专利名称：高效降解半纤维素的杂合木聚糖酶基因fsi-a124的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种可高效降解半纤维素的杂合木聚糖酶基因/ /12匆。
背景技术：
木聚糖是自然界中继纤维素之后第二丰富的再生生物资源，广泛存在于糠麸、玉米芯、稻草、甘蔗渣和秸杆等农业副产品中。在养殖业、酿酒工业和造纸工业中木聚糖具有副作用，但其也可用于低聚木糖、液体燃料等高附加值产品的生产。木聚糖酶能够特异性降解木聚糖，可广泛应用于食品、饲料和造纸等工业中，深入开展木聚糖酶的研究对于相关产业的发展具有要作用。在工业应用上，木聚糖酶的理想特性是同时具有较宽的最适温度和pH,良好的热稳定性和pH稳定性，以及具备较好的底物结合、水解性能，然而此类理想型的木聚糖酶很难从自然界直接获取，因此需要利用基因工程或蛋白质工程技术对酶分子进行改造。木聚糖酶的性质取决于酶分子的结构，传统的菌种选育方法难以在短期内达到预期 目的。因此，开展提高木聚糖酶热稳定性和底物结合水解性能的研究具有重要的理论意义和应用价值。微生物产生的木聚糖降解酶系复杂，同时分泌多种水解酶。如褐色高温单孢菌木聚糖酶分泌降解木聚糖的酶包括内切木聚糖酶、β -木糖苷酶和阿拉伯木聚糖酶;C thermocellum中包含至少15种纤维素酶基因、两种木聚糖酶基因和两种糖苷酶基因。这些酶性质相近，有的为同工酶，使得野生型木聚糖酶分离纯化和酶学性质研究难度较大。近年来嗜极端酶成为研究的热点，直接培养极端微生物来分离嗜极端酶相当困难，而实现木聚糖酶工业化生产的必要条件是获得能大量表达木聚糖酶的微生物菌株，只有采用分子生物手段构建基因工程菌才能使耐热木聚糖酶的生产成为现实。蛋白质分子改良是改造酶基因的有效手段，将不同来源的序列进行融合重组，所得到的杂合木聚糖酶有可能集中其亲本的优良特性。黑曲霉木聚糖酶A {Aspergillusniger xylanase A, AnxA)为G/11家族真核生物来源的木聚糖酶，比活较高,但热稳定性较差。褐色高温单孢菌木聚糖酶A (7 fusca xylanase A, TfxA)为原核生物来源木聚糖酶，是目前G/11家族中热稳定性最好的木聚糖酶之一，但酶比活较低。序列分析表明，TfxA等多数G/11家族木聚糖酶的催化结构域氨基酸总体同源性较高，但N-末端氨基酸序列同源性很低且在二级结构单元存在较大差异，这表明TfxA的N-末端结构可能与其较高的热稳定性相关。目前，已见原核生物来源木聚糖酶与TfxA杂合提高其热稳定性的研究，但有关真核生物来源木聚糖酶与TfxA杂合，以提高其热稳定性和催化活性的研究报道甚少。本研究采用“半理性”设计杂合AnxA和TfxA的N段36个氨基酸序列，获得酶活性和稳定性提高的杂合木聚糖酶基因atx,之后采用“非理性”设计得到催化活性进一步提高的突变体基因FSI-A124,并构建了能高效表达突变体基因的重组毕赤酵母工程菌。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效降解半纤维素的杂合木聚糖酶基因
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的一种高效降解半纤维素的杂合木聚糖酶基因匆，该基因通过两个异源木聚糖酶基因a/沒(GenBank: FJ772090)和 /χ(GenBank: U01242)基因经N-端交叉重组得到的杂合基因aix, aix再经蛋白质体外定向进化改造而来;/^/17匆的基因序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 8所
/Jn ο本发明的有益效果是，本发明的杂合木聚糖酶FSI-A124获得了高活性木聚糖酶Anx高的A和高热稳定性木聚糖酶TfxA的双重优良特性，即具有高活性的同时也具有较稳定性。其最适温度为55°C，最适pH为6. 0，在70°C以下较为稳定，其残余活性均大于60%，可进行工业化加工及生产。
图I是水解产物木寡糖(X-X5)的保留时间示意图；图2是水解产物木寡糖(X-X5)的含量图。
具体实施例方式以下结合具体实施例，进一步阐述本发明的操作方法。但是这些实施例仅限于详细说明本发明，而不用于限制本发明的范围。实施例I. 基因的分子设计(半理性设计)
