专利名称：H1亚型禽流感病毒rt-lamp可视化检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及Hl亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测试剂盒。
背景技术：
禽流感(Avian Influenza，Al)是禽流行性感冒的简称，是由正粘病毒科流感病毒属A型禽流感流行性感冒病毒引起的一种禽类(家禽和野禽)传染病。根据A型流感病毒表面糖蛋白(Hemagglutinin, HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase, NA)的抗原性不同，禽流感病毒(AIV)可进ー步分为不同的亚型，目前已发现有16种HA亚型和9种NA亚型。AIV是ー种有包膜、单股负链、分节段的RNA病毒，病毒基因组由8个分节段负链RNA组成。AIV基因组的分节段特性使得两种或两种以上不同亚型流感病毒共同感染ー个细胞时，子代病毒在装配时其核酸片段可能以同源交換的形式发生基因重排而导致抗原转变，从而产生能引起大流行的新流行株。人类历史上几次大流感的流行毒株(H2N2、H3N2)均是禽流感病毒与人流感病毒发生基因重排而产生，而HlNl亚型AIV传播给人直接导致了 1918年世界范围内的毁灭性人类大流感流行。当前流行的甲型HlNl流感病毒的部分基因也来源于AIV。因此Hl亚型AIV虽为低致病性AIV，但具有重要的公共卫生学意义。加强Hl亚型AIV的检测和监测，对保障人类健康意义重大，而快速简便特异的检测技术有助于Hl亚型AIV的早期大規模诊断。目前禽流感病毒常采用的检测方法包括病毒鸡胚分离、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫荧光技术(IFA)、逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、实时荧光定量RT-PCR(RRT-PCR)、基因芯片(Gene chips)。传统的病毒鸡胚分离方法准确、简便，但耗时太长，通常需要两天到一周的时间；IFA、ELISA快速但需要特殊试剂；RT-PCR、RRT-PCR、Genechips检测技术快速、灵敏，但都需要特殊仪器和技术人员，且成本较高，不适合在基层推广使用。环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)是利用ー种具有链置换活性和瀑布式核酸扩增功能的Bst DNA聚合酶，在等温条件下进行核酸的变性和自动循环的链置換核酸扩增反应，整个反应不需要特殊的仪器设备，仅在水浴锅中就可完成。LAMP技术在目的基因保守区设计了针对8个特异区域的6条引物，使扩增反应具有很高的特异性。LAMP反应结果的观察方法非常简便，反应结束后可通过肉眼在可见光或紫外线下直接观察反应液的颜色变化来判定結果。由于LAMP反应的扩增效率很高，在少量cDNA存在的条件下就可进行核酸的大量扩增，所以只需要在LAMP反应体系中加入反转录酶，通过逆转录环介导等温扩增反应(RT-LAMP)就可以完成RNA的检测。RT-LAMP具有简便、快速、灵敏、特异的优势，尤其适合在基层开展RT-LAMP试剂盒的应用推广。RT-LAMP技术中，引物是决定检测结果灵敏度和特异性的关键因素
发明内容
本发明所要解决的ー个技术问题是提供ー种检测或辅助检测Hl亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物。本发明所提供的检测或辅助检测Hl亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物，由简并引物FIP-H1、简并引物BIP-H1、简并引物F3-H1、简并引物B3-H1、简并引物LF-Hl和简并引物LB-Hl组成，它们的核苷酸序列分别为序列表中的序列I、序列2、序列3、序列
4、序列5和序列6。所述成套引物中，各简并引物的摩尔比可为^^!!!!!(^所述简并引物？^-^、
