专利名称：利用人工microRNA提高水稻抗黑条矮缩病的方法及其专用双链RNA的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种提高水稻抗黑条矮缩病的方法及其专用双链RNA，尤其涉及利用人工microRNA技术及其双链专用RNA，属于生物技术领域。
背景技术：
水稻是我国的第一大粮食作物，水稻的生产对于保障我国粮食安全具有重要的战略意义。虽然我国经过长期努力，利用传统育种技术在提高水稻的产量和品质方面取得了巨大的进步，但是水稻的病虫害仍未得到有效的控制。特别是近年来水稻黑条矮缩病毒的发生对我国的水稻生产造成了巨大的损失。水稻黑条矮缩病是由水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarfviral diease, RBSDV)引起的，RBSDV病毒属于呼肠孤病毒科斐济病毒属，是一种主要由灰飞風传播的病毒病，其危害性大。除危害水稻外，该病毒还危害大小麦、玉米、闻粱及马唐、稗草等禾本科作物和杂草(章松柏等，2010)。水稻黑条矮缩病作为一种病毒病，现在没有有效药物治疗，而且水稻以及其它作物中缺少对黑条矮缩病毒的抗原，这使得传统育种很难获得抗RBSDV的种质。近年来，水稻黑条矮缩病毒基因组的研究已经取得了丰硕的成果。研究表明RBSDV的基因组由10条双链RNA组成，按其在聚丙烯酰胺上迁移距离由小到大计的顺序依次命名为=Sl-SlO (王朝辉2004，方守国2000，张恒木2001)。RBSDV的基因组大小为29141nt，是目前斐济病毒属中基因组最大的一个。RBSDV的S1-S6均编码病毒的一个主要蛋白，其中SI可能编码RNA依赖的RNA聚合酶；S2长约3813nt，编码一个有1226个氨基酸组成的蛋白，猜测很可能是核心结构蛋白；S3长3752nt，编码一个有1146个氨基酸组成的蛋白，其编码蛋白可能是病毒粒子的结构蛋白；S4、S5长3617nt、3163nt，功能未知；S6长2645nt，虽然功能未知但利用计算机软件对其二级结构的预测和数据库比较分析表明，其编码蛋白存在高度保守的亲水性结构域及多个跨膜区域，可能具有结合RNA及ATPase活性，这些结果表明，RBSDV的S6基因可能具有编码植物基因沉默抑制子的功能；S7全长大约为2193nt，含有两个开发阅读框(0RF)，分别编码约为41Ku和36Ku的蛋白质ORFl和0RF2，目前已经正式ORFl和0RF2均为病毒的非结构蛋白；S8全序列约为1936bp，只含有I个0RF，编码蛋白的分子量约为68Ku，可能是病毒的核心衣壳蛋白；S9全长1900bp，含有2个0RF，其中0RF2保守性极高，编码一种24. 2Ku的非结构蛋白。SlO全长1819nt，编码病毒63ku的外壳蛋白。截止到2010年6月29日在NCBI注册的RBSDV序列总计有60条，其中20条是从中国水稻、玉米产区分类得到的。RBSDV基因组序列测序及其功能研究的深入，为利用植物基因工程提高水稻抗矮缩病的能力，培养抗病新种质奠定了基础。相比传统杂交育种，利用基因工程技术手段培育抗病品种是彻底解决水稻黑条矮缩病毒的根本途径，而且与药剂防治相比，它既不用增加生产投资，也没有农药残留污染环境，对防治发生范围广、流行速度快的病害更为有效。
人工microRNA (Artif ical microRNA, amiRNA)技术是利用内源 microRNA 前体骨架，通过替换microRNA序列产生具有新功能的microRNA。最近人工microRNA在抗病育种的潜力逐渐被人们认识，Schwab等利用拟南芥pre-miRNA172和pre_miRNA319做骨架,将miRNA/miRNA*区替换成与目标mRNA互补的片段,形成了 artifical microRNA,在拟南芥中超表达后引起表型的明显改变(Schwab 2006)，证明amiRNA可以有效沉默单个和多个靶基因，并且在诱导性启动子或组织特异性启动子驱动下均可以特异性地发挥作用；Warthmann等利用水稻osa_MIR528作骨架构建了人工microRNA，成功对水稻靶基因高效干涉(Warthmann)。