专利名称：利用单一微生物将可发酵碳源生物转化为1,3-丙二醇的制作方法
技术领域：
本发明包括利用单一微生物将一种可发酵的碳源生物转化为1，3_丙二醇的方法。
背景技术：
1，3-丙二醇是一种在生产聚酯纤维中和在制造聚亚胺酯及环状化合物中具有潜在应用价值的单体。已经知道有多种化学途径能够生产1，3_丙二醇。例如，可以利用一种催化剂，在存在磷化氢、水、一氧化碳、氢气和一种酸的情况下，通过丙烯醛的催化溶液相水合，然后还原，将环氧乙烷转化为1，3_丙二醇。或用碳氢化合物如甘油，在存在一氧化碳和氢气的条件下，使用含周期表第八族原子的催化剂进行反应来制备。虽然使用这些方法都能产生1， 3-丙二醇，但它们非常昂贵，并且会产生含有环境污染物的废物。人们在一个世纪前就已经知道，1，3-丙二醇可以通过发酵甘油来生产。已经在多种细菌例如柠檬酸杆菌属、梭菌属、肠杆菌属、泥杆菌属、克雷伯氏菌属、乳杆菌属和暗杆菌属中发现了能够生产1，3_丙二醇的菌株。在每种已经研究的情况中，甘油都经两个酶促反应序列步骤转化为1，3-丙二醇，第一步，一种脱水酶催化甘油转化为3-羟基丙醛(3-HP) 和水，方程1。第二步，3-HP被一种NAD+相连的氧化还原酶还原为1，3-丙二醇，方程2。1， 3-丙二醇不再被进一步代谢，因而在培养基中高浓度积累。整个反应消耗等当量的还原性辅助因子-还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，NADH被氧化成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)。甘油一3-HP+H20(方程 1)3-HP+NADH+H+ — 1,3-丙二醇 +NAD+ (方程 2)由甘油产生1，3-丙二醇一般以甘油为唯一碳源在厌氧条件下进行，并且没有其它外源的还原性等价受体。在这种条件下，在如柠檬酸杆菌属，梭菌属，和克雷伯氏菌属的菌株中，起作用的是一种甘油代谢的平行途径，这一途径包括，甘油首先被一种NAD+-(或 NADP+-)连接的甘油脱氢酶氧化为二羟基丙酮(DHA)，方程3。DHA在一种DHA激酶的作用下磷酸化后产生磷酸二羟基丙酮(DHAP)(方程4)，就可通过如糖酵解途径用于生物合成和支持ATP的产生。相对于1，3_丙二醇途径，这一途径可以为细胞提供碳源和能量，并且产生而不是消耗NADH。甘油+NAD+ — DHA+NADH+H+ (方程 3)DHA+ATP — DHAP+ADP (方程 4)在肺炎克雷伯氏菌和弗氏柠檬酸杆菌中，编码功能相连的甘油脱水酶(dhaB)、l， 3-丙二醇氧化还原酶(dhaT)、甘油脱水酶(dhaD)和二羟基丙酮激酶(dhaK)活性的基因都包含在调节子dha中。柠檬酸杆菌属和克雷伯氏菌属的dha调节子已在大肠杆菌中获得了表达，并且都显示能将甘油转化为1，3-丙二醇。制备甘油的生物过程已经知道，除一些细菌外，绝大多数甘油生产者是酵母，其它真菌和藻类也已知可产生甘油。细菌和酵母都通过糖酵解途径中的果糖-1，6- 二磷酸途径或Embden Meyerhof Parnas途径转化葡萄糖或其它碳水化合物来生产甘油，但是，某些特定的藻类将叶绿体中溶解的二氧化碳和碳酸氢盐转化成卡尔文循环中的三碳中间产物。在一系列步骤中，这种三碳中间产物-磷酸甘油被转化为3-磷酸甘油醛，3-磷酸甘油醛很容易互变为其酮异构体-磷酸二羟丙酮，并最终转化为甘油。虽然生产甘油和1，3_丙二醇的生物方法都已经知道，但一直没能证明整个过程能由单一有机体来完成。上面介绍的生产1，3_丙二醇的化学方法和生物方法都不能很好地适应于工业规模生产，因为化学过程消耗大量的能量，而生物过程需要昂贵的起始物质-甘油。