I.6 u mo I所述简并引物BIP-HUO. 2iimol所述简并引物F3_H1、0. 2 y mol所述简并引物B3-HU0. 8 u mo I所述简并引物LF_H1、0. 8 u mo I所述简并引物LB-H1。所述摩尔比是总摩尔数之比，所述总摩尔数是简并引物中各种单链DNA摩尔数之和。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种检测或辅助检测Hl亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂。本发明所提供的检测或辅助检测Hl亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试齐U，包括链置换型DNA聚合酶、甜菜碱、dATP、dCTP、dGTP和dTTP、Mg2+、反转录酶和上述检测或辅助检测Hl亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物。所述检测或辅助检测Hl亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂中，所述简并引物FIP-Hl、简并引物BIP-Hl、简并引物F3-H1、简并引物B3-H1、简并引物LF-Hl和简并引物LB-Hl、所述dATP、dCTP、dGTP、dTTP、所述Mg2+、所述链置换型DNA聚合酶、所述甜菜碱和所述反转录酶在所述扩增试剂中的配比可为I. 6 u mo I所述简并引物FIP-Hl、I. 6 u mo I所述简并引物BIP-HU0. 2iimol所述简并引物F3_H1、0. 2 y mol所述简并引物B3-H1、0. 8 u mo I所述简并引物LF-H1、0. 8 u mo I所述简并引物LB-H1、Immol所述dATP、Immol所述dCTP、Immol 所述 dGTP、Immol 所述 dTTP、6mmol 所述 Mg2+ 和 Immol 所述甜菜喊。所述简并引物FIP-H1、简并引物BIP-H1、简并引物F3-H1、简并引物B3-H1、简并引物LF-Hl和简并引物LB-Hl的摩尔数均是指简并引物中各种单链DNA的总摩尔数。所述检测或辅助检测Hl亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂中，所述链置换型DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶大片段；所述反转录酶可为M-MLV反转录酶。所述检测或辅助检测Hl亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂还可包括突光显色剂。进一步，所述突光显色剂可为每I试剂由Iii I浓度为625iimol/L的隹丐黄绿素溶液、I U I浓度为12. 5mmol/L MnCl2的溶液和2 U I灭菌超纯水组成。本发明所要解决的再一个技术问题是提供一种检测或辅助检测Hl亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂盒。本发明所提供的检测或辅助检测Hl亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂盒，包括上述检测或辅助检测Hl亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物或上述检测或辅助检测Hl亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂。进一步，所述检测或辅助检测Hl亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂盒还可包括阳性对照和阴性对照。其中，阳性对照可为Hl亚型禽流感病毒RNA ;阴性对照可为灭菌超纯水。另外，上述检测或辅助检测Hl亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物在制备检测或辅助检测Hl亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂或试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。
上述检测或辅助检测Hl亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物和上述检测或辅助检测Hl亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂和检测或辅助检测Hl亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂盒中，所述简并引物FIP-H1、简并引物BIP-H1、简并引物F3-H1、简并引物B3-H1、简并引物LF-Hl和简并引物LB-Hl可分别单独包装或按照所述比例混合在一起。