专利名称：酿酒酵母fby0095-007及其在啤酒超高浓酿造中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及啤酒酿造酵母，具体涉及酵母菌iSaccharomyces cerevisiae ) FBY0095-007及其在啤酒超高浓酿造中的应用。
背景技术：
2009年我国啤酒总产量4236. 4万千升，连续第八年居世界首位。目前，我国啤酒消费人群占全世界啤酒消费者的20%，全球啤酒量的增长中30%来自于中国。中国啤酒业成为世界啤酒市场中增长最快、产销量最大和竞争最为激烈的产业之一。此外，虽说我国是世界啤酒生产大国，但人均啤酒消耗量仅30. 2L，远低于世界平均消费量，更低于像捷克、爱尔兰和德国等爱喝啤酒的国家的人均啤酒消耗量(110L以上)。随着世界经济的复苏、中国经济的稳步持续高速增长以及人们生活水平的提高，在未来5年左右，我国啤酒市场仍然存在较大增长的空间。但面对高速发展的啤酒市场和人们不断增长的消费需求，我国啤酒生产企业在生产旺季往往出现生产供不应求的局面，而采用超高浓度酿造工艺则可以在不增加设备投入的基础上大幅度提高产量，因此，日益受到啤酒生产企业的青睐。啤酒超高浓酿造是指采用较高浓度的麦汁(> 18° P)进行发酵，在生产过程的后期用饱和CO2脱氧水稀释成正常浓度啤酒的一种生产技术。与普通浓度(10 12° P)酿造相比，超高浓酿造可在不增加糖化和发酵设备的基础上大幅度提高啤酒产量，提高啤酒生产效率，具有明显的经济优势。此外，采用超高浓酿造工艺制备的啤酒风味更加淡爽，在啤酒稀释到正常浓度后，酯和醇的水平与正常啤酒接近，因此，不会明显改变啤酒的风味。但是，在超高浓酿造过程中由于麦汁中高浓度的发酵性糖存在，使发酵初期的渗透压较高，发酵后期乙醇浓度较高。这些环境压力都会给酵母细胞内的代谢反应带来不利的影响，使得酵母活性下降，导致发酵滞缓或停止。因此，选育耐高浓麦汁和高乙醇，发酵周期短，双乙酰和总高级醇等生成量低的菌株至关重要。由于传统的诱变育种的饱和效应和基因工程筛选标记在食品安全方面的担忧，酿造酵母菌种改良必须考虑采用其他途径。在代谢工程的基础上，利用代谢途径分析的观点，确定了高浓环境对酵母胞内关键酶活的影响。以胞内关键酶活为筛选指标，利用甲基磺酸乙酯(EMS)对原始酵母菌株S. cerevisiae 0095进行轻度诱变，并用高浓度麦芽糖和乙醇进行逐级定向驯化，则可以筛选出性状优良的突变菌株。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术存在的上述不足，提供酿酒酵母FBY0095-007及其在啤酒超高浓酿造中的应用。酿酒酵母FBY0095-007是一株具有耐高浓度麦芽糖和乙醇双重耐受性的酿造酵母菌。本发明所提供的酿酒酵母菌株是(feccAarofflj^^s cererisiae) FBY0095-007，该菌株已于2010年12月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中科院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.4466。
本发明还提供了所述酿酒酵母(SaccAarofflJ^e1Scerevisiae)FBY0095-007 CGMCC No. 4466在啤酒超高浓酿造中的应用。本发明公开的酿酒酵母、Saccharomycescerevisiae) FBY0095-007 是经过 EMS (甲基磺酸乙酯)轻度诱变，并配以逐级高浓度麦芽糖和乙醇进行驯化，以胞内关键酶活为指标，筛选目标菌株的安全性高，并使酵母耐高浓度麦芽糖和耐高浓度乙醇，使筛选更具有方向性。啤酒酿造酵母FBY0095-007在啤酒超高浓酿造中的应用，试产实验结果证明该菌株活性较高，遗传稳定性好，对超高浓麦汁的发酵周期短，且成品啤酒风味浓郁、协调，品质好。
图1为筛选菌株相对原始菌株FBY0095的乙醇脱氢酶的提高率的条形图。图2为筛选菌株相对原始菌株FBY0095的葡萄糖苷酶酶的提高率的条形图。图3为原始菌株FBY0095与筛选菌株FBY0095-007发酵性状的对比曲线。