因此需要一种只要求低能量输入和廉价起始物的方法。更需要这样一种方法，它应含有一种微生物， 这种微生物能将基本碳源如碳水化合物或糖转化为所需的1，3-丙二醇终产物。虽然需要能将可发酵碳源而不是甘油或二羟基丙酮转化为1，3_丙二醇的单一有机体转化，但已经证明这种努力需要克服重大的困难。例如，Gottschalk等人(EP 373 230)指出，多数对生产1，3_丙二醇有用的菌株如弗氏柠檬酸杆菌、Clostridium autobutylicum、丁酸梭菌和肺炎克雷伯氏菌，其生长会因存在氢供体如果糖或葡萄糖而受到干扰。短乳杆菌和布氏乳杆菌的菌株在甘油与果糖或葡萄糖中共发酵时能生产1，3_丙二醇，但在用甘油作唯一碳源时却不能生长，而且，虽然已经显示静止细胞能代谢葡萄糖或果糖，但它们不产生1，3_丙二醇(Veiga DA Cunha等，《细菌学杂志》174卷，1013页 (1992)) 0同样，已经显示多养泥杆菌的一个菌株，当提供甘油和乙酸时能产生1，3_丙二醇，但在没有甘油时不能由碳水化合物包括果糖和葡萄糖产生1，3_丙二醇。(Steib，《微生物学丛刊》(Arch. Microbiol. )140卷，139页(1984))。最后，Tong等人(《应用生物化学和生物技术》34卷，149页(199 )指出，转化有编码甘油脱水酶的dha调节子的重组大肠杆菌在没有外源甘油时，不能由葡萄糖或木糖产生1，3-丙二醇。提高由甘油生产1，3_丙二醇的产量的努力已经有了报导，这些方法包含能提供还原性等价物的辅助底物，典型的辅助底物为可发酵的糖类。已有人宣称弗氏柠檬酸杆菌和肺炎克雷伯氏菌DSM4270的静止细胞在共发酵甘油和葡萄糖时，产量能够提高(Gottschalk 等，上文；Tran-Dinh 等，DE 3734 764)；但肺炎克雷伯氏菌 ATCC25955 的生长细胞在共发酵甘油和葡萄糖时不能产生1，3_丙二醇(I-T.Tong，Ph.D.论文， Wisconsin-Madison大学(199 )。用重组大肠杆菌在甘油与葡萄糖或果糖中共发酵时也有产量提高的报导；但在没有甘油时，不能产生1，3-丙二醇(Tong，上文)。在这些系统中， 单一有机体将碳水化合物用作产生NADH的原料，并为细胞的维持和生长提供能量和碳。这些公开内容提示，糖类并没有进入产生1，3_丙二醇的碳流动。没有一种情况是在不含外源甘油的情况下产生了 1，3_丙二醇。因此文献清楚地提示，用单一有机体由一种碳水化合物生产1，3-丙二醇是不可能的。本发明解决的难题是用单一有机体由廉价的碳底物如葡萄糖或其它糖类生物生产1，3-丙二醇。这种生产1，3-丙二醇的生物法需要甘油作为一个两步顺序反应的底物， 在这个两步顺序反应中，一种脱水酶(典型的酶是一种依赖辅酶B12的脱水酶)将甘油转化为中间产物3-羟基丙醛，后者随后被一种依赖于NADH-(或NADPH)的氧化还原酶还原成1， 3-丙二醇。由于所需的辅助因子非常复杂，因此用这种反应顺序生产1，3_丙二醇的工业方法必须使用完整细胞作为催化剂。而且，为使这种生产方法在经济上可行，需要比甘油或二羟基丙酮便宜一些的原料。葡萄糖和其它碳水化合物是合适的底物，但正如上面所讨论的，它们干扰1，3-丙二醇的生产。结果没有一种单一的有机体显示出能将葡萄糖转化成1， 3-丙二醇。本发明的申请者已经解决了上述难题，本发明提供使用单一有机体将一种可发酵碳源直接生物转化为1，3-丙二醇的方法。葡萄糖被用作为模式底物，而且这种生物转化方法可应用于任何存在的微生物。携带一种脱水酶基因的微生物能将葡萄糖和其它糖类通过甘油降解途径转化成1，3-丙二醇，产量和选择性都非常好。而且，本发明还可通用于包括任何一种能方便地转化为1)甘油、幻二羟基丙酮、或幻甘油氧化而成的C3化合物(例如甘油3-磷酸)或4) 二羟基丙酮氧化而成的C3化合物(例如磷酸二羟基丙酮或甘油醛 3-磷酸)的碳底物。