本发明所要解决的再一个技术问题是提供ー种检测或辅助检测HlNl和H1N2亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物。本发明所提供的检测或辅助检测HlNl和H1N2亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物，由简并引物FIP-H1 、简并引物BIP-H1、简并引物F3-H1、简并引物B3-H1、简并引物LF-H1、简并引物LB-H1、简并引物FIP-N1、简并引物BIP-N1、简并引物F3-N1、简并引物B3-N1、简并引物LF-N1、简并引物LB-N1、简并引物FIP-N2、简并引物BIP-N2、简并引物F3-N2、简并引物B3-N2、简并引物LF-N2和简并引物LB-N2组成，它们的核苷酸序列分别为序列表中的序列I、序列2、序列3、序列4、序列5、序列6、序列7、序列8、序列9、序列10、序列11、序列12、序列13、序列14、序列15、序列16、序列17和序列18。所述检测或辅助检测HlNl和H1N2亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物中，各简并引物的摩尔比为1.6μπι01所述简并引物FIP-Hl、1.6ymol所述简并引物BIP-HU0. 2ymol简并引物F3_H1、0. 2 μ mol简并引物Β3_Η1、0· 8 μ mol简并引物LF-HU O. 8 μ mo I简并引物LB-H1、L 6 μ mol所述简并引物FIP-N1、I. 6 μ mol所述简并引物ΒΙΡ-Ν1、0· 2ymol简并引物F3-N1、0. 2ymol简并引物Β3_Ν1、0· 8 μ mol简并引物LF-NU0. 8 μ mol简并引物LB-N1、I. 6 μ mol所述简并引物FIP-N2、I. 6 μ mol所述简并引物ΒΙΡ-Ν2、0· 2 μ mol 简并引物 F3_N2、0. 2 μ mol 简并引物 Β3_Ν2、0· 8 μ mol 简并引物 LF-N2 和
0.8 μ mol 简并引物 LB-N2。本发明所要解决的另一个技术问题是提供ー种检测或辅助检测HlNl和H1N2亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂。所述检测或辅助检测HlNl和H1N2亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂包括链置换型DNA聚合酶、甜菜碱、dATP、dCTP、dGTP和dTTP、Mg2+、反转录酶和所述检测或辅助检测HlNl和H1N2亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物。所述检测或辅助检测HlNl和H1N2亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂中包括三套独立的试剂，分别为A、B、C。反应试剂A含有I. 6 μ mol所述简并引物FIP-H1、
1.6 μ mol所述简并引物ΒΙΡ-Η1、0· 2μπιο1所述简并引物F3_H1、0. 2 μ mol所述简并引物B3-HU0. 8ymol所述简并引物LF-HU0. 8 μ mol所述简并引物LB-HlUmmol所述dATP、Immol 所述 dCTP、Immol 所述 dGTP、Immol 所述 dTTP、6mmol 所述 Mg2+ 和 Immol 所述甜菜喊。反应试剂B含有I. 6 μ mol所述简并引物FIP-Nl、I. 6 μ mol所述简并引物BIP-Nl、
O.2 μ mol所述简并引物F3-N1、0. 2 μ mol所述简并引物Β3_Ν1、0· 8 μ mol所述简并引物LF-NKO. 8 μ mol 所述简并引物 LB-N1、Immol 所述 dATP、Immol 所述 dCTP、Immol 所述 dGTP、Immol所述dTTP、6mmol所述Mg2+和Immol所述甜菜喊。反应试剂C含有I. 6 μ mol所述简并引物FIP-N2、I. 6 μ mol所述简并引物BIP-N2、O. 2 μ mol所述简并引物F3-N2、0. 2 μ mol所述简并引物B3_N2、0. 8 μ mol所述简并引物LF-N2、0. 8 μ mol 所述简并引物 LB-N2、Immol 所述 dATP、Immol 所述 dCTP、Immol 所述 dGTP、Immol所述dTTP、6mmol所述Mg2+和Immol所述甜菜喊。上述试剂A和试剂B组合使用，可检测HlNl亚型禽流感病毒。