专利名称：一种来源于矮沙冬青的磷脂酶Dα1的基因序列及其克隆方法
技术领域：
本发明涉及一种来源于矮沙冬青的磷脂酶Da I的基因及其对应编码的氨基酸，此外本发明也涉及到该基因的克隆方法。
背景技术：
矮沙冬青(Ammopiptanthus nanus Cheng f.)又名新疆沙冬青、小沙冬青、矮黄花木，属于豆科(Leguminosae)、黄华族(Thermopsideae)、沙冬青属(Ammopiptanthus Chengf.)，为第三纪孑遗植物，被列为国家一级保护植物。主要分布在海拔1800 2800m的干旱荒山和石质戈壁类型的内蒙古西部和宁夏、甘肃、矮的部分沙漠、荒漠地带，是该区唯一的常绿阔叶灌木，分布区内气候干旱，降水量远小于蒸发量，年平均气温6.8°C，气温变化极值可达70°C以上。 沙冬青具有很强的抗逆性，在相对瘠薄的土壤条件下仍能在高达70°C左右的地表沙温和低至零下20°C 30°C的环境中正常生长发育。有很强的抗寒、抗旱和耐盐碱等抗逆特性。国内外关于沙冬青属植物的报道包括生理生化特性的研究、抗寒、抗旱机理及相关的超微结构；染色体数目及核型、减数分裂期染色体行为、开花物候、和引种栽培试验等。这些研究都证实了沙冬青抗旱耐冻的特性，因此它是珍贵的抗旱耐冻遗传资源。磷脂酶D在维管束运输、质膜降解和胞间信号传递等多种过程中发挥作用。磷脂酶D不仅受到Ca2+、PIP2和自由脂肪酸的调控，同时在植物中也与异源三聚体的G蛋白、微管蛋白、肌动蛋白、蛋白酶和磷酸酶发生互作。具有多个调控结构域和分子互作机制的磷脂酶D，其活性在细胞中是严格控制的。磷脂酶D在底物偏向性、亚细胞分布和空间瞬时基因的表达上的不同，使其能应对多种刺激，包括:冷、机械损伤、植物病害、脱水和高盐胁迫。磷脂酶Da I存在于胞质和质膜上，并且在这两者中相对分布的改变反应了外交界的生长压力和生长阶段。磷脂酶Da I的表达能快速诱导气孔关闭以减少水分散失。矮沙冬青作为优秀的抗逆植物，克隆以上抗逆基因对玉米及其他作物的基础和应用研究具有重要意义。
发明内容
本发明的主要目的就是针对荒漠抗逆植物矮沙冬青的抗逆基因开发研究的局限性，提供一种来源于植物矮沙冬青的磷脂酶Da I的基因序列，以期应用于其它转基因作物中使之具有相应的优良的抗逆性能。本发明的另一个目的是提供一种上述基因序列的克隆方法。为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下:一种来源于矮沙冬青的磷脂酶D α I的基因序列，该序列具有如SEQ ID N0.1所述的核苷酸序列以及克隆该基因对应的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所述。上述核苷酸序列，可通过包括下述步骤的方法，从植物矮沙冬青叶片中提取总RNA、设计引物、进行PCR扩增、测序等克隆得到:
(I)总RNA的提取和纯化:可采用各种通用的RNA提取方法和纯化方法，从植物矮沙冬青叶片中提取得到纯化的矮沙冬青叶片总RNA ;常用的RNA提取方法很多，如试剂盒法、热硼酸法、异硫氰酸胍法、苯酚法、十二烷基硫磺酸钠法、十六烷基三甲基溴化铵法、及各种改进方法等，均可用于矮沙冬青叶片总RNA的提取；本发明中可优选试剂盒法(北京天恩泽基因科技有限公司的柱式植物RNAot2.0提取试剂盒，CAT#90404-50)，进行矮沙冬青叶片总RNA提取。纯化主要是为了去除总RNA中的DNA污染，获得纯化的矮沙冬青叶片总RNA，以满足后续对目的基因的表达进行定量检测等需要。常用的RNA纯化方法包括:DNA酶消化法(简称D法)、酸酚变性法(简称S法)、EDTA法(简称E法)等；本发明中可优选DNA酶(北京天恩泽基因科技有限公司的柱式植物RNAqut2.0提取试剂盒，CAT#90404-50)消化法。(2)中间片段的克隆:A、中间片段cDNA第一链的合成以上述步骤(I)纯化的矮沙冬青叶片总RNA作为模板,使用I RACE Adaptor (可优选 TaKaRa 公司:T-Full RACE Core Set Ver.2.0 (Code:D314)试剂盒)进行反转录，得到的cDNA第一链，作为下述步骤B中PCR扩增的模板。B、PCR 扩增以前述步骤A所得中间片段的cDNA第一链作为模板，利用下述兼并上游引物(jf2)和兼并下游引物(j x2)，进行PCR扩增。磷脂酶Da I基因中间片段扩增引物为:jf2: 5r~ GCCCAAARGAGCTTTCACTY -3、 jx2: 5^- GAAGMARGTGACCRGGAAGG -3^ ；扩增得到矮沙冬青的磷脂酶D α I基因cDNA中间片段，通过克隆测序，得到中间片段序列。本步骤中，扩增体系可优选为:TaqPlusPCR Master Mix 20 μ L , cDNA 模板 2 μ L ,2X 引物(jx2/jf2) I μ L，ddH20 16 μ L。扩增程序可优选为:95 °C, 3min ；95°C, 30 s，58 °C,30 s,72°C,50 s (35 个循环)；72°C，8 min ;4°C 保温。(3) 3'端的克隆:C、3，-outer PCR 扩增根据上述步骤(2)得到的中间片段序列，设计并合成特异性上游引物GSP2-3'-outer，以前述步骤(2)A所得的cDNA第一链为模板，利用特异性上游引物GSP2-3'-outer 和:T 端下游引物:T-RACE outer(可优选 TaKaRa 公司:T-Full RACE CoreSet Ver.2.0 (Code:D314)试剂盒)，进行 3,端 outer PCR 扩增:磷脂酶D α I基因3’端的特异性上游outer引物为:GSP2-3'-outer: 5^- GGATGGTGCTAGGGACTCTGAGATTGCC -3^ ；3Λ 端下游引物 3Λ-RACE outer 为:3Λ-RACE outer: 5^- TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT -3^ ；
