专利名称：：一种修饰性谷胱甘肽过氧化物酶及其制备方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，涉及一种修饰性谷胱甘肽过氧化物酶及其制备方法。
背景技术：
：谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase,EC1.11.1.9，简称GPx)是生物机体组织中存在的三种重要的抗氧化酶之一，也是一种重要的含硒酶，硒是该酶活性中心的构成成分。它可以消除机体内的过氧化氢及脂质过氧化物，阻断活性氧自由基对机体的进一步损伤，是生物体内重要的活性氧自由基清除剂，它以硒代半胱氨酸(Sec)的形式发挥作用，以谷胱甘肽(GSH)为还原剂分解体内的脂质过氧化物，因而可防止细胞膜和其它生物组织免受过氧化作用的损伤；它与体内的超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)一起构成了机体的抗氧化防御体系。医学研究表明它与人类许多疾病有关，对肿瘤、心血管疾病、老年性疾病、不孕症等多种疾病有着良好的预防和治疗作用，是一种有广泛应用和市场前景的医药用酶。但该酶在常温条件下其巯基易氧化而使酶失活、半衰期非常短、稳定性差等特性限制了该酶的以常态形式使用的实用性。对该类酶进行化学修饰以提高其物理、化学和生物学稳定性是成功开发并推出市场的关键性技术。
发明内容本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种酶活性高、稳定性强的修饰性谷胱甘肽过氧化物酶。本发明的另一个目的在于提供制备该修饰性猪谷胱甘肽过氧化物酶的方法。本发明公开了一种修饰性谷胱甘肽过氧化物酶，由谷胱甘肽过氧化物酶的氨基与活化的单甲氧基聚乙二醇连接，其结构式为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中GPX表示谷胱甘肽过氧化酶。本发明同时公开了该修饰性谷胱甘肽过氧化物酶的制备方法，采用活化的单链单甲氧基聚乙二醇作为修饰剂，与谷胱甘肽过氧化物酶反应，将单链单甲氧基聚乙二醇(mPEGD通过游离氯原子与谷胱甘肽过氧化物酶的氨基发生反应，使mPEh与谷胱甘肽过氧化物酶连接。反应式为谷胱甘肽过mPEGi修饰谷胱甘氧化物酶mPEGi肽过氧化物酶本发明同时也公开了该修饰性谷胱甘肽过氧化物酶的制备方法，包括以下步骤采用活化的单链单甲氧基聚二醇作为修饰剂，与谷胱甘肽过氧化物酶在4-37°C、pH7.0-10.0下反应，其中单链单甲氧基聚二醇与谷胱甘肽过氧化物酶的质量比为20-1001。反应15-60min后，加入终止剂GSH结束反应，超滤去除终止剂，获得所述的修饰性谷胱甘肽过氧化物酶。其中，优选的方案为单链单甲氧基聚二醇与谷胱甘肽过氧化物酶的质量比为801；反应条件为温度15°C、pH9.0、时间45min。其中的活化的单链单甲氧基聚二醇，可以通过以下方法获得取5.5g二次重结晶的三聚氰氯(先用无水苯重结晶两次)溶解于400mL含10g无水碳酸钠的无水苯中，加入50gmPEG-5000,室温下搅拌过夜，过滤，取滤液约400mL搅拌下缓慢加入600mL乙醚，沉淀出白色产物后继续搅拌20min，抽滤，沉淀再用400mL无水苯溶解，如此沉淀、溶解重复多次，直到紫外检测无三聚氰氯的吸收峰为止。将活化的mPEh置于真空干燥器中抽干，得到白色粉末，即获得活化mPEGp<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>与现有技术相比，本发明具有以下有益效果(1)本发明首次采用单链单甲氧基聚乙二醇(mPEG》修饰谷胱甘肽过氧化物酶，经过测定残余氨基修饰率(DTNB法)鉴定，其氨基修饰率为44.55%;由于氨基修饰率达40%以上时进入体内就可完全消除异体蛋白的抗原抗体反应，因此本发明的修饰性谷胱甘肽过氧化物酶具有消除酶蛋白抗原抗体反应的优点。(2)本发明所获得的修饰性谷胱甘肽过氧化物酶，酶活力保持率高达104.66%，即修饰酶活力比天然酶的活力更高。(3)酶的pH稳定性与热稳定性提高。与天然酶相比，修饰酶的pH稳定性要宽一些，在pH4.0和pH10.0的条件下放置1.5h，天然酶的相对活力分别为0%和38.83%，而修饰酶的相对活力分别为21.08%和68.79%；热稳定性也比天然酶高一些，在50°C时未修饰GPx的相对活力为0%，而修饰GPx保持了37%的活力。(4)修饰酶的半衰期比天然酶延长了。修饰酶的半衰期为180.77h，天然酶的半衰期为76.28h，修饰酶的半衰期是原酶的2.37倍(5)抗抑制剂的能力提高。天然酶经胰蛋白酶处理150min后活力回收为21.24%，修饰酶为89.27%，处理450min后天然酶完全无活力，修饰活力回收仍然达64.43%。(6)修饰酶的抗衰老能力比天然酶效果好。具体实施例方式以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。实施例11.活化mPEGi的获取取5.5g二次重结晶的三聚氰氯(先用无水苯重结晶两次)溶解于400mL含10g无水碳酸钠的无水苯中，加入50gmPEG-5000,室温下搅拌过夜，过滤，取滤液约400mL搅拌下缓慢加入600mL乙醚，沉淀出白色产物后继续搅拌20min，抽滤，沉淀再用400mL无水苯溶解，如此沉淀、溶解重复多次，直到紫外检测无三聚氰氯的吸收峰为止。将活化的mPEG置于真空干燥器中抽干，得到白色粉末，即获得活化mPEh。2.谷胱甘肽过氧化物酶的修饰在反应温度15°C，pH9.0，反应物配比为1毫克酶加入0.08克修饰剂进行反应，45min后加入GSH作为GPx修饰反应的终止剂结束反应，超滤去除终止剂后获得修饰性谷胱甘肽过氧化物酶。