发明内容
本发明包括使用单一微生物将一种碳底物生物转化为1，3-丙二醇的方法，这种方法通过将所说的微生物与所说的底物接触来进行，所说的微生物至少带有一个能表达一种脱水酶的基因。这种微生物可以是野生型的，或者是遗传性状改变了的，例如一种重组微生物或微生物的一种突变体。脱水酶优选为一种甘油脱水酶或一种二醇脱水酶。本发明进一步包括上述方法的产物。本发明进一步包括一种粘粒，这种粘粒含有一个从肺炎克雷伯氏菌中分离的351Λ 的DNA片段，其中所说的DNA片段编码一种有活性的甘油脱水酶，其限制酶切图谱见图1的泳道1和泳道2。这种粘粒在转入一种微生物时，能代谢一种碳底物特别是葡萄糖产生1，
3-丙二醇。本发明进一步包括一种转化的微生物，这种转化的微生物包含宿主微生物和上面所说的粘粒或所说粘粒的编码一种活性功能蛋白但不是甘油脱水酶的任何DNA片段。本发明还包括一种生产1，3_丙二醇的生物转化方法，这种生物转化方法包括，在合适的条件下将甘油与至少带有一个能表达一种脱水酶的基因的单一微生物接触，所用的微生物选自曲霉属、酵母属、接合酵母属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属、德巴利酵母属、毛霉属、球拟酵母属、甲基菌属、沙门氏菌属、芽胞杆菌属、链霉菌属和假单胞菌属。本发明还包括一种生产1，3_丙二醇的生物转化方法，这种生物转化方法包括，在合适的条件下将一种碳底物与至少带有一个能表达一种脱水酶的基因的单一微生物接触， 其中所说的基因编码甘油脱水酶，并分离自克雷伯氏菌属、乳杆菌属、肠杆菌属、柠檬酸杆菌属、暗杆菌属、泥杆菌属和梭菌属。本发明还包括一种生产1，3_丙二醇的生物转化方法，这种生物转化方法包括，在合适的条件下将一种碳底物与至少带有一个能表达一种脱水酶的基因的单一微生物接触， 其中所说的基因编码甘油脱水酶，并分离自克雷伯氏菌属和沙门氏菌属。优选的宿主微生物选自柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、梭菌属、克雷伯氏菌属、气杆菌属、乳杆菌属、曲霉属、酵母属、接合酵母属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属、德巴利酵母属、毛霉属、球拟酵母属、甲基菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属、芽胞杆菌属、链霉菌属和假单胞菌属。本发明包含的重组微生物在生物保藏物简述中进行阐述。
图 1 显示粘粒 pKPl、pKP2 和 ρΚΡ4 的限制酶(EcoRI、BamHI、EcoRV 和 NotI)消化物及其在0. 8%琼脂糖凝胶电泳上的分离图谱，上述粘粒图谱分别标记为泳道1、2和4。分子大小标准参照物上样在末端泳道。标记为数字1和2的泳道代表含有一个甘油脱水酶的粘粒。图2显示pKPl的部分物理图谱和各基因以DNA序列为基础的位置。这些基因的鉴定基于推导出的开放阅读框与Genbank数据库的比较，比较所用的软件为Wisconsin大学的序列分析软件提供的Tfasta程序(Genetics Computer Group，1991年4月，第7版， 575 Science Drive, Madison, WI53711)。生物保藏物和序列表简述含有粘粒pKPl的转化大肠杆菌DH5ci依照《布达佩斯条约》于1995年4月18日保藏在ATCC，并被命名为ATCC69789，粘粒pKPl含有克雷伯氏菌基因组的编码甘油脱水酶的部分。