扩增得到的产物为cDNA 3Λ端。本步骤中，扩增体系可优选为:IXcDNA Dilution Buffer II 8 yL，cDNA 模板 2 yL，2 X 引物(GSP2-3，-outer/3，-RACE-outer) I yL ,10XLA PCR Buffer II (Mg2+ Free) 4 yL , MgCl2 (25 mM) 3 yL ,TaKaRa LA Taq (5 U/μ I) 0.25 μ L , ddH20 28.75 μ L。扩增程序可优选为:95°C, 3 min ；95°C, 30 s ；55°C,30 s ；72°C, I min 30 s (35 个循环)；72°C，8 min ;4°C 保温。D、3，-1nner PCR 扩增根据前述步骤(2)所得中间片段端序列，设计并合成特异性上游引物GSP2-3r -1nner，以前述步骤C所得:T端的outer PCR产物模板，利用特异性上游引物GSP2-3'-1nner 和:T 端·下游引物:T-RACE inner(可优选 TaKaRa 公司 3^Full RACE CoreSet Ver.2.0 (Code:D314)试剂盒)，进行 3,端 inner PCR 扩增:磷脂酶D α I基因3’端的特异性上游inner引物为:GSP2-3:1nner: 5^- CCACGGTCTTCGCATGGCATTGTGGTAT -3^ ；3Λ 端下游引物 3'_RACE inner 为:3Λ-RACE inner: 5^- CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG -3^ ；扩增得到的产物为cDNA 3'端inner PCR产物，通过克隆测序，得到3'端完整序列。本步骤中，扩增体系可优选为:dNTP Mixture (2.5 mM each) 8 μ L ,3，-outer PCR 产物 2 uL ,2 X 引物(GSP2-3，-1nner/3，-RACE-1nner) I yL ,10XLA PCR Buffer II (Mg2+ Free) 4 yL , MgCl2 (25 mM) 3 yL ,TaKaRa LA Taq (5 U/μ I) 0.25 μ L , ddH20 28.75 μ L。扩增程序可优选为:95 °C, 3 min ；95°C, 30 s ；55°C,30 s ；72°C, I min 30 s (35 个循环)；72 °C, 8 min ;4°C 保温。(4) 5'端的克隆:E、合成5'端的cDNA第一链以上述步骤(I)纯化的矮沙冬青叶片总RNA作为模板，经过对RNA进行预处理(可优选 Ambion 公司 FirstChoice RLM-RACE Kit, SKU #:AM1700 试剂盒)，加入 5Λ RACEAdapter进行反转录，通过所述预处理实现对非完整mRNA的脱磷酸化和对完整mRNA的脱帽处理，排除非完整mRNA干扰，使得完整的mRNA能够高效地与Y RACE Adapter连接。所述5' RACE Adapter 为:5r RACE Adapter: 5、GCUGAUGGCGAUGAAUGAACACUGC⑶UUGCUGGCUUUGAUGAAA-3^ ；
合成得到反转录产物5'端的cDNA第一链。F、5’ -outer PCR 扩增根据上述步骤(2)得到的中间片段序列，设计并合成特异性下游引物GSP2-5' -outer，以前述步骤E所得反转录产物的cDNA第一链为模板，利用特异性下游引物GSP2-5'-outer 和 5Λ 端上游引物 5、RACE outer (可优选 FirstChoice RLM-RACE Kit 试剂盒)，进行5Λ端outer PCR扩增:磷脂酶D α I基因5’端的特异性下游outer引物为:GSP2-5'-outer: 5^- CATGGCAATCTCAGAGTCCCTAGCAC -3^ ；端上游引物 5、RACE outer 为:5Λ-RACE outer: 5^- GCTGATGGCGATGAATGAACACTG -3^ ；扩增得到的产物为cDNA 5'端。本步骤中，扩增体系可优选为:cDNA 模板 I μ L，10X PCR Buffer 5 μ L，dNTP Mix 4 yL，2X 引物(GSP2_5r-outer/V-RACE outer) 2 yL ,ThermostabLe DNA poLymerase(0.25 μ L of 5U/ μ L) 1.25 μ L , ddH20 34.75μ L ο扩增程序可优选 为:95°C, 3 min ；95°C, 30 s ；60°C,30 s ；72°C, I min/kbp (35 个循环);72°C，8 min ;12°C保温。