2006年Niu等通过修饰拟南芥miR159的前体获得了能够分别镖IE P69和 HC-Pro 的人造 microRNAs amiR-P69159 和 amiR-HC-Pro159，发现表达 amiR_P69159 和amiR-HC-Pro159的转基因拟南芥能够分别特异抵抗TYMV和TuMV病毒感染(Niu，2006)。2007年Qu等设计了镖靶黄瓜花叶病毒(CMV)的沉默抑制子2b的microRNA并在烟草中表达，获得抗病毒的烟草植株，并且发现烟草的抗性水平和microRNA的表达水平成正相关(Qu，2007)。 相比PTGS (RNAi)介导的基因沉默，人工microRNA在培养抗病毒植物上具有其独特的应用优势=(I)RNAi介导的基因沉默依赖DCL4途径，而病毒编码的抑制蛋白(基因沉默抑制子)可以抑制这种沉默，能够抑制RNAi机制的发生。AmiRNA通过DCLl途径，可以避开一些病毒抑制蛋白的拮抗作用；(2) RNAi介导的基因沉默在植物中转录长片段病毒基因组，这些病毒基因组序列可能与植物基因组重组，存在一些生物安全方面的隐患，而amiRNA只引入21个碱基的外源序列，降低了此类风险的发生；(3)田间病毒多是混合侵染，并不是一个纯的株系，而且病毒株系多、变异快，RNAi等方法只能有效抵御部分株系，无法培育一种持久广谱的抗病毒品种，amiRNA可以允许错配的存在，因而科研针对病毒保守区设计amiRNA，使之有效抑制大多数病毒株系，并且当病毒发生突变后仍然能够保持抗病毒能力，从而延长品种的寿命；(4) RNAi介导的基因沉默会产生一系列序列信息不明确的siRNAs,往往造成意外“脱靶”现象和非目标基因的沉默等现象，amiRNA只产生I条microRNA成熟体(mature microRNA)，和靶基因的结合更加精确、高效、可控；(5)低温能够抑制RNAi介导基因沉默的机制，在低温(<15°C)条件下，RNAi转基因种质抗病毒能力明显下降，容易受到病毒的侵染。而研究表明人工microRNA介导的基因沉默在15°C和24°C下没有区别，在低温环境下人工microRNA将更加稳定、高效。然而在可检索的现有技术中，利用人工microRNA技术提高水稻抗黑条矮缩病毒的方法还未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明需要解决的是问题是提供一种利用人工microRNA提高水稻抗黑条矮缩病的方法，并且提供改造microRNA的专用双链RNA序列。本发明的技术方案是一种利用人工microRNA提高水稻抗黑条矮缩病的专用双链RNA,其特征是，它是由sequenceA和sequenceB组成的双链RNA ;所述sequenceA如SEQNO. 1-22所述；所述sequenceB的核苷酸序列是与sequenceA反向互补，或者与sequenceA小于4个碱基错配的反向互补序列。本发明还提供了一种利用人工microRNA提高水稻抗黑条矮缩病的方法，其特征是，以水稻内源的microRNA作为骨架结构，如osa-MIR528，osa_MIR319，osa_MIR159，osa_MIR171等；分别用sequenceA和sequenceB替换水稻内源microRNA的成熟体序列(mature sequence)及其成熟体的反向互补序列(mature*sequence);同时在microRNA的5’和3’分别设计酶切位点和保护碱基，通过人工合成获得人工microRNA载体；然后将合成的人工microRNA载体通过酶切连接,转化到到带有强启动子(CaMV 35S或者ubiqutin)的植物表达载体中，再将该植物表达载体导入水稻中(可以采用农杆菌侵染的方法)，得到抗水稻黑条矮缩病的转基因水稻。