以TfxA的N-末端的43个氨基酸残基取代AnxA中对应区域的36个氨基酸残基构建出杂合木聚糖酶基因为了便于的表达，在其5’和3’端分别引入及和AfoiI限制性内切酶识别位点。引物序列如SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 4 所示
EcoRl
Pl (SEQ ID NO. I) :5’ - CG^AATTCGCTGTTACATCCAACGAGACCG-3，
P2 (SEQ ID NO.2) :5’-TCCAGTATTACGCCAAGAGGTGCTGTAGTTTCC-3’
P3 (SEQ ID NO. 3) :5’-ACCTCTTGGCGTAATACTGGAGATTTTGTCGTTGGTCTG-3’
Notl ；
P4 (SEQ ID N0.4) :5’ _AG(TGGCCGCAGAGGAAATCGTGACACTG-3，。以pBS-Τ/ Λ为模板，Pl和P2为引物扩增A片段，得到约100 bp的条带，A片段的理论长度为136 bp ;以pBS-T/a/^r模板，P3和P4为引物扩增B片段，得到约500 bp的条带，B片段的理论长度为474 bp。再以A和B为模板，Pl和P4为引物，PCR扩增得到杂合木聚糖酶基因得到约600 bp的条带，的理论长度为573 bp。杂合木聚糖酶基因atx的PCR产物经电泳分离，并割胶回收目的条带。对扩增得到的eitx进行核苷酸测序分析,aiz全长573 bp ο实施例2. 基因的分子改良(非理性设计)
采用定向进化技术，对a 基因进行分子改良，获得优势突变体FSI-A124。在易错PCR(error-prone PCR)技术的基础上,通过降低退火温度来进一步增加错配率，回收目的产物，与表达载体相连接，之后转化万.coli BL21 (DE3)获得突变体库。通过IPTG诱导宿主菌表达木聚糖酶，在96微孔板上筛选活性改良的突变体，并对突变体进行分析。具体实施如下
(I)易错PCR构建突变库
利用DE-atxF和DE-atxR引物，扩增pBST/aix模板。引物序列如SEQ ID NO. 5-SEQ IDNO. 6所示
DE-atxF (SEQ ID NO.5) :5’ -CGAATTCGCTGTTACATCCAACGAGACCG-3’ DE-atxR (SEQ ID NO.6) :5’ -AGCGGCCGCAGAGGAAATCGTGACACTG-3，
进而采用以下经优化的最佳突变组合引入突变
(UlH2O23 μ
IO Pi R Bmfei (with 15 mM Ms2+)5 ill
MgCl2 (55 inM)5 ill
_S_—……、___E_
MiiCl2 (I mM)23 ill
(INTPflO inM eacli)I ill
dCTP(10 ηΛ·Ι)4 pi
ClTTPiio inBI)4 ill
DE-jitxF(iO iiM)2 ill
_VWW^VW、_ _^__·■_
DE-atxRflO iiM)2 ill
、kJf
pBST/rtii*0.5 ill
Tail DNA PolMiiei iiNei5 TJ ill)I ill
vWVW^ *、* ^*
共计__50 μ
置于 PCR Mastercycler (Eppendorf)中，94°C预变性 4 min, 94°C 50 s, 68°C 50 s(-0. TC per cycle), 72°C 50 s，共35个循环，之后72°C继续延伸10 min，即为降落式易错PCR (EPTD-PCR)0 PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶分离20 min (120 V, 40 mA)，割胶回收600 bp左右的条带，经&01 1和况^1双酶切，再与同样双酶切的pET30a(+)载体连接，并转化到疋coli BL21 (DE3)感受态细胞得到突变库。(2)优势突变体的筛选