含有粘粒PKP4的转化大肠杆菌DH5 α依照《布达佩斯条约》于1995年4月18日保藏在ATCC，并被命名为ATCC69790，粘粒ρΚΡ4含有克雷伯氏菌基因组的编码二醇脱水酶的部分。转化有一个含dhaB操纵子的质粒的铜绿假单胞菌菌株ΡΑ02845 :pDT9依照《布达佩斯条约》于1996年4月11日保藏在ATCC，并被命名为ATCC55760。转化有非复制型质粒的巴斯德毕赤酵母菌株MSP42.81依照《布达佩斯条约》于1996年4月11日保藏在ATCC，并被命名为ATCC74363，非复制型质粒上含有dhaBl、dhaB2、dhaB3和dhaT基因的表达盒。转化有一个含有dhaBl、dhaB2、dhaB3和dhaT操纵子的质粒的啤酒酵母菌株pMCKl/10/17 (HM) #A, 在本国际申请提交前依照《布达佩斯条约》于1996年5月9日保藏在ATCC，并被命名为 ATCC74370。转化有一个含有dhaBl、dhaB2、dhaB3和dhaT操纵子的质粒的浅青紫链霉菌菌株SL/14. 2，在本国际申请提交前依照《布达佩斯条约》于1996年5月9日保藏在ATCC，并被命名为ATCC98052。转化有一个含有dhaBl、dhaB2和dhaB3操纵子的质粒的地衣芽胞杆菌菌株BG188/piC6(克隆#8)，在本国际申请提交前依照《布达佩斯条约》于1996年5月9 日保藏在ATCC，并被命名为ATCC98051。转化有一个含有dhaBl、dhaB2、dhaB3和dhaT操纵子的质粒的枯草芽胞杆菌菌株BG^64/pM27(克隆#1)，在本国际申请提交前依照《布达佩斯条约》于1996年5月9日保藏在ATCC，并被命名为ATCC98050。转化有一个含有dhaBl、 dhaB2、dhaB3和dhaT操纵子的质粒的黑曲霉株TGR40-13，在本国际申请提交前依照《布达佩斯条约》于1996年5月9日保藏在ATCC,并被命名为ATCC74369。“ATCC”指位于12301 Parklawn Drive,Rockville,MD 20852 U. S. A的美国典型培养物保藏中心国际保藏处。命名是指保藏物的登记号。本发明的申请人提供46个序列，这些序列遵循“专利申请中核苷酸和氨基酸序列标准表述的规定”(ΕΡ0局长决议的附录I和附录II，发表于OJ EPO的No 2增补件， 12/1992)，并遵循37C. F. R. 1. 821—1. 825和附录A和B( “含有核苷酸和/或氨基酸序列的申请文件的要求”)。
具体实施例方式本发明提供一个在单一有机体中由可发酵的碳源生物生产1，3-丙二醇的方法。 这种方法包括一种含脱水酶的微生物，这种微生物与一种碳底物相接触，而1，3_丙二醇从生长培养基中分离。这种单一有机体可以是野生型有机体，或者可以是携带有编码脱水酶的基因的、遗传性状改变了的有机体。本发明提供一个快速、廉价和符合环保的1，3_丙二醇单体来源，这种1，3_丙二醇单体在聚酯和其它聚合物的生产中非常有用。在这里，下列词可用于权利要求和说明书的解释。在这里，“核酸”一词指由单体(核苷酸)组成的大分子，它可以是单链的，也可以是双链的。核苷酸包含一分子的糖、磷酸以及一分子的嘌呤或嘧啶。“核酸片段”指所给核酸分子的一个部分。在高等植物中，脱氧核糖核酸(DNA)是遗传物质，而核糖核酸(RNA)参与DNA到蛋白质的信息转移。“基因组”指有机体中每个细胞所含的全部遗传物质。“核苷酸序列”一词指DNA或RNA的多聚物，它可以是单链的，也可以是双链的，并可选择地含有能掺入DNA或RNA多聚物的人工合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。