G、5，-1nner PCR 扩增根据前述步骤(2)所得中间片段序列，设计并合成特异性下游引物GSP2-5^inner，以前述步骤F所得Y端的outer PCR产物模板，利用特异性下游引物GSP2-5,-1nner 和 5Λ 端上游引物 5、RACE inner (可优选 FirstChoice RLM-RACE Kit 试剂盒)，进行5Λ端inner PCR扩增:磷脂酶D α I基因5’端的特异性下游inner引物为:GSP2-5:1nner: 5^- TTCATCATCAACTATCATCATCTTGG -3^ ；端上游引物 5Λ-RACE inner 为:5Λ-RACE inner: 5^- CGCGGATCCGAACACTGCGTTTGCTGGCTTTGATG -3^ ；扩增得到的产物为cDNA 端inner PCR产物，通过克隆测序，得到5'端完整序列。本步骤中，扩增体系可优选为:5’ -outer PCR 产物 I μ L，10X PCR Buffer5 yL ,dNTP Mix 4 μ L，2 X 引物(GSP2-5,-1nner/V-RACE inner) 2 μ L，ThermostabLe DNA poLymerase (0.25 μ L of 5U/ μ L) 1.25 μ L , ddH2034.75μ L。扩增程序可优选为:95°C, 3 min ；95°C, 30 s ；60°C,30 s ；72°C, I min/kbp (35 个循环);
72°C，8 min，12°C保温。(5)全长序列拼接和基因分析:将上述步骤(2)所得中间片段、步骤(3)所得3'端inner PCR扩增序列和述步骤
(4)所得5'端inner PCR扩增序列用DNAman软件进行完整序列的拼接，然后通过NCBI里ORF finder工具分析开放阅读框，即完整的基因序列。(6)憐脂酶D α I基因的克隆:将上述步骤(5)所分析的完整基因序列作为模板，设计上游引物0RF2-S和下游引物0RF2-A，并进行PCR扩增:磷脂酶Dd I基因扩增引物为:0RF2-S: 5r~ ATGGCACAGATTCATCTTCATGGAA -3、0RF2-A: 5^- CTATGTGGTAAGGATTGGAGGCATG-3Λ ；扩增得到的产物为完整的矮沙冬青的磷脂酶Da I基因，通过克隆测序，即得其基因序列。本步骤中，扩增体系可优选为:dNTP Mixture (2.5 mM each) 4 yL，2X 引物(0RF2-S/0RF2-A) I yL ,cDNA 模板 I μ L , 5 XPrimeSTAR Buffer (Mg2+ plus) 10 μ L ,`
PrimeSTAR HS DNA PLoymeraseC 2.5 U/μ L) 0.5 μ L，ddH20 32.5 μ L
ο磷脂酶D α I基因扩增程序可优选为:98°C, 30 s ；62°C,30 s ；72°C,2 min 30 s (35 个循环)；与现有技术相比，本发明的有益效果是:本发明来源于植物矮沙冬青的磷脂酶Da I的基因序列是新的基因序列，使人们对这些基因的研究对象从细菌及其他植物体进一步扩展到矮沙冬青。并且，根据在矮沙冬青植物的这些基因所具备的优良的抗旱、耐盐等性能可以预料:如果将其通过转基因技术导入玉米等其他植物的基因中，将可培育出具有相应的优良的抗旱、耐盐等性能的植物新品种。
图1为AnPLDa I基因电泳检测结果图，图2为AnPLDa I基因中间片段电泳检测结果图，图3为AnPLD a I基因:T端inner PCR电泳检测结果图，图4为AnPLDa I基因Y端inner PCR电泳检测结果图，图5为AnPLDa I基因编码的氨基酸与其他物种同源基因编码的氨基酸的进化树分析图，图6为AnPLD a I基因编码的氨基酸所具有的保守结构域分析图，图7为AnPLD a I基因转化拟南芥在盐胁迫下的对照试验图。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明的上述发明内容作进一步的详细描述。
但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。在下述各实施例中，将矮沙冬青的磷脂酶Da I简称为PLDa I。通过各实施例，最终得到来源于矮沙冬青的磷脂酶D a I基因核苷酸序列(如SEQ ID N0.1所述)及其对应的氨基酸序列(如SEQ ID N0.2所述)。实施例1本实施例为矮沙冬青叶片总RNA的提取和纯化，总RNA提取使用北京天恩泽基因科技有限公司的柱式植物RNAOUIVci提取试剂盒，CAT#90404-50，包括下述步骤:(I)估算组织细胞的用量。每次微量提取一般需要100-200 mg植物叶片或50-100mg植物种子或200-500 mg植物果实。(2)先将新鲜植物组织剪切成小块(保存在RNAL0CKER中的植物组织需用纸吸去RNAL0CKER液体后再剪切成小块)，放入10-15 mL塑料离心管中，加入I mL 65°C预热的溶液A (用前需要摇晃混匀)，然后用匀浆器匀浆5-20秒。匀浆时会产生泡沫，但不影响提取效果。也可以使用液氮砚磨法破碎植物组织，砚磨完后加入I mL溶液A，但效果比较差，因为研钵本质是二氧化硅，在溶液A存在时会吸附RNA。(3)将匀浆物或砚磨物转移至干净的1.5 mL塑料离心管中(可以不必转移非液体的细胞碎片)。有的植物组织(比如果实)含有大量水份，匀浆液会多于I mL，转移时也只取
ImL。(4)在离心管中加入0.3 mL的溶液B和0.2 mL自备氯仿，在振荡器上振荡30秒混匀，此时溶液呈均匀的·乳浊状。振荡器振荡时必须使管底溶液震荡起来。(5)室温12000 rpm离心3-5分钟，两相间有约5mm厚的细胞破碎物。(6)将上清液(约0.6 mL)转移到另一干净的1.5 mL塑料离心管中，下层有机相和中间层含有DNA、蛋白质和其他杂质,避免触及或吸取。最好留下100 uL上清液不取。(7)加入等体积的溶液C，充分颠倒混匀。(8)将一半溶液转移到离心吸附柱(60911B)中，12000 rpm室温离心半分钟，弃穿透液。注意不要跟用于RNA提取的吸附柱(60911D)混用。(9)将剩下的一半溶液转移到同一离心吸附柱中，12000 rpm室温离心半分钟，弃