试剂A和试剂C组合使用，可检测H1N2亚型禽流感病毒。所述检测或辅助检测HlNl和H1N2亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂中，所述链置换型DNA聚合酶可为Bst DNA聚合酶大片段；所述反转录酶可为M-MLV反转录酶。所述检测或辅助检测HlNl和H1N2亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂还可包括荧光显色剂。进一步，所述荧光试剂可为每4 试剂由I 浓度为625 iimol/L的钙黄绿素、I U I浓度为12. 5mmol/L的MnCl2和2 yl灭菌超纯水组成。
本发明所要解决的再一个技术问题是提供一种检测或辅助检测HlNl和H1N2亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂盒。本发明所提供的检测或辅助检测HlNl和H1N2亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂盒，包括上述检测或辅助检测HlNl和H1N2亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物或上述检测或辅助检测HlNl和H1N2亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试齐U。进一步，所述检测或辅助检测HlNl和H1N2亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂盒还可包括阳性对照和阴性对照。其中，阳性对照可为HlNl亚型禽流感病毒RNA和H1N2亚型禽流感病毒RNA ;阴性对照可为灭菌超纯水。另外，上述检测或辅助检测HlNl和H1N2亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物在制备检测或辅助检测HlNl和H1N2亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂或试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。上述检测或辅助检测HlNl和H1N2亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物，或上述检测或辅助检测HlNl和H1N2亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂，或上述检测或辅助检测HlNl和H1N2亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂盒均可采用下述I)或2)的方法进行制备I)上述检测或辅助检测HlNl和H1N2亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物，和上述检测或辅助检测HlNl和H1N2亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试齐U，和上述检测或辅助检测HlNl和H1N2亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂盒的制备方法，均包括将所述成套引物中的所述简并引物FIP-H1、简并引物BIP-H1、简并引物F3-H1、简并引物B3-H1、简并引物LF-H1、简并引物LB-H1、简并引物FIP-N1、简并引物BIP-N1、简并引物F3-N1、简并引物B3-N1、简并引物LF-N1、简并引物LB-N1、简并引物FIP-N2、简并引物BIP-N2、简并引物F3-N2、简并引物B3-N2、简并引物LF-N2和简并引物LB-N2分别单独包装的步骤；2)上述检测或辅助检测HlNl和H1N2亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物，和上述检测或辅助检测HlNl和H1N2亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂，和上述检测或辅助检测HlNl和H1N2亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂盒的制备方法，均包括制备如下3个单独包装的步骤a)将所述成套引物中的所述简并引物FIP-H1、简并引物BIP-H1、简并引物F3-H1、简并引物B3-H1、简并引物LF-H1、简并引物LB-Hl按照所述比例混合在一起得到一个单独包装；
