCBI里ORFfinder工具分析开放阅读框，即完整的基因序列。
(6)钥辅助因子硫酸化酶基因的克隆 将上述步骤(4)合成5'端的cDNA第一链作为模板，根据上述步骤(5)的基因分析设计上游引物ORFl-S和下游引物0RF1-A，并进行PCR扩增 钥辅助因子硫酸化酶基因扩增引物ORFl-S 5f -ATGGACGACGCCAAAAAAGAG-3'，ORFl-A 5; -TTAAATTGCACAATAGCATGAACTT-3'； 扩增得到的产物为完整的新疆沙冬青的钥辅助因子硫酸化酶基因，通过克隆测序，即得其基因序列。
4.根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于所述的步骤(I)中，采用的RNA提取方法为试剂盒法(北京天恩泽基因科技有限公司的柱式植物RNAott2. O提取试剂盒，CAT#90404-50);纯化方法为DNA酶(北京天恩泽基因科技有限公司的柱式植物RNAQUT2. O提取试剂盒，CAT#90404-50)消化法。
5.根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于所述的步骤⑵中进行PCR扩增时， 扩增体系可优选为 TaqPlusPCR Master Mix 20 μ L, cDNA 模板2 μ L, .2X 引物(jfl/jxl)luL, ddH2016 μ L ; 钥辅助因子硫酸化酶基因中间片段扩增程序分别可优选为 . 95°C,3min ；.95°C，30s, 60°C，30s, 72°C，50s (35 个循环)； .72°C，8min ;4°C保温。
6.根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于所述的步骤(3)中进行3'-outerPCR扩增时， 扩增体系可优选为 IXcDNA Dilution Buffer II8 μ L, cDNA 模板2 μ L, .2X 引物(GSP1-3, -outer/3' RACE-outer)I μ L, 10XLA PCR Buffer II(Mg2+Free)4μ L, MgC12(25mM)3μ L, TaKaRa LA Taq (5U/μ I)0. 25 μ L, ddH2028. 75 μ L0 扩增程序可优选为 . 95°C,3min ；.95°C, 30s ；55°C,30s ；72°C, Imin 30s (35 个循环) .72°C，8min ;4°C保温。
7.根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于所述的步骤(3)中进行3'-innerPCR扩增时， 扩增体系可优选为 dNTP Mixture(2. 5mM each)8 μ L, .3' -outer PCR 产物2 μ L， .2X 引物(GSP1-3, -inner/3' -RACE-inner)I μ L, .10XLA PCR Buffer II(Mg2+Free)4μ L,MgCl2 (25mM)3 μ L, TaKaRa LA Taq (5U/μ I)0. 25 μ L, ddH2028. 75 μ L0 扩增程序可优选为95°C,3min ； 95°C, 30s ；55°C,30s ；72°C, Imin 30s (35 个循环)72°C，8min ;4°C保温。
8.根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于所述的步骤(4)中进行5'-outerPCR扩增时， 扩增体系可优选为cDNA 模板I μΙ_IOX PCR Buffer5 μ dNTP Mix4 μ 2χ引物(GSPl-5'-outer/5'-RACE outer)2 μ ThermostabLe DNA poLymerase+ (0.25 μ1_ of 5υ/μ )1.25 μ!_ddH2034.75 μ ； 扩增程序可优选为95°C,3min ；95°C, 30s ；60°C,30s ；72°C,2min 30s (35 个循环)；72°C，8min ;12°C 保温。
9.根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于所述的步骤(4)中进行5'-innerPCR扩增时， 扩增体系可优选为57-outer PCR 产物I μΙ_IOX PCR Buffer5 μ dNTP Mix4 μ 2χ引物(GSPl-5'-inner/5,-RACE inner)2μΙ ThermostabLe DNA poLymerase+ (0.25 μ of 51Ι/μ )1.25 μ ddH2034.75 μ ； 扩增程序可优选为95°C,3min ；95°C, 30s ；60°C,30s ；72°C,2min 30s (35 个循环)； 72°C，8min，12°C 保温。
10.根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于所述的步骤(6)中进行PCR扩增时，扩增体系可优选为dNTP Mixture(2. 5mM each)4 μ L,.2X 引物(0RF1-S/0RF1-A)I μ L，cDNA 模板1 μ L,.5 X PrimeSTAR Buffer (Mg2+plus)10 μ L,PrimeSTAR HS DNA PLoymerase(2. 5U/μ L)0. 5 μ L,ddH2032. 5 μ L0钥辅助因子硫酸化酶基因扩增程序可优选为.98°C, 30s ；61°C,30s ；72°C,2min 30s (35 个循环)。
全文摘要
本发明公开了一种来源于新疆沙冬青的钼辅助因子硫酸化酶的基因序列，该基因具有如SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列。上述基因编码的钼辅助因子硫酸化酶具有如SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列。此核苷酸序列是新的基因序列。本发明还公开了一种上述来源于新疆沙冬青的钼辅助因子硫酸化酶基因序列的克隆方法。
文档编号C12N15/10GK102660563SQ20121014846
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月15日 优先权日2012年5月15日
发明者于好强, 付凤玲, 刘艳萍, 李晚忱, 邓龙群, 雍太明 申请人:四川农业大学