穿透液。(10)将0.7 mL通用洗柱液加入到离心吸附柱中，12000 rpm室温离心10-30秒，
弃穿透液。(11) 12000 rpm室温离心10秒以便去除残留液体。(12)将 10 uL (10 U)的 RNase-free DNase 加入到 50 uL37°C预热的 DNA 膜反应液中，吹打混匀配制成DNase工作液。(13)将DNase工作液在37°C预热I分钟，然后全部加入到离心吸附柱中，室温放置5分钟。注意:5分钟一般足够降解大多数情况下的DNA污染。如果DNA没有彻底降解(可能由于样品中残留的杂质抑制了 DNase的活性)，此步的保温时间可以适当延长到10分钟或15分钟。(14)直接在离心吸附柱中加入0.7 mL通用洗柱液，盖上盖后颠倒数次混匀。
(15) 12000 rpm室温离心半分钟,弃穿透液。(16)再加0.3 mL通用洗柱液到离心吸附柱，12000 rpm室温离心半分钟,弃穿透液。(17) 12000 rpm室温离心半分钟。此步十分重要，否则残留乙醇会影响RNA的使用。(18)将离心吸附柱转移到RNase-free收集管中，加入30-50 uL RNA洗脱液，室温放置1-2分钟。(19) 12000 rpm室温离心半分钟，离心管中溶液即为RNA样品。本产品提供的离心吸附柱吸附力较强，一次洗脱不能全部将膜上RNA洗下，如有必要，可以再加入30-50 uLRNA洗脱液一次。实施例2本实施例为矮沙冬青总RNA的反转录，其反转录得到的cDNA第一链用于基因中间片段和3’端扩增的模板，按照Takara公司的UulI RACE Core Set Ver.2.0, Code:D314试剂盒说明书进行cDNA第一链合成。实施例3本实施例为AnPLDa I基因中间片段的克隆，方法如下:以豆科植物花生PLD (AY274834.1)为询问序列，参考花生PLDa I(AB232321.1)、豇豆 (U92656.1)、大豆(AK286886.1)、紫花苜蓿(AC149206.2)、琴叶拟南芥(XM_002882913.1)序列设计兼并引物jf2/jx2:jf2: 5r~ GCCCAAARGAGCTTTCACTY -3 ；jx2: 5r~ GAAGMARGTGACCRGGAAGG -3'。以实施例2的cDNA第一链为模板，以设计的兼并引物jf2和jx2进行AnPLD a I基因cDNA中间片段的扩增。扩增体系为:TaqPlusPCR Master Mix 20 μ L , cDNA 模板 2 μ L ,2Χ 引物(jx2/jf2) I μ L，ddH20 16 μ L。扩增程序为:95°C，3min ；95°C, 30 s，58 °C,30 s,72°C,50 s (35 个循环)；72°C，8 min ;4°C 保温。
取所得扩增产物20 μ L经1%非变性琼脂糖凝胶100 V电泳30 min, GoLdenView染色后紫外线检测扩增片段，结果如图2所示。扩增得到的产物为AnPLDa I基因cDNA中间片段，通过包括下述步骤的方法克隆测序，得到的中间片段序列如SEQ ID N0.3所述:①目的片段的回收与纯化:将扩增出来的特异条带用干净刀片在紫外光下快而准确的从琼脂糖中挖出，置于1.5 mL离心管中，用凝胶回收试剂盒(OMEGA公司的E.Z.N.A.TM GeL Extraction Kit)回收胶中的DNA片段；②连接反应:将回收的DNA片段克隆于TaKaRa公司的pMD19_T载体中。连接反应采用连接试剂盒(Takara公司)，扩增体系总体积10 μ L，16°C连接过夜；③感受态细胞的制备:1、从LB平板上挑取新活化的E.coLi DH5 α单菌落，接种于3-5 mL LB液体培养基中，37 °C，225 r/min振荡培养12 h左右，直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100 mL LB液体培养基中，37 °C振荡培养2-3 h至0D600 =
0.35-0.5 左右；I1、将培养液转入离心管，冰上放置10 min，然后于4°C下3000 r/min离心10min ；II1、弃去上清，用预冷的0.05 moL/L的CaCL2溶液10 mL轻轻悬浮细胞，冰上放置15-30 min 后，4°C下 3000 r/min 离心 10 min ；IV、弃去上 清，加入4 mL预冷含15%甘油的0.05 moL/L的CaCL2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液；V、感受态细胞分装成100 μ L的小份，贮存于_70°C可保存半年；④质粒DNA的转化:1、从_80°C冰箱中取出一管大肠杆菌感受态细胞DH5 α，置于冰上融化；I1、在无菌条件下加入10 μ L连接反应液，轻轻震摇混匀后，在冰上放置30 min ；II1、42°C水浴热击90 S，不要摇动，之后迅速放入冰浴冷却2-3 min ;IV、加入890 μ L无Amp的LB液体培养基,混勻后,37°C、150 r/min摇床振摇培养，温育I h ；V、取100 μ L已转化的菌液涂于一个LB/Amp的培养平板上，正面朝上放置30min，待菌液完全被培养基吸收后，用封口膜封住，然后倒转培养皿，37°C避光培养12-16 h ；随后筛选阳性菌落；⑤重组菌落的鉴定与保存:从外观上看，一般白色且圆的菌落为阳性，通过菌液PCR进一步鉴定:1、在过夜培养的平板上用灭菌的小枪头挑取几个白色菌落，分别点种于含0.1g/L Amp的LB液体培养基的1.5 mL离心管中，37°C, 150 r/min振摇培养4_6h ；I1、取I UL菌悬液作为模板，用引物jfl/jxl进行PCR扩增，PCR反应条件中裂解时间延长至5min，用1%的非变性琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。