b)将所述成套引物中的所述简并引物FIP-N1、简并引物BIP-N1、简并引物F3-N1、简并引物B3-N1、简并引物LF-N1、简并引物LB-Nl按照所述比例混合在一起得到一个单独包装；c)将所述成套引物中的所述简并引物FIP-N2、简并引物BIP-N2、简并引物F3-N2、简并引物B3-N2、简并引物LF-N2和简并引物LB-N2按照所述比例混合在一起得到一个单独包装本发明通过比较分析大量的Hl亚型AIV-HA基因序列、NI亚型AIV-NA基因序列和N2亚型AIV-NA基因序列，设计了 9对特异性引物，TRIZOL法或用RNA提取试剂盒提取感染家禽喉气管、泄殖腔棉拭子及组织样品的总RNA，在反转录酶和Bst DNA聚合酶作用下，于水浴锅63°C反应45分钟，一步法进行反转录和环介导等温扩增，80°C作用5min終止反应。本发明在反应前向反应试剂中添加入荧光试剂(Calcein和MnCl2的混合液)，反应结束后可直接通过肉眼在可见光或365nm波长紫外线照射下观察反应液的颜色变化来判定結果，实现了 RT-LAMP反应结果的可视化观察同时也避免了打开反应管盖后引起环境污染而造成下次实验的假阳性結果。反应开始之前钙黄绿素(Calcein)与荧光淬灭剂锰离子结合而不发荧光，反应液为浅桔色。随着反应的扩增，产生大量的焦磷酸根离子，而焦磷酸根离子更易与锰离子结合从而释放了钙黄绿素。游离的钙黄绿素就可自发荧光，镁离子还可以加强这种荧光效果，阳性反应液肉眼可见颜色变绿，在紫外线照射下可激发绿色荧光。实验证明，本发明的检测或辅助检测Hl亚型禽流感病毒、或HlNl和H1N2亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物、试剂和试剂盒可特异性地检测Hl亚型禽流感病毒，而对其它亚型禽流感病毒、呼吸道病原体无交叉反应，针对Hl亚型禽流感病毒HA基因的RT-LAMP方法最少可以检测到IOfg的禽流感病毒总RNA，灵敏度是常规RT-PCR方法的1000倍。针对HlNl、H1N2亚型禽流感病毒NA基因的RT-LAMP方法最少可以检测到IOOfg的禽流感病毒总RNA，灵敏度是常规RT-PCR方法的100倍。RT-LAMP方法对临床样品的检出率与经典的鸡胚分离方法一致，但略高于常规RT-PCR方法。本发明特异性强、灵敏度高、仪器设备及操作简单、结果便于观察，尤其适合在基层兽医站、养殖场及边境ロ岸进行Hl亚型、HlNl亚型、H1N2亚型禽流感病毒的快速诊断和早期筛查。
图I为RT-LAMP和RT-PCR方法检测Hl亚型AIV-HA基因的灵敏度比较。图中，M:100bp DNA分子量标准；其它从左至右分别为加入AIV总RNA含量为lng/2 μ 1,100pg/2 μ 1,10pg/2 μ I, lpg/2 μ I, IOOfg/2 μ I, IOfg/2 μ I 和 lfg/2y I 的管、阴性对照(NC)。其中A图为可见光下RT-LAMP反应結果，B图为365nm波长紫外线照射下RT-LAMP反应結果，C图为RT-PCR的1%琼脂糖凝胶电泳图。图2为RT-LAMP和RT-PCR方法检测HlNl亚型AIV-NA基因的灵敏度比较。图中，M:100bp DNA分子量标准；其它从左至右分别为加入AIV总RNA含量为lng/2 μ I、100pg/2 μ I、10pg/2 μ I、lpg/2 μ I、100fg/2 μ I、10fg/2 μ I 和 If g/2 μ I 的 AIV 总RNA的管、阴性对照(NC)。其中A图为可见光下RT-LAMP反应結果，B图为365nm波长紫外线照射下RT-LAMP反应結果，C图为RT-PCR的1%琼脂糖凝胶电泳图。图3为RT-LAMP和RT-PCR方法检测H1N2亚型AIV-NA基因的灵敏度比较。
图中，M:100bp DNA分子量标准；其它从左至右分别为加入AIV总RNA含量为lng/2 u I、100pg/2 u I、10pg/2 u I、lpg/2 u I、100fg/2 u I、10fg/2 u I 和 lfg/2 u I 的 AIV 总RNA的管、阴性对照(NC)。其中A图为可见光下RT-LAMP反应结果，B图为365nm波长紫外线照射下RT-LAMP反应结果，C图为RT-PCR的1%琼脂糖凝胶电泳图。图4为检测Hl亚型AIV-HA基因的RT-LAMP引物在模板基因(A/Duck/Guangxi/030D/2009 (HlNl)HA 基因)的具体位置。