在这里，“基本上相同”指DNA序列可有并不引起所编码氨基酸改变的碱基改变，或者碱基改变使一个或多个氨基酸改变，但并不影响DNA序列所编码蛋白质的功能特性。所以应当理解本发明所包含的要大于序列特例。本发明也包括基本上不影响结果蛋白分子功能特性的序列修改，诸如在序列中产生沉默改变的删除、插入或替换。例如，本发明包括反映遗传密码简并性的基因序列改变，或在给定位点导致产生一个化学等价氨基酸的基因序列改变。因此，疏水性氨基酸丙氨酸的密码子可被编码另一个疏水性稍弱的氨基酸残基如甘氨酸的密码子取代，或可被编码疏水性更强的氨基酸残基的密码子取代，如被编码缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸的密码子取代。同样，导致一个带负电荷的残基取代另一个带负电荷的残基的改变，如天冬氨酸取代谷氨酸，或一个带正电荷的残基取代另一个带正电荷的残基，如赖氨酸取代精氨酸，预计也可产生生物等价产物。导致蛋白分子的N末端部分和C末端部分改变的核苷酸改变也不一定改变蛋白的活性。在某些情况下，事实上需要使序列突变来研究改变对蛋白生物活性的影响。上面每种设想的修改和编码产物保留的生物活性的鉴定都是本领域的常规技术。而且，本领域的技术人员应知道，本发明所包括的“基本上相同”的序列也可由它们与这里所举的序列例子在严格条件下(0. 1XSSC，0. 1% SDS，65°C )杂交的能力来定义。“基因”指表达一个特殊蛋白的核酸片段，包括编码序列前面(5'非编码区)和后面(3'非编码区)的调节序列。“天然”或“野生型”的基因指自然界中发现的带有其自身调节序列的基因。“遗传改变的或遗传改变的微生物”指适用于本发明的、天然遗传机制经历了改变的任何微生物。微生物的遗传改变可通过含异源核酸片段的载体转化、诱变剂(例如，UV 灯，乙磺酸)诱变、或其它任何能在细胞基因组中产生稳定改变的方法来进行。“构建物”一词指任何来源的质粒、病毒、自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，它们可以是线型的或环状的、单链的或双链的DNA或RNA，在它们中，多种核苷酸序列组合或重组成一个独特的结构，这种独特的结构能将一个启动子片段、所选基因产物的DNA序列以及合适的3'非翻译序列导入一个细胞。“转化”或“转染”指细胞在整合核酸后获得新的基因。所获得的基因可以整合在染色体中，也可作为染色体外复制序列导入。“转化子”指转化的产物。“遗传改变的”指用转化或突变的方法改变遗传物质的过程。“表达”指由编码基因产物序列的基因经转录和翻译得到基因产物。在这里，“质粒”或“载体”或“粘粒”指染色体外的遗传元件，它们常常带有不是细胞中心代谢的一部分的基因，并且通常为双链环状的DNA分子形式。“脱水酶”指任何能够将甘油分子异构或转化为3-羟基丙醛产物的酶。根据本发明的目的，脱水酶包括甘油脱水酶或二醇脱水酶，它们的优选底物分别为甘油和1，2_丙二“碳底物”或“碳源”的意思是任何能被一种微生物代谢的碳源，其中底物中至少有一个碳原子。本发明的前提是，碳底物不是甘油或二羟基丙酮。重组有机体的构建本发明的重组有机体含有将碳底物转化为1，3-丙二醇的酶促途径的编码基因， 重组有机体可用本领域熟知的技术进行构建。在本发明中，编码脱水酶的基因可从一个天然宿主如克雷伯氏菌中分离，并用来转化大肠杆菌宿主菌株DH5 α、ECL707和ΑΑ200。从一个细菌的基因组中获取所需基因的方法在分子生物学领域中非常普通和熟知。