如果产物为目的条带时，此菌落为阳性克隆，否则为阴性。同时设不加菌悬液的阴性对照；II1、取已经鉴定的阳性克隆的菌落悬浮液750 μ L，加入250 μ L的灭菌甘油，混匀后，用液氮速冻，置于-80°C冰箱中保存备用；IV、最后送英俊生物技术公司测序，所得序列在NCBI的BLastn进行比对分析，验证克隆片段是否正确。实施例4本实施例为AnPLDa I基因3'端的克隆，方法如下:(1)3，-outer PCR 扩增:根据实施例3得到的中间片段序列，设计并合成特异性上游引物GSP2-3、0uter，以实施例2所得反转录产物的cDNA第一链为模板，利用特异性上游引物GSP2-3'-outer和 TaKaRa 公司:T-Full RACE Core Set Ver.2.0 (Code:D314)试剂盒中:T 端下游引物3Λ -RACE outer,进行 3Λ 端 outer PCR 扩增:GSP2-3、outer: 5^- GGATGGTGCTAGGGACTCTGAGATTGCC -3^ ；3Λ-RACE outer: 5^- TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT -3^ ；扩增体系为:IXcDNA Dilution Buffer II 8 μ L , cDNA 模板 2 μ ,2 X 引物(GSP2-3，-outer/3，-RACE-outer) I yL ,10XLA PCR Buffer II (Mg2+ Free) 4 yL , MgCl2 (25 mM) 3 yL ,TaKaRa LA Taq (5 U/μ I) 0.25 μ L , ddH20 28.75 μ L。扩增程序为:95°C, 3 min ；95°C, 30 s ；55°C,30 s ；72°C, I min 30 s (35 个循环)；72°C，8 min ;4°C 保温。(2) 3，-1nner PCR 扩增:根据实 施例3所得中间片段序列，设计并合成特异性上游引物GSP2-3'-1nner，以上述(I)所得outer PCR产物为模板，利用特异性上游引物GSP2-3' -1nner和TaKaRa公司
3,-Full RACE Core Set Ver.2.0 (Code:D314)试剂盒中:T 端下游引物:T-RACE inner,进行3 ^端inner PCR扩增:GSP2-3'-1nner: 5^- CCACGGTCTTCGCATGGCATTGTGGTAT -3^ ；3r-RACE inner: 5^- CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG -3 ；扩增体系为:dNTP Mixture (2.5 mM each) 8 μ L , cDNA 模板 2 uL ,2 X 引物(GSP2-3，-1nner/3，-RACE-1nner) I yL ,10XLA PCR Buffer II (Mg2+ Free) 4 yL , MgCl2 (25 mM) 3 yL ,TaKaRa LA Taq (5 U/ μ I) 0.25 μ L , ddH20 28.75 μ L。扩增程序为:95 °C, 3 min ；95°C, 30 s ；60°C,30 s ；72°C, I min 30 s (35 个循环)；72°C，8 min ;4°C 保温。取所得扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示。扩增得到的产物为AnPLD α I基因3'端cDNA完整序列inner PCR产物，通过克隆测序(同实施例3)，得到的3,端cDNA完整序列如SEQ ID N0.4所述。实施例5本实施例为5Λ端扩增的cDNA第一链合成:以实施例1纯化的矮沙冬青叶片总RNA作为模板,经过Ambion公司FirstChoice RLM-RACE Kit, SKU #:AM1700 试剂盒对 RNA 处理，加入下述 Y RACE Adapter 后，以 RandomDecamers进行反转录:5r RACE Adapter: 5、GCUGAUGGCGAUGAAUGAACACUGC⑶UUGCUGGCUUUGAUGAAA_3Λ ；合成得到反转录产物5'端的cDNA第一链。