其中 Flc-HU LF-HU B2-H1、B3-H1 引物序列与模板基因序列反向互补。FIP-Hl引物由Flc-Hl和F2-H1引物组成，BIP-Hl引物由Blc-Hl和B2-H1引物组成图5为检测HlNl亚型AIV-NA基因的RT-LAMP引物在模板基因(A/Duck/Guangxi/030D/2009 (HlNl) NA 基因)的具体位置。其中 Flc-NU LF-NU B2-N1、B3-N1 引物序列与模板基因序列反向互补。FIP-Nl引物由Flc-Nl和F2-N1引物组成，BIP-Nl引物由Blc-Nl和B2-N1引物组成。图6为检测H1N2亚型AIV-NA基因的RT-LAMP引物在模板基因(A/Duck/Guangxi/D/2011 (H1N2)NA基因)的具体位置。其中Flc-N2、LF-N2、B2-N2、B3_N2引物序列与模板基因序列反向互补。FIP-N2引物由Flc-N2和F2-N2引物组成，BIP-N2引物由Blc_N2和B2-N2引物组成。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中的毒株或毒株核酸样品公众均可从广西壮族自治区兽医研究所获得，除A/Duck/Guangxi/D/2011 _2)记载在GenBank外(登录号JQ904458，在该登录号中的名称为A/duck/Guangxi/D/2011 (H1N2),其它均记载在如下文献中Yi Peng, et al. Visual detectionof H3 subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediatedisothermal amplification assay. Virology Journal, 2011，8:337。实施例I、成套引物本实施例的检测或辅助检测Hl、HlNl和H1N2亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物，由检测或辅助检测Hl亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物、检测或辅助检测NI亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物和检测或辅助检测N2亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物这三套引物组成。其中，检测或辅助检测Hl亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物，由简并引物FIP-H1、简并引物BIP-H1、简并引物F3-H1、简并引物B3-H1、简并引物LF-Hl和简并引物LB-Hl组成，它们的核苷酸序列分别为序列表中的序列I、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6 (表I)。其中，F3-H1和B3-H1为外引物，FIP-Hl和BIP-Hl为内引物，LF-Hl和LB-Hl为环引物。各引物在HlNl亚型禽流感病毒A/Duck/Guangxi/030D/2009 (HlNl) HA 基因中的位置见图 4。检测或辅助检测NI亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物，由简并引物FIP-N1、简并引物BIP-N1、简并引物F3-N1、简并引物B3-N1、简并引物LF-Nl和简并引物LB-Nl组成，它们的核苷酸序列分别为序列表中的序列7、序列8、序列9、序列10、序列11和序列12 (表I)。其中，F3-N1和B3-N1为外引物，FIP-Nl和BIP-Nl为内引物，LF-Nl和LB-Nl为环引物。各引物在HlNl亚型禽流感病毒A/Duck/Guangxi/030D/2009(H1N1)NA基因中的具体位置见图5。检测或辅助检测N2亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物，由简并引物FIP-N2、简并引物BIP-N2、简并引物F3-N2、简并引物B3-N2、简并引物LF-N2和简并引物LB-N2组成，它们的核苷酸序列分别为序列表中的序列13、序列14、序列15、序列16、序列17和序列18 (表I)。其中，F3-N2和B3-N2为外引物，FIP-N2和BIP-N2为内引物，LF-N2和LB-N2为环引物。各引物在H1N2亚型禽流感病毒A/Duck/Guangxi/D/2011 (H1N2)NA基因中的具体位置见图6。表IRT-LAMP引物序列