所述阳性转基因苗的分子检测方法是根据水稻内源的microRNA的前体序列在5’端设计引物primerl,在其3’端设计引物primer2 ;提取转基因苗的总RNA,以转录后的 cDNA 为模板，分别以(sequenceA, sequenceB)、(sequenceA, primer2)、(primerl,sequenceB) 3对引物进行PCR检测。水稻黑条矮缩病毒是造成我国水稻大面积减产甚至绝收的主要病害之一，由于水 稻黑条矮缩病毒主要靠灰飞虱传播，从苗期到成株期均可发病，且感病期越早，发病越重，所以通过喷施农药或者栽培措施优化等方法很难防止水稻黑条矮缩的发生和危害，所以说提高水稻自身的抗病能力是解决黑条矮缩病危害的根本途径，由于水稻中缺少对该病毒的天然抗原，所以通过传统育种很难得到抗黑条矮缩病的品种。通过基因工程手段提高水稻的抗病能力将是彻底解决水稻黑条矮缩病的有效途径。本发明以水稻为受体植物，涉及了能够干扰水稻黑条矮缩病毒的人工microRNA载体，通过导入水稻，成功实现利用人工microRNA提高水稻对黑条矮缩病的抗性，具有广阔的应用前景。本发明的优点(I)相比传统杂交育种，利用人工microRNA技术手段培育抗病品种是彻底解决水稻黑条矮缩病的根本途径，而且与药剂防治相比，它既不用增加生产投资，也没有农药残留污染环境，对防治发生范围广、流行速度快的病害更为有效。(2)相比PTGS (RNAi)介导的基因沉默，人工microRNA技术只引入21个碱基的外源序列，不容易造成“脱靶”现象和非目标基因的沉默等现象，生物安全性更高。(3)本发明中人工microRNA载体的构建采用水稻内源的microRNA前体作为骨架，和传统的通过引入外源基因改良作物品质有很大不同，一定程度上可以减少引入外源基因造成的不确定表型，另外也可以减少转基因引起的争议。(4)本发明可以用(sequenceA, sequenceB)、(sequenceA, primer2)> (primerl,sequenceB) 3对引物对转基因水稻进行PCR快速检测。
图I :标靶RBSDV人工microRNA载体构建 2 Art-528-S6-l 酶切图，Marker DNA 分子量标准
具体实施例方式以下结合实施例对本发明做进一步说明，但不限于此。实施例I :改造microRNA的专用双链RNA序列的获得
根据水稻黑条矮缩病毒基因组S6片段(基因登录号AJ409148)设计正向引物 primer3 :5’-AAGimTTGAGTCTGAGATA-3’ (SEQ NO. 27)和反向引物 primer4 :5’ -GACATCAGCTGATTTGAGTC-3’ (SEQ NO. 28);提取水稻黑条矮缩病发病病叶的总RNA，通过RT-PCR方法克隆到水稻黑条矮缩病毒基因组S6片段序列，将该序列提交到在线软件WMD3(http://wmd3. weigelworld. org/cgi-bin/webapp. cgi page=Home;project=stdwmd),根据双链RNA的能量值，通过和水稻全基因组及mRNA序列的比对，双链RNA的能量值，改造后microRNA的二级结构确定专用的RNA序列。水稻黑条矮缩病发病病叶总RNA的提取和纯化方法如下I.称取0.2g新鲜组织，在液氮中充分研磨至粉末状，研磨中不断缓慢加入液氮，防止材料解冻。2.将研好的组织迅速转移至预热(65°C)的装有600微升CTAB提取液(2%CTAB，2%PVP，0. IM Tris-Cl，2. OMNaCl，25mM EDTA)的EP管中，立即剧烈涡旋振荡30s，使其混匀。
3. 65 0C水浴2_5min，期间剧烈涡旋振荡3-5次。4.稍微冷却后加入等体积的氯仿/异戊醇(氯仿异戊醇=24 1 (V/V)，下同)，涡旋振荡 Imin,混勻,4°C, 12，OOOrpm 离心 15min。5.将上清转移到另一新的EP管中，加入2微升的DNase I，37°C水浴15min。6.再加入等体积的氯仿/异戍醇润旋振荡lmin,混勻,4°C, 12000rpm离心15min。7.将上清转移到另一新的EP管中，加入1/3体积的8M LiCl，使其终浓度为2M，4 °C过夜沉淀。8. 