实施例6本实施例为AnPLDa I基因5'端的克隆，包括下述步骤:(1)5，-outer PCR 扩增:根据实施例3得到的中间片段序列，设计并合成特异性下游引物GSP2-5、outer，以实施例5所得反转录产物的cDNA第一链为模板，利用特异性下游引物GSP2-5' -outer和试剂盒 FirstChoice RLM-RACE Kit, SKU #:AM1700 中上游引物 5Λ-RACE outer，进行 5Λ端outer PCR扩增:GSP2-5r-outer: 5^- CATGGCAATCTCAGAGTCCCTAGCAC -3^ ；5r-RACE outer: 5^- GCTGATGGCGATGAATGAACACTG -3^ ；扩增体系为:cDNA 模板 I μ L，10X PCR Buffer 5 μ L，dNTP Mix 4 yL，2Χ 引物(GSP2_5r-outer/V-RACE outer) 2 yL ,ThermostabLe DNA poLymerase (0.25 μ L of 5U/ μ L) 1.25 μ L , ddH2034.75 μ L。扩增程序为:95 °C, 3 min ；95°C, 30 s ；60°C,30 s ；72°C,2 min 30 s (35 个循环);72°C，8 min ;12°C保温。(2) 5，-1nner PCR 扩增:根据实施例3得到的中间片段序列，设计并合成特异性下游引物GSP2-5'-1nner，以上述(I)所得outer PCR产物为模板，利用特异性下游引物GSP2-5r -1nner和试剂盒FirstChoice RLM-RACE Kit, SKU #:AM1700 中上游引物 5Λ-RACE inner，进行 Y 端 innerPCR扩增:GSP2-5、inner: 5^- TTCATCATCAACTATCATCATCTTGG -3^ ；5Λ-RACE inner: 5^- CGCGGATCCGAACACTGCGTTTGCTGGCTTTGATG -3 ；扩增体系为:5’ -outer PCR 产物 I μ L，10X PCR Buffer 5 yL ,dNTP Mix 4 yL，2 X 引物(GSP2_5r-1nner/V-RACE inner) 2 yL ,ThermostabLe DNA poLymerase(0.25 μ L of 5U/ μ L)l.25 μ L , ddH20 34.75μ L o扩增程序为:95°C, 3 min ；95°C, 30 s ；60°C,30 s ；72°C,2 min 30 s (35 个循环)；72°C，8 min ;12°C保温。取所得扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示。扩增得到的产物为AnPLD α I基因5'端cDNA完整序列inner PCR产物，通过克隆测序(同实施例3)，得到的5,端cDNA完整序列如SEQ ID N0.5所述。
实施例7本实施例为An PLD α I基因全长序列拼接和基因分析，包括下述步骤:
将上述实施例3所得中间片段、实施例4所得:T端inner PCR扩增序列和实施例6所得5'端inner PCR扩增序列用DNAman软件进行完整序列的拼接，然后通过NCBI里ORFfinder工具分析开放阅读框，即完整的基因序列。实施例8本实施例为AnPLD α I基因克隆，方法如下:以实施例7的基因分析设计上游 引物0RF2-S和下游引物0RF2-A，以实施例5所得反转录产物的cDNA第一链为模板进行PCR扩增:0RF2-S: 5^- ATGGCACAGATTCATCTTCATGGAA -3、0RF2-A: 5^- CTATGTGGTAAGGATTGGAGGCATG-3^ ；扩增体系为:dNTP Mixture (2.5 mM each) 4 yL，2X 引物(0RF2-S/0RF2-A) I yL ,cDNA 模板 I μ L , 5 XPrimeSTAR Buffer (Mg2+ plus) 10 μ L ,PrimeSTAR HS DNA PLoymerase (2.5 U/ μ L) 0.5 μ L , ddH20 32.5 μ L。扩增程序为:98°C, 30 s ；62°C,30 s ；72°C,2 min 30 s (35 个循环)；取所得扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。扩增得到的产物为完整的AnPLD α I基因序列，如SEQ ID N0.1所述；其对应的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所述。实施例9本实施例为AnPLD α I基因编码的氨基酸的进化树分析，方法如下:以实施例8所得的AnPLD α I氨基酸序列，用MEGA4软件进行进化树分析，参与进化树分析的氨基酸及其物种名称分别为=AnPLDa I (矮沙冬青)、OsPLD α (水稻)、ZmPLD a(玉米)、BoPLD a (甘蓝)、AtPLD a (拟南芥)、VuPLD a (豇豆)、RcPLDa (蓖麻)、NtPLD a(烟草)、MtPLD a (蒺藜苜蓿)、GmPLDa 1-1ike (大豆)、AhPLD a (花生)、GrPLD a (棉花)、SlPLDa (番茄)、FPLD a (草莓)。结果如图5所示。氨基酸序列同源性分析表明，矮沙冬青磷脂酶Da I (AnPLD a I)与蓖麻磷脂酶Da I (RcPLDa I)、烟草磷脂酶Da I (NtPLD a I)和蒺藜苜蓿磷脂酶D a (MtPLDa)的同源性分别达 85.64%,84.41% 和 73.03%。实施例10本实施例为AnPLD a I基因编码氨基酸序列的保守结构域分析，方法如下:用NCBI 的保守结构域分析工具 CDD (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/cdd/)分析矮沙冬青AnPLD a I基因编码蛋白质的保守结构域。结果如图6所示。该图显示AnPLD a I基因编码的蛋白含有3个超家族结构(图):一是靠近N-端的C2超家族，其特殊匹配位点即为C2植物PLD，在动物和真菌中不存在这种结构，许多C2结构域都是钙离子依赖的膜靶向的模块，用于结合多种基团；二是中间的PLDc_SF超家族，它是PLD超家族蛋白的催化结构域，其上还具有PLDc_pPLD alpha_2特殊匹配位点，同样作为植物PLD α的催化结构域，包括一个保守的HKD模块(Η-Χ_Κ_Χ (4) _D，X表示任意的氨基酸残基)，组氨酸在催化过程中发挥重要作用；三是靠近C-端的PLD_C超家族，它是PLD蛋白的C-末端结构。最终的复杂结构域为PLN02270，即对应为PLDa蛋白。