权利要求
1.检测或辅助检测HlNl和H1N2亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物，由简 并引物FIP-H1、简并引物BIP-H1、简并引物F3-H1、简并引物B3-H1、简并引物LF-H1、简并 引物LB-H1、简并引物FIP-N1、简并引物BIP-N1、简并引物F3-N1、简并引物B3-N1、简并引 物LF-N1、简并引物LB-N1、简并引物FIP-N2、简并引物BIP-N2、简并引物F3-N2、简并引物 B3-N2、简并引物LF-N2和简并引物LB-N2组成，它们的核苷酸序列分别为序列表中的序列 I、序列2、序列3、序列4、序列5、序列6、序列7、序列8、序列9、序列10、序列11、序列12、序 列13、序列14、序列15、序列16、序列17和序列18。
2.根据权利要求I所述的成套引物，其特征在于所述成套引物中，各简并引物的摩尔 比为I. 6 u mo I所述简并引物FIP-Hl、1.6iimol所述简并引物BIP_H1、0. 2 y mol所述简并 引物F3-HU0. 2 u mo I所述简并引物B3-HU0. 8 u mo I所述简并引物LF-HU 0. 8mol所述简 并引物LB-H1U. 6iimol所述简并引物FIP_N1、1. 6 y mol所述简并引物BIP_N1、0. 2 y mol 所述简并引物F3-N1、0. 2 ii mol所述简并引物B3-N1、0. 8 y mol所述简并引物LF-Nl、0.8u mo I所述简并引物LB-Nl、1.6iimol所述简并引物FIP-N2、I. 6 y mol所述简并引物 BIP-N2.0. 2umol所述简并引物F3_N2、0. 2 y mol所述简并引物B3_N2、0. 8mol所述简并引 物LF-N2和所述0. 8 ii mol简并引物LB-N2。
3.检测或辅助检测HlNl和H1N2亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂或试剂 盒，其特征在于所述试剂或试剂盒包括甜菜碱、dATP、dCTP、dGTP和dTTP、Mg2+和权利要求 I或2所述的成套引物。
4.根据权利要求3所述的试剂或试剂盒，其特征在于所述试剂或试剂盒中包括三 套独立包装的试剂，分别为反应试剂A、反应试剂B和反应试剂C ;所述反应试剂A含有1.6 u mo I所述简并引物FIP-Hl、1.6iimol所述简并引物BIP_H1、0. 2 y mol所述简并引物 F3-H1、0. 2iimol所述简并引物B3-Hl、0.8iimol所述简并引物LF-Hl、0.8iimol所述简并弓丨 物 LB-Hl、Immol 所述 dATP、Immol 所述 dCTP、Immol 所述 dGTP、Immol 所述 dTTP、6mmol 所述 Mg2+和Immol所述甜菜碱；所述反应试剂B含有1.6 iimol所述简并引物FIP-Nl、1.6 iimol所述简并引物BIP-Nl、 0. 2 u mol所述简并引物F3-N1、0. 2 u mo I所述简并引物B3_N1、0. 8 u mol所述简并引物 LF-Nl >0. 8 u mo I 所述简并引物 LB-N1、Immol 所述 dATP、Immol 所述 dCTP、Immol 所述 dGTP、 Immol所述dTTP、6mmol所述Mg2+和Immol所述甜菜喊；所述反应试剂C含有I. 6iimol所述简并引物FIP-N2、1. mol所述简并引物BIP-N2、 0. 2 u mol所述简并引物F3-N2、0. 2 u mo I所述简并引物B3_N2、0. 8 u mol所述简并引物 LF-N2、0. 8 u mo I 所述简并引物 LB-N2、Immol 所述 dATP、Immol 所述 dCTP、Immol 所述 dGTP、 Immol所述dTTP、6mmol所述Mg2+和Immol所述甜菜喊。
5.检测或辅助检测Hl亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物，由简并引物 FIP-H1、简并引物BIP-H1、简并引物F3-H1、简并引物B3-H1、简并引物LF-Hl和简并引物 LB-Hl组成，它们的核苷酸序列分别为序列表中的序列I、序列2、序列3、序列4、序列5和序 列6。