40C，12000rpm离心20min，弃上清，分别用70%乙醇，无水乙醇洗沉淀，晾干，力口30-50微升DEPC-H2O溶解沉淀。9.在微量离心管中加入全部 RNA,DNaseI Buffer 5ul,DnaseIC5U/ul)5ul, RnaseInhibitor (40u/ul)0. 5ul，最后加入DEPC H2O使总体积达到50ul，37°C反应I个小时。10.加入 50ul DEPC H2O,混匀。11.加入等量(IOOul)的苯酚/氯仿/已戊醇(25:24:1),充分混匀。12.离心，取上层水相到新离心管中。13.加入等量(IOOul)的氯仿/已戊醇(24:1)，充分混匀。14.新取上清(水相)到新的离心管。15.加入 1/10 体积(IOul)的 3M NaOAC (pH 5. 2) 。16.加入2. 5倍(250ul)的冷无水乙醇，_20°C过夜(或者一个小时以上)。17.离心回收沉淀，用70%的乙醇清洗，干燥。20.加入20ul DEPC H2O溶解后，电泳检测。cDNA的获得参照Takara公司的反转录试剂盒说明的方法，在500ul离心管中加入oligo dT primer lul, dNTP lul，总 RNA2ul，DEPC H20 6ul，混匀后，在 PCR 仪上 65°C温育5min后迅速在冰上冷却，然后再加入5XPrimeScript II Buffer 4. Oul,Rnase Inhibitor0. 5ul,PrimeScript II Rtase I. Oul，最后加入 DEPC H2O，补足 20ul，混匀后在 PCR 仪上进行，42°C，60min ；70°C , 15min 后，冰上冷却。用稀释5倍的cDNA做模板，以primer3, primer4进行PCR反应，PCR反应程序为940C 5min ;再 94°C 50s, 54°C 45s, 72°C 3min, 30 循环；72°C 7min ;扩增产物连接到 T 载体上进行测序，测序后得到如SEQ NO. 29-30所述的水稻黑条矮缩病毒基因组S6片段。将测序后的S6片段序列提交到在线软件WMD3，根据双链RNA的能量值，通过和水稻全基因组及mRNA序列的比对，双链RNA的能量值，改造后microRNA的二级结构确定专用的RNA序列，如SEQNO. 1-22。实施例2 :人工microRNA载体的设计和合成以水稻内源的microRNA 作为骨架结构，如 osa_MIR528，osa_MIR319，osa_MIR159，osa_MIR171等。分别用sequenceA和sequenceB替换水稻内源miccroRNA的成熟体序列(mature sequence)及其成熟体的反向互补序列(mature*sequence)。其中sequenceA和sequenceB分别为专用双链RNA序列中的序列和其反向互补序列(mismatch〈3);同时在microRNA的5’和3’分别设计酶切位点和保护碱基；通过人工合成获得人工microRNA载体。
下面将以人工microRNA载体Art-528_S6_1的设计和合成为例详细说明以microRNA数据库中的水稻osa_MIR528 (登录号MI0003201)为骨架结构，用 sequenceA :TAGCTAGTTGTTAATACGCAG (SEQ NO. I)和 sequenceB (SEQ NO. 23)CTGCGAATTTACAACTAGCTA 分别替换 osa_MIR528 的成熟体序列(mature sequence)和星号序列(mature*sequence)，在水稻 osa_MIR528 前体的 5’ 和 3’ 分别引入 Xba I (TGCTCTAGA)和Bam HI (GGATCCCG)酶切位点及保护碱基(下划线序列为酶切位点)，通过人工合成获得了人工 microRNA :Art-528-S6_l，其具体序列如 SEQ NO. 24 所述。