实施例11本实施例为拟南芥盐胁迫对照试验，步骤如下:(I)取未转基因的突变体(CK)、转野生型(W)的及转突变体的纯合阳性株(AnPLDa I)系种子各30mg，4° C避光春化处理2天，分别播种到含基质的培养钵(营养土:蛭石=4:1);(2)将播种后的培养钵转移至培养室培养，温度20-22° C，生长湿度为60_70%，光照IOh/黑暗14h ；(3)待种子发芽14天后，取长势基本一致的幼苗分别移栽，各株系分别移栽6棵；培养室继续培养，温度20-22° C，生长湿度为60-70%，光照IOh/黑暗14h ；(4)待移栽后的第27天，做最后一次浇水；第30天，用含200mM NaCl的水浸泡培养钵2h待培养钵中营养土充分吸收含NaCl的水分；5天后，再做一次相同的盐胁迫处理。(5)处理结束I周后，转野生型及转突变体的苗子长势均优于未转基因的突变体，生长较健壮。说明本发明所述的AnPLDa I基因转到拟南芥后能正常表达并使转基因植株显示出耐盐功能。结果如图7所 示。
权利要求
1.一种来源于矮沙冬青的磷脂酶Da I的基因序列，该基因具有如SEQ ID NO. I所述的核苷酸序列。
2.根据权利要求I所述的序列，其特征在于该基因的所述的核苷酸序列对应的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所述。
3.依照权利要求I所述的一种来源于矮沙冬青的磷脂酶DaI基因序列的克隆方法，包括下述主要步骤 (1)总RNA的提取和纯化 采用各种通用的RNA提取方法和纯化方法，从植物矮沙冬青叶片中提取得到纯化的矮沙冬青叶片总RNA。
(2)中间片段的克隆 A、中间片段cDNA第一链的合成 以上述步骤(I)纯化的矮沙冬青叶片总RNA作为模板，以含有接头的3' RACE Adaptor引物进行反转录，得到的cDNA第一链，作为下述步骤B中PCR扩增的模板。
B、PCR扩增 以前述步骤A所得中间片段的cDNA第一链作为模板，利用下述上游引物jf2和下游引物jx2，进行PCR扩增。
扩增得到矮沙冬青的磷脂酶D α I基因cDNA中间片段，通过克隆测序，得到中间片段序列。
(3)3,端的克隆 C、3，-outerPCR 扩增 根据上述步骤(2)得到的中间片段序列，设计并合成特异性上游引物GSP2-3'-outer，以前述步骤(2)A所得的cDNA第一链为模板，利用特异性上游引物GSP2-3、0uter和3'端下游引物3,-RACE outer,进行3,端outer PCR扩增 扩增得到的产物为cDNA 3'端。
D、3，-innerPCR 扩增 根据前述步骤(2)所得中间片段端序列，设计并合成特异性上游引物GSP2-3'-inner，以前述步骤C所得3'端的outer PCR产物模板，利用特异性上游引物GSP2_3、inner和3'端下游引物3,-RACE inner,进行3,端inner PCR扩增 扩增得到的产物为cDNA 3'端inner PCR产物，通过克隆测序，得到3'端完整序列。
(4)5'端的克隆 E、合成5'端的cDNA第一链 以上述步骤(I)纯化的矮沙冬青叶片总RNA作为模板，对RNA进行预处理，加入含有接头的5Λ RACE Adapter引物进行反转录 合成得到反转录产物5'端的cDNA第一链。
F、5，-outerPCR 扩增 根据上述步骤(2)得到的中间片段序列，设计并合成特异性下游引物GSP2-5'-outer，以前述步骤E所得反转录产物的cDNA第一链为模板，利用特异性下游引物GSP2-5'-outer和5,端上游引物5,-RACE outer，进行5,端outer PCR扩增 扩增得到的产物为cDNA 5,端。G、5，-inner PCR 扩增 根据前述步骤(2)所得中间片段序列，设计并合成特异性下游引物GSP2-5'-inner，以前述步骤F所得5'端的outer PCR产物模板，利用特异性下游引物GSP2-5、inner和5'端上游引物5,-RACE inner,进行5,端inner PCR扩增 扩增得到的产物为cDNA 5'端inner PCR产物，通过克隆测序，得到5'端完整序列。
(5)全长序列拼接和基因分析 将上述步骤(2)所得中间片段、步骤(3)所得:T端inner PCR扩增序列和步骤(4)所得5'端inner PCR扩增序列进行完整序列的拼接，即完整的基因序列。
(6)磷脂酶DaI基因的克隆 将上述步骤(4)合成5'端的cDNA第一链作为模板，根据上述步骤(5)的基因分析设计上游引物0RF2-S和下游引物0RF2-A，并进行PCR扩增 扩增得到的产物为完整的矮沙冬青的磷脂酶Da I基因，通过克隆测序，即得其基因序列。
4.根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于所述的步骤(I)中，采用的RNA提取方法为试剂盒法；纯化方法为DNA酶消化法。