实施例21.活化mPEGi的获取如实施例12.谷胱甘肽过氧化物酶的修饰在反应温度36°C，pH7.0，反应物配比为1毫克酶加入0.04克修饰剂进行反应，30min后加入GSH作为GPx修饰反应的终止剂结束反应，超滤去除终止剂后获得修饰性谷胱甘肽过氧化物酶。实施例31.活化mPEGi的获取如实施例12.谷胱甘肽过氧化物酶的修饰在反应温度5°C，pH10.0，反应物配比为1毫克酶加入0.02克修饰剂进行反应，60min后加入GSH作为GPx修饰反应的终止剂结束反应，超滤去除终止剂后获得修饰性谷胱甘肽过氧化物酶。实施例41.活化mPEGi的获取如实施例12.谷胱甘肽过氧化物酶的修饰在反应温度37°C，pH9，反应物配比为1毫克酶加入0.95克修饰剂进行反应，45min后加入GSH作为GPx修饰反应的终止剂结束反应，超滤去除终止剂后获得修饰性谷胱甘肽过氧化物酶。实施例5修饰性谷胱甘肽过氧化物酶性能的评价对实施例1所制备的修饰性谷胱甘肽过氧化物酶进行评价，其氨基修饰率为44.55%，酶活力保持率为104.66%;修饰酶的最适反应pH值(7.0)和反应温度(37°C)未发生改变；PH稳定性比天然酶宽1个pH值，耐热性比天然酶高5°C;半衰期是天然酶的2.37倍；抗胰蛋白酶的能力大大提高，用胰蛋白酶处理450min后天然酶完全无活力，而修饰酶活力仍为最初时的64.43%。实施例6以致衰老小鼠为模型研究其抗衰老能力，评价修饰酶的抗衰老效果。D-半乳糖致衰老小鼠为模型动物，通过小鼠腹腔注射给药，研究修饰前后GPx对小鼠血清和肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)、GPx和丙二醛(MDA)等生化指标含量。方法如下用D-半乳糖致小鼠衰老，即使小鼠血清和肝脏S0D、GPx活力降低，MDA含量上升。同时用天然酶和修饰酶治疗，其处理分别如表1所示。天然酶60U/mL，比活力60U/mgprotein；修饰酶活力60U/mL，氨基修饰率40%。表1试验动物的分组及处理<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>实验结果不同酶处理对血清和肝脏SOD活力、对血清和肝脏GPx活力、对血清和肝脏MDA活力的影响分别如表2、表3、表4所示。表2不同处理对小鼠血清和肝脏SOD活力的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>上述结果表明，修饰酶抗衰老的效果比天然酶效果好。a权利要求一种修饰性谷胱甘肽过氧化物酶，其特征在于谷胱甘肽过氧化物酶的氨基与活化的单甲氧基聚乙二醇连接，其结构式为其中GPx表示谷胱甘肽过氧化酶。FSA00000130542600011.tif2.一种如权利要求1所述的修饰性谷胱甘肽过氧化物酶的制备方法，其特征在于采用活化的单链单甲氧基聚乙二醇作为修饰剂，与谷胱甘肽过氧化物酶反应，反应式为其中GPx表示谷胱甘肽过氧化酶。3.—种如权利要求2所述的制备方法，其特征在于反应结束时还再加入终止剂谷胱甘肽终止反应。4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的活化的单链单甲氧基聚乙二醇与谷胱甘肽过氧化物酶的质量比为20-1001。5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述的活化的单链单甲氧基聚乙二醇与谷胱甘肽过氧化物酶的质量比为801。6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的反应条件为温度4-37°C、pH7.0-10.0。7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的加入终止剂的时间为反应15_60min后。8.如权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于所述的反应条件为温度15°C、pH9.0；加入终止剂的时间为反应45min后。9.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的终止剂为谷胱甘肽，按谷胱甘肽与单链单甲氧基聚乙二醇的摩尔比为11的添加量加入。10.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的活化的单链单甲氧基聚乙二醇是通过将单链单甲氧基聚乙二醇与三聚氰氯反应，并进一步纯化干燥获得。全文摘要本发明属于生物
技术领域：
，涉及一种修饰性谷胱甘肽过氧化物酶及其制备方法。该修饰性谷胱甘肽过氧化物酶是将单链单甲氧基聚乙二醇(mPEG1)通过游离氯原子与谷胱甘肽过氧化物酶的氨基反应，将mPEG1连接到谷胱甘肽过氧化物酶上。通过采用活化的单链单甲氧基聚乙二醇作为修饰剂，与谷胱甘肽过氧化物酶在4-37℃、pH7.0-10.0反应，其中单链单甲氧基聚乙二醇与谷胱甘肽过氧化物酶的质量比为20-100∶1，反应15-60min后，按修饰剂与终止剂谷胱甘肽(GSH)为1∶1的比例加入GSH终止反应，然后用3万超滤膜超滤去除终止剂，获得所述的修饰性谷胱甘肽过氧化物酶。该修饰性谷胱甘肽过氧化物酶其氨基修饰率控制在40-45％，酶活力保持率超过100％。文档编号C12N9/96GK101831413SQ20101017906公开日2010年9月15日申请日期2010年5月14日优先权日2010年5月14日发明者冯定远,王林川,陈芳艳申请人:华南农业大学