实施例3 :植物表达载体的构建大肠杆菌DH5CI感受态细胞的制备和转化的过程用无菌接种环挑取_70°C甘油保存的E. coli DH5 a，通过划线稀释的方法经37°C培养16_20h后在平板中得到DH5 a的单菌落；挑一单菌落于5ml的LB液体培养基，180rpm振荡培养12h ;取Iml DH5 a LB菌液于IOOml的LB液体培养基，180rpm振荡培养到OD值0. 4 ;冰上放置15分钟，无菌条件下倒入50mlBeckman离心管中，4°C, 3500rpm离心IOmin,弃上清；沉淀用30ml冰预冷的0. IM CaCl2溶液重悬；4°C, 3500rpm离心IOmin,小心倒出上清液；沉淀重悬于2ml冰预冷的含15%甘油0. IM CaCl2溶液；将这些感受态细胞按每份100 U I分装。制备农杆菌C58C1的感受态细胞挑取农杆菌EHA105单菌落到5ml LB培养基(含利福平50iig/ml)摇菌过夜；然后取Iml接种到50ml液体LB培养基中(含利福平50ii g/ml)，28°C 扩大培养，220rpm 震荡培养至 0D600=0. 5 ;冰浴 IOmin, 4°C 4500rpm，离心IOmin ;菌体用IOml预冷的0. IM CaC12重悬，4°C 4500rpm再次离心IOmin ;沉淀加入Iml20mMCaC12悬浮液(60%甘油，0. IM CaC12)，再加入10%的甘油，80 分装，液氮速冻保存。将人工microRNA(Art-528-S6-l)从中间载体用Bam HI和Xba I双酶切，酶切体系为质粒5. Oul,Buffer K I. 5ul,Bam HI I. 0ul,Xba I I. Oul，混匀，37°C酶切过夜，酶切后电泳回收基因片段(图2)，同时对植物表达载体PBI121也进行双酶切，体系同上，电泳后回收载体大片段。在200uL离心管中加入Art-528-S6-l回收产物5ul，pBI121回收产物3ul，Bufferlul，T4DNA连接酶Iul，混匀，16°C连接过夜。将连接产物加入到大肠杆菌(DH5a)感受态细胞中，稍稍混匀，冰上静置0. 5h，42°C热激90S，加入600ul的LB溶液，37°C摇菌复苏lh，取IOOul均匀涂到含有抗生素的LB固体平板上，37°C培养过夜。挑取单克隆，分别上述3 对引物[(sequenceA, sequenceB)、(sequenceA,如 SEQ NO. 26 所述的 primer2)、(如 SEQNO. 25 所述的 primerl, sequenceB)]进行 PCR 验证，PCR 程序为94°C 5min ;再 94°C 50s,54°C 45s，72°C 40s, 30循环；72°C lmin,提取PCR阳性菌落的质粒DNA进行酶切验证，酶切体系同上。得到重组质粒pBI121-Art-528-S6-l。重组质粒转化农杆菌取上述测序验证正确的质粒2 U I加入到80 U I农杆菌感受态细胞中，混匀，放到冰上45min，37°C水浴3min，28°C 120rpm振荡培养I. 5h，5000rpm离心lmin，将菌体均匀涂抹到固体LB培养基上(含利福平50 u g/ml，卡那霉素50 u g/ml)，28°C培养2d。挑取单菌落到4ml液体LB中，28°C摇菌过夜。凝胶电泳回收并纯化目的片段过程紫外灯下检测，切下预期大小的基因片段放A I. 5mL离心管中，加入溶胶液300-700ul，55°C保温溶解，期间不断摇动。将含有目的基因的溶解液过柱，经过70%酒精清洗，用20ul双蒸水洗脱。实施例4 :转化水稻成熟胚愈伤组织的诱导挑选饱满无虫害的日本晴水稻种子，去稃片后进行种子 消毒处理，程序为先用75%酒精充分浸泡30s，用灭菌水冲洗；用50%次氯酸钠充分摇匀20分钟,用无菌水冲洗；用50%次氯酸钠灭菌15min,无菌水冲洗5_6次,用无菌滤纸吸干水分，将种子播种到MS培养基上，26°C暗培养10-15天后，剥下成熟胚盾片上长出的愈伤组织，将愈伤组织转入MS培养基上继代培养，以后每两周继代培养一次，挑选继代培养5-7天的愈伤组织进行转化。