5.根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于所述的步骤(2)中进行PCR扩增时， 扩增体系可优选为 TaqPlusPCR Master Mix 20 μ L , cDNA 模板 2 μ L , 2X 引物(jf2/jx2) I μ L，ddH20 16 μ L。
磷脂酶Da I基因中间片段扩增程序分别可优选为95°C,3min ； 95°C, 30 s，58。。，30 s,72°C,50 s，35 个循环; 72°C，8 min ;4°C保温。
6.根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于所述的步骤(3)中进行3’-outerPCR扩增时， 扩增体系可优选为 IXcDNA Dilution Buffer II 8 yL , cDNA 模板 2 yL， 2X 引物(GSP2-3，-outer/3，-RACE-outer) I yL , 10XLA PCR Buffer II (Mg2+ Free) 4 yL，MgCl 2 (25 mM) 3 yL , TaKaRa LA Taq (5 U/μ I) 0. 25 μ L，ddH20 28.75 μ L。
扩增程序可优选为95。。，3 min ；95°C, 30 s ；55°C,30 s ；72°C, I min 30 s，35 个循环； 72°C，8 min ;4°C保温。
7.根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于所述的步骤(3)中进行3’-innerPCR扩增时， 扩增体系可优选为 dNTP Mixture (2. 5 mM each) 8 μ L ,3，-outer PCR 产物 2 uL , 2X 引物(GSP2-3，-inner/3，-RACE-inner) I yL ,IOXLA PCR Buffer II (Mg2+ Free) 4 yL , MgCl2 (25 mM) 3 yL , TaKaRa LA Taq (5 U/μ I) 0.25 μ L，ddH20 28.75 μ L。
扩增程序可优选为:95。。，3 min ；95°C, 30 s ；55°C,30 s ；72°C, I min 30 s，35 个循环； 72°C，8 min ;4°C保温。
8.根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于:所述的步骤(4)中进行5’-outerPCR扩增时， 扩增体系可优选为: cDNA 模板 I μ L，IOX PCR Buffer 5 μ L， dNTP Mix 4 yL ,2X 引物(GSP2-5,-outer/V-RACE outer) 2 yL ,ThermostabLe DNA poLymerase (0.25 μ L of 5U/ μ L) 1.25 μ L , ddH20 34.75μ L ο 扩增程序可优选为:95。。，3 min ；95°C, 30 s ；60°C,30 s ；72°C,2 min 30 s，35 个循环; 72°C，8 min ;12°C保温。
9.根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于:所述的步骤(4)中进行5’-1nnerPCR扩增时， 扩增体系可优选为: 5，-outer PCR 产物 I μ L，10X PCR Buffer 5 yL ,dNTP Mix 4 yL ,2X 引物(GSP2-5,-1nner/V-RACE inner) 2 yL ,ThermostabLe DNA poLymerase (0.25 μ L of 5U/μ L) 1.25 μ L , ddH20 34.75μ L ο 扩增程序可优选为:95。。，3 min ；95°C, 30 s ；60°C,30 s ；72°C,2 min 30 s，35 个循环; 72。。，8 min，12°C保温。
10.根据权利要求3所述的克隆方法，其特征在于:所述的步骤(6)中进行PCR扩增时， 扩增体系可优选为: dNTP Mixture (2.5 mM each) 4 yL，2X 引物(0RF2-S/0RF2-A) I yL , cDNA 模板 I μ L ,5XPrimeSTAR Buffer (Mg2+ plus) 10 μ L， PrimeSTAR HS DNA PLoymerase (2.5 U/μ L) 0.5 μ L，ddH20 32.5 yL。
磷脂酶D α I基因扩增程序可优选为: 98°C, 30 s ；62°C,30 s ；72°C,2 min 30 s，35 个循环。
全文摘要
本发明公开了一种来源于矮沙冬青的磷脂酶Dα1的基因序列，该基因具有如SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列。上述基因编码的磷脂酶Dα1具有如SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列。此核苷酸序列是新的基因序列。本发明还公开了一种上述来源于矮沙冬青的磷脂酶Dα1基因序列的克隆方法。
文档编号C12N9/16GK103255155SQ20131017506
公开日2013年8月21日 申请日期2013年5月13日 优先权日2012年5月15日
发明者付凤玲, 于好强, 李晚忱, 刘艳萍, 雍太明, 邓龙群, 佘跃辉, 周树峰 申请人:四川农业大学