6.根据权利要求5所述的成套引物，其特征在于所述成套引物中，各简并引物的摩尔 比为I. 6 u mo I所述简并引物FIP-Hl、1.6 ii mo I所述简并引物BIP_H1、0. 2 y mol简并引物 F3-HU0. 2umol 简并引物 B3-HU0. 8umol 简并引物 LF-Hl 和 0. 8 u mo I 简并引物 LB-Hl
7.检测或辅助检测Hl亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂或试剂盒，其特 征在于所述试剂或试剂盒均包括甜菜碱、dATP、dCTP、dGTP和dTTP、Mg2+和权利要求5或 6所述的成套引物。
8.根据权利要求7所述的试剂或试剂盒，其特征在于所述试剂或试剂盒中均含有 I. 6 μ mo I所述简并引物FIP-HU1. 6 μ mo I所述简并引物ΒΙΡ_Η1、0· 2 μ mo I所述简并引物 F3-H1、0. 2 μ mol所述简并引物Β3-Η1、0· 8 μ mol所述简并引物LF-H1、0. 8 μ mol所述简并引 物 LB-Hl、Immol 所述 dATP、Immol 所述 dCTP、Immol 所述 dGTP、Immol 所述 dTTP、6mmol 所述 Mg2+和Immol所述甜菜碱。
9.如下I)或2)的应用1)权利要求I或2所述成套引物在制备检测或辅助检测HlNl亚型禽流感病毒的环介 导等温扩增试剂或试剂盒中的应用；2)权利要求5或6所述成套引物在制备检测或辅助检测Hl亚型禽流感病毒的环介导 等温扩增试剂或试剂盒中的应用；进一步，所述检测或辅助检测HlNl亚型禽流感病毒的环介导等温扩增试剂或试剂盒 具体可为权利要求3或4所述的试剂或试剂盒；进一步，所述检测或辅助检测Hl亚型禽流感病毒的环介导等温扩增试剂或试剂盒具 体可为权利要求7或8所述的试剂或试剂盒。
10.如下I)或2)或3)的制备方法1)权利要求I或2所述成套引物或权利要求3或4所述的试剂或试剂盒的制备方法， 均包括将权利要求I或2所述成套引物中的所述简并引物FIP-H1、简并引物BIP-H1、简并 引物F3-H1、简并引物B3-H1、简并引物LF-H1、简并引物LB-H1、简并引物FIP-N1、简并引 物BIP-N1、简并引物F3-N1、简并引物B3-N1、简并引物LF-N1、简并引物LB-N1、简并引物 FIP-N2、简并引物BIP-N2、简并引物F3-N2、简并引物B3-N2、简并引物LF-N2和简并引物 LB-N2分别单独包装的步骤；2)权利要求I或2所述成套引物或权利要求3或4所述的试剂或试剂盒的制备方法， 均包括制备如下3个单独包装的步骤a)将权利要求I或2所述成套引物中的所述简并引物FIP-Hl、简并引物BIP-Hl、简并 引物F3-H1、简并引物B3-H1、简并引物LF-Hl、简并引物LB-Hl按照所述比例混合在一起得 到一个单独包装；b)将权利要求I或2所述成套引物中的所述简并引物FIP-Nl、简并引物BIP-Nl、简并 引物F3-N1、简并引物B3-N1、简并引物LF-Nl、简并引物LB-Nl按照所述比例混合在一起得 到另一个单独包装；c)将权利要求I或2所述成套引物中的所述简并引物FIP-N2、简并引物BIP-N2、简并 引物F3-N2、简并引物B3-N2、简并引物LF-N2和简并引物LB-N2按照所述比例混合在一起 得到再一个单独包装；3)权利要求5或6所述成套引物或权利要求7或8所述的试剂或试剂盒的制备方法， 均包括将权利要求5或6所述成套引物中的所述简并引物FIP-H1、简并引物BIP-H1、简并 引物F3-H1、简并引物B3-H1、简并引物LF-Hl和简并引物LB-Hl分别单独包装或按照所述 比例混合在一起的步骤。
全文摘要
本发明公开了一种H1亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测试剂盒。该试剂盒包括检测或辅助检测H1亚型禽流感病毒的环介导等温扩增成套引物，该成套引物由简并引物FIP-H1、简并引物BIP-H1、简并引物F3-H1、简并引物B3-H1、简并引物LF-H1和简并引物LB-H1组成，它们的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。本发明特异性强、灵敏度高、仪器设备及操作简单、结果便于观察，尤其适合在基层兽医站、养殖场及边境口岸进行H1亚型禽流感病毒的快速诊断和早期筛查。
文档编号C12Q1/70GK102649983SQ20121014755
公开日2012年8月29日 申请日期2012年5月14日 优先权日2012年5月14日
发明者刘加波, 庞耀珊, 彭宜, 范晴, 谢丽基, 谢志勤, 谢芝勋, 邓显文 申请人:广西壮族自治区兽医研究所