农杆菌的培养将含有表达载体的农杆菌涂于LB培养基(含利福平50 ii g/ml,卡那霉素50 y g/ml)平板上，28°C培养2天，挑取单菌落于5mL液体LB培养基(含利福平50 u g/ml，卡那霉素50 u g/ml)中培养一天，吸取ImL到IOOmL液体LB培养基中(含利福平50 u g/ml，卡那霉素50 u g/ml)，扩大培养至0D600值0. 6左右后待用。农杆菌侵染水稻愈伤组织的共培养挑取状态较好的愈伤组织(色泽淡黄)放入IOOmL无菌三角瓶中，加入适量的农杆菌悬浮液，室温放置20min，并不时晃动。倒掉菌液，用无菌滤纸吸取愈伤组织上多余的菌液，然后将愈伤组织转移到铺有一层无菌滤纸的固体共培养基上，26 °C黑暗培养2-3d。抗性愈伤筛选从共培养基上挑出状态较好的愈伤组织，用无菌水清洗数次，再用带有头孢霉素(500mg/L)的无菌水清洗2-3次后，将愈伤转移到选择培养基上，28°C黑暗培养15d。大约15d后，在选择培养基上进行继代培养。抗性愈伤分化将经过2次选择培养基继代培养的抗性愈伤组织转移到预分化培养基上，28°C黑暗培养；大约7d后，将预分化的抗性愈伤转移到分化培养基上，28°C黑暗培养2d，然后转移到光照培养；大约14d后挑取分化培养基上出现绿点的抗性愈伤组织进一步分化继代培养，28°C光照培养14d。生根壮苗及温室移栽分化完成后，将愈伤组织上出现的幼苗移栽到生根壮苗培养基上，1光照培养；大约14d后将壮苗移栽入温室中进行培养。培养基愈伤组织诱导MS+4.Omg/L 2，4-D+2. 8mg/L 脯氨酸 +0. 3g/L 水解酪蛋白 +5. 6g/L琼脂粉，pH=5.8。 共培养培养基N6+2.0mg/L2, 4-D+100uM/L 乙酰丁香酮，pH=5. 2。.选择培养基N6+2.Omg/L 2，4-D+O. 5mg/L KT+0. 5mg/L NAA+50mg/L Kan+300mg/L羧节青霉素，pH=5. 8。预分化培养基N6大量 +MS 微量 +33. 6g/L 甘露醇 +0. 5mg/L 6-BA+O. 5mg/LNAA+0. 5mg/L KT+1. Omg/L 2，4_D+50mg/L Kan+300mg/L 羧苄青霉素，pH=5. 8。分化培养基MS+2.Omg/L 6-BA+O. 5mg/L KT+50mg/L Kan+300mg/L 羧苄青霉素，pH=5. 8o生根壮苗培养基MS+0.033mg/LNAA+5. 8g/L 琼脂粉，pH=5. 8。实施例5 :转基因苗的分子检测和抗性鉴定转基因苗的分子检测和是根据水稻内源的HiiCT0RNA的前体序列在5’端设计引物primerl,在其3’端设计引物primer2。如根据水稻osa_MIR528设计primerl:CAGCAGCAGCCACAGCAA (SEQ NO. 25),primer2 TACCGCTGCTGATGCTGA (SEQ NO. 26)；提取转基因苗的总RNA (方法同实施例1)，以转录后的cDNA为模板，分别以(sequenceA, sequenceB)、(sequenceA, primer2)、(primerl, sequenceB) 3 对弓I物进行 PCR检测，PCR程序同实施例I ;通过人工接种方法对PCR检测为阳性的TO代转化苗(特特普、华粳6号、淮稻5号及籼稻品种R084共四个品种，每个品种转基因水稻幼苗各50株，对照组非转基因水稻幼苗各50株)进行人工接种鉴定，从水稻黑条矮缩病重病区采集发病植株，将灰飞虱在毒源上饲喂获毒，移入带有水稻幼苗的烧杯中饲养(循回时间12-17d，有效接种强度10-20头/株，接种时间48-72h和水稻接种龄期2叶龄)，渡过循环期，检测完单头灰飞虱携带病原菌情况后，对转基因水稻幼苗和非转基因水稻幼苗进行人工接种检测。结果表明，转基因株系的发病率(四个品种转基因植株发病率均< 20%)显著低于对照组(四个品种非转基因植株发病率均彡70%)，且转基因水稻植株较对照组抗病性明显增强。主要参考文献章松柏，李大勇，肖冬来，张长青，吴祖建，谢联辉.水稻黑条矮缩病的发生和病毒检测 湖北农业科学，2010，49 (3) : 592-594.