具体实施例方式乙醇脱氢酶比活测定在96孔板中加入20μ1粗酶液，加入200μ1反应液，剧烈摇勻，开始反应，340nm波长下检测，每k记一个数，读20个数，拟合各点，计算斜率。酶活力定义在25°C条件下，以每分钟蛋白乙醇脱氢酶催化生成IMfflolNADH为一个酶活力单位。U (Mfflol/min)=A*V*103/e ；乙醇脱氢酶比活(U/gpratein)=U*稀释倍数*103/蛋白含量； A :340nm下的吸光值变化斜率(HiirTn ；V 加样体积(ml) ； ε =NADH的消光系数(6. 22*103 ΙΑ οΓ1)。葡萄糖苷酶活测定在96孔板中加入20μ1粗酶液，加入200μ1反应液，剧烈摇勻， 开始反应，400nm波长下检测，每&记一个数，读20个数，拟合各点，计算斜率。U (Mmol/ min)=A*V*107 ε ；葡萄糖苷酶(U/gpratein)=U*稀释倍数*103/蛋白含量；A :400nm下的吸光值变化斜率(min—n ；V 加样体积(ml) ； ε :4_硝基苯的消光系数(7. 28*103 LW’。蛋白含量测定以牛血清白蛋白(BSA)作标准，用Bradford法测定。酵母活性检测亚甲基蓝染色显微镜观察法。风味物质检测气相色谱-质谱联用法(GC-MS)。优良超高浓酿酒酵母FBY0095-007 CGMCC No. 4466的筛选
将对数期的原始酿酒酵母(SaccAaro^ce1S cerevisiae^ PYF0095制成细胞浓度为IO8 个/mL的菌悬液；
以Ιθμ /ml (菌悬液)浓度的EMS震荡诱变Ih后，用5% (g/ml)Na2S2O3溶液洗涤一次， 用无菌生理盐水洗涤2次，终止诱变作用；
将诱变后的菌株涂布在5% (g/g)麦芽糖浓度和5% (ml /ml)乙醇浓度的固体培养基上，20°C下倒置培养，挑取菌落较大，边缘整齐，生长良好的菌株接种到8% (g/g)麦芽糖浓度和8% (ml /ml)乙醇浓度的固体培养基上继续驯化生长，同样办法挑取菌落较大，生长良好的菌株接种到12% (g/g)麦芽糖浓度和12% (ml /ml)乙醇浓度的固体培养基上驯化生长。直至出现大部分菌落被抑制，只要少数菌落仍然生长，挑取这些生长较好的菌落，将其接种于麦汁培养基斜面中，4°C保藏，以备后用；将三角瓶中的发酵液离心(6000r/min，IOmin)后，每个瓶中各取0. 5g菌体，加入 5mL缓冲溶液，超声破碎(超声ls，间隔0. 5s，5min，功率325w)，10，000r/m离心6min取上清液，测乙醇脱氢酶和葡萄糖苷酶比活力(见图1和图2)，筛选酶活的菌株为目标菌株 FBY0095-007。酿酒酵母FBY0095-007 CGMCC No. 4466在啤酒超高浓酿造中的应用
将原始酵母FBY0095和筛选酵母FBY0095-007以接种量7. 5g (湿酵母)/L接种于3L 超高浓麦汁中(20°P)，12°C在EBC发酵管中进行发酵。由图3可知，当表观发酵度达到80% 时，原始菌株FBY0095的发酵周期为20天，筛选菌株FBY0095-007的发酵周期为15天，明显比原始菌株缩短。发酵结束后，温度降低到2°C进行后发酵，离心，过滤上清液，然后将过滤液稀释成乙醇浓度为5% (w/v)，比较原始菌株和筛选优良菌株的产品的风味和品质。由表1原始菌株FBY0095与筛选菌株FBY0095-007 CGMCC No. 4466产品的风味和品质的比较可知，筛选得到的优良菌株raY0095-007 CGMCC No. 4466产品比原始菌株FBY0095的风味和品质都优良明显的改善，其发酵结束时酵母的活性和性能较好，啤酒醇酯比协调，口感较好。
表权利要求
1.酿酒酵母FBY0095-007，该酿酒酵母(feccAarofflj^^s cerevisiaeH 2010 年 12 月 13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 4466。
2.权利要求1 所述的酿酒酵母(feccAarofflj^^s cerevisiae) FBY0095-007 CGMCC No. 4466在啤酒超高浓酿造中的应用。
全文摘要
本发明公开了酿酒酵母FBY0095-007及其在啤酒超高浓酿造中的应用。酿酒酵母FBY0095-007(Saccharomycescerevisiae)2010年12月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.4466。啤酒酿造酵母FBY0095-007在啤酒超高浓酿造中的应用，试产实验结果证明该菌株活性较高，遗传稳定性好，对超高浓麦汁的发酵周期短，且成品啤酒风味浓郁、协调，品质好。
文档编号C12R1/865GK102199555SQ201110093859
公开日2011年9月28日 申请日期2011年4月14日 优先权日2011年4月14日
发明者俞志敏, 崔春, 赵海锋, 赵谋明 申请人:华南理工大学