经转化的疋coli BL21 (DE3)涂于含有抗生素的LB平板(O. 5%酵母膏，1%蛋白胨，1% NaCl, I. 8% 琼脂，100 μδ/πι1 kanamycin)上，在 37 °C下培养 12-16 h 后，挑取阳性转化子至 I ml 含 Kana (100 μδ/πι1) LB 培养基中，在 37°C下培养至 OD6tltl=O. 5-1. O (约 8-10h)，加入 200 μδ/πι1 IPTG 诱导 16 h 后，12000 rpm 离心 5 min 收集细胞，用 O. 5 mL PBS 缓冲液(137 mM NaCl, 2. 7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7. 4)重悬细胞。在 96微孔板中分别加入上述150 μ 悬浮液与50 μ PopCulture ，混合均匀，在室温(25°C )下缓慢震荡30 min, 3000 Xg离心10 min，取上清液测定木聚糖酶活性。在另一 96微孔板中分别加入上述粗酶液50 μ 和50 μ 1%桦木木聚糖底物，在55°C下(气浴)反应30 min后，立即加入100 μ DNS，在100°C (气浴)下显色，10 min后取出，冷却至室温，测定OD54tl的吸光值，计算野生酶与突变体的活性。挑取活性高于野生酶的突变体,送至上海英骏公司测序。本设计中共利用96孔板共筛选了 671个转化子，其中5个转化子的活性高于野生酶。然而，经扩大体积培养表达木聚糖酶，其中仅FSI-A124的活性仍高于野生酶，由此筛选得到优势突变体/^/17匆，测得获得的FSI-A124的基因序列和氨基酸序列分别如SEQ IDNO. 7 和 SEQ ID NO. 8 所示。实施例3:
将1%的桦木木聚糖酶与I. 5 U的FSI-A124混合，在40°C、250 rpm下反应24 h，分别在6 h、12 h、18 h 和 24 h 时间点取样。利用 Waters Sugar-pak I 色谱柱(300 mm X 6. 5mm)和Waters Alliance 2695高效液相色谱仪对水解产物进行分离,利用Waters 2414示差折光检测器分析产物含量。高效液相色谱分析条件是流动相 为纯水，柱温为70°C，流速为0.5 ml/min。木糖(X)至木五糖(X5)保留时间分别为13. 666 minUl. 620 min,9. 924min、8. 760 min、和7. 790 min。以峰面积为横坐标(x)、糖浓度为纵坐标(y),根据标准曲线方程计算各糖组分浓度。水解产物中木寡糖的种类包括木糖至木五糖，其中，木三糖的含量最高。水解24 h后,木二糖和木三糖的浓度分别为O. 620 mg/ml和I.240 mg/ml,分别占总水解产物的22. 6%和45. 6%。提示FSI-A124能有效水解木聚糖，产生低聚木寡糖。实施例4:
米用Nanoscope III MultiMode原子力显微镜(atomic force microscope, AFM)分析木聚糖水解后的表面形态差异。取未经处理和水解24 h后的桦木木聚糖样品，稀释10倍。将样品点于云母片上，烤干15 min。样品在室温(约25°C)、湿度35%下进行AFM分析，选择轻敲模式，视野范围10 Um XlO μ m。结果表明，未经水解处理的桦木木聚糖结构致密，表面粗糙不平，平均粗糙度峰值为261. 9 nm。多糖分子间粘连程度高，经木聚糖酶FSI-A124处理24 h后,峰值下降至133. 3 nm。AFM分析提示,木聚糖酶能破坏木聚糖的分子粘连,成为排列较为均匀的寡糖分子。
权利要求
1.一种高效降解半纤维素的杂合木聚糖酶基因/^/17於，其特征在于，该基因通过两个异源木聚糖酶基因anx和tfx基因经N-端交叉重组得到的杂合基因atx，atx再经蛋白质体外定向进化改造而来；所述匆具有如SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 8所示基因序列和氨基酸序列。
全文摘要
本发明公开了一种高效降解半纤维素的杂合木聚糖酶基因FSI-A124，该基因通过两个异源木聚糖酶基因anx和tfx基因经N-端交叉重组得到的杂合基因atx，atx再经蛋白质体外定向进化改造而来；所述FSI-A124具有如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示基因序列和氨基酸序列；具有较好的稳定性及较高的催化活性，在动物生理温度30-40℃下具有较好的水解性能，能够满足工业化生产酶制剂的需要。
文档编号C12N15/56GK102676558SQ20121014785
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月14日 优先权日2012年5月14日
发明者夏伟, 王谦, 王贤勇, 钱利纯 申请人:浙江大学