Qu J, Ye J, Fang R (2007) Artificial microRNA-mediated virus resistancein plants. Journal of virology 81:1212, 6690-6699王朝辉.水稻黑条矮缩病毒玉米分离物的分子特性.学位论文.2004方守国，于嘉林，冯继东等.我国玉米粗缩病株上发现的水稻黑条矮缩病毒.农业生物技术学报，2000, 8 (I) : 121-125张恒木，雷娟利，陈剑平等.浙江和河北发生的一种水稻、小麦、玉米矮缩病是水稻黑条矮缩病毒引起的.中国病毒学，2001, 16(3) : 246-251。
权利要求
1.一种利用人工micix)RNA提高水稻抗黑条矮缩病的专用双链RNA，其特征是，它是由sequenceA和sequenceB组成的双链RNA ;所述sequenceA如SEQ NO. 1-22所述；所述sequenceB的核苷酸序列是与sequenceA反向互补,或者与sequenceA小于4个碱基错配的反向互补序列。
2.一种利用人工micix)RNA提高水稻抗黑条矮缩病的方法，其特征是，以水稻内源的microRNA作为骨架结构；分别用权利要求I所述的sequenceA和sequenceB替换水稻内源microRNA的成熟体序列及其成熟体的反向互补序列；同时在microRNA的5’和3’分别设计酶切位点和保护碱基，通过人工合成获得人工microRNA载体；然后将合成的人工microRNA载体通过酶切连接，转化到到带有强启动子的植物表达载体中，再将该植物表达载体导入水稻中，得到抗水稻黑条矮缩病的转基因水稻。
3.如权利要求2所述的一种利用人工microRNA提高水稻抗黑条矮缩病的方法，其特征是，所述水稻内源的 microRNA 为 osa_MIR528、osa_MIR319、osa_MIR159 或者 osa_MIR171。
4.如权利要求3所述的一种利用人工microRNA提高水稻抗黑条矮缩病的方法，其特征是，所述水稻内源的microRNA为osa_MIR528。
全文摘要
本发明公开了一种利用人工microRNA提高水稻抗黑条矮缩病的方法及其专用双链RNA。所述双链RNA是由sequenceA和sequenceB组成。本发明分别用sequenceA和sequenceB替换水稻内源microRNA的成熟体序列及其成熟体的反向互补序列；同时在microRNA的5’和3’分别设计酶切位点和保护碱基，通过人工合成获得人工microRNA载体；然后将载体通过酶切连接，转化到到带有强启动子的植物表达载体中，再将该植物表达载体导入水稻中，得到抗水稻黑条矮缩病的转基因水稻。本发明通过人工microRNA技术提高水稻的抗病能力，不容易脱靶，安全性高，而且抗病性状可以稳定遗传。
文档编号C12N15/11GK102676510SQ20121014757
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月14日 优先权日2012年5月14日
发明者夏晗, 李爱芹, 李长生, 杨连群, 王兴军, 赵传志 申请人:山东省农业科学院高新技术研究中心