例如，如果基因的序列是已知的，就用限制性内切酶消化来构建合适的基因组文库，并可用与所需基因序列互补的探针进行筛选。一旦分离到序列，就可用标准的引物指导下的扩增方法如聚合酶链反应(PCR) (U. S. 4，683，202)扩增DNA，来获得大量适于用载体进行转化的DNA。另外，可以构建粘粒文库，即可将大片段的基因组DNA(35-451Λ)包装到载体中， 用于转化合适的宿主。粘粒载体的独特性在于能容纳大量的DNA。粘粒一般至少有一个拷贝的cos DNA序列，cos序列对于外源DNA的包装及随后的环化是必需的。除了 cos序列外，这些载体还含有复制的起始区域(Col El)和药物抗性标记(如抗氨苄青霉素或抗新霉素的基因)。用粘粒来转化合适细菌宿主的方法在Sambr00k，J.等，《分子克隆实验指南》， 第二版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press中有详细的介绍，在此引入作为参考。对典型的粘粒克隆来说，外源DNA分离后，使用合适的限制性内切酶将其连接到粘粒载体的COS区域。然后含有线性外源DNA的粘粒载体与一个DNA包装载体如λ噬菌体反应。在包装过程中，cos位点被切割，外源DNA被包装到细菌病毒颗粒的头部。然后这些颗粒被用于转染合适的宿主细胞，例如大肠杆菌。一旦注射到细胞内部，外源DNA在cos 粘性末端的影响下环化。通过这种方式，外源DNA的大片段能被导入重组宿主细胞，并在其中表达。粘粒载体和粘粒转化方法在本发明的上下文中被用来从已知能将甘油加工成1， 3丙二醇的细菌种属中克隆基因组DNA的大片段。特别是，来自肺炎克雷伯氏菌的基因组 DNA用本领域熟知的方法进行了分离，并用限制性内切酶Sau 3A消化，然后插入到粘粒载体Supercos 1 ,并用GigapackII包装抽提物包装。载体构建后，用此粘粒DNA转化大肠杆菌XLl-Blue MR细胞。使细胞在存在甘油的条件下生长，并分析培养基中1，3-丙二醇的形成，来筛选能够将甘油转化为1，3_丙二醇的转化子。对两个1，3_丙二醇阳性的转化子进行了分析，并将其粘粒命名为pKPl和pKP2。 DNA测序表明它们与来自弗氏柠檬酸杆菌的甘油脱水酶有着广泛的同源性，这证明这些转化子含有编码甘油脱水酶基因的DNA。对其它1，3-丙二醇阳性的转化子也进行了分析，它们的粘粒命名为ΡΚΡ4和pKP5。DNA测序表明这些粘粒带有编码二醇脱水酶基因的DNA。虽然本发明使用了来自一个克雷伯氏菌属粘粒的分离基因，脱水酶基因的其它来源还可包括但不限于柠檬酸杆菌属、梭菌属和沙门氏菌属。能正向影响1，3_丙二醇产生的其它基因可在合适的宿主中表达。例如很可能非常需要甘油降解途径和/或其它途径中的特定酶超量表达，比现在在野生型细胞中发现的表达水平要高得多。这可通过将编码这些酶的基因选择性克隆到多拷贝质粒中或将这些基因置于一个诱导型或组成型的强启动子的后面来完成。超量表达所需蛋白的方法在分子生物学领域非常普通和熟知，在以上Sambrook文中可找到例子。而且，用本领域的技术人员熟知的方法对特定基因进行特异性地删除，会明显影响1，3_丙二醇的产生。这些方法的例子可在《酶学方法》,217卷，R. Wu编，Academic Press San Diego (1993)中找到。突变体应当理解，除了举例所用的细胞，本发明还能使用有着单一或多个突变的细胞，这些突变被特别设计来增加1，3-丙二醇的产量。通常将碳原料偏离到不能产生1，3_丙二醇的途径的细胞，或出现明显的分解代谢产物阻遏的细胞，都可通过突变来消除这些表型缺陷。例如，许多野生型细胞可因培养基中的葡萄糖和副产物产生分解代谢阻遏。可以理解这些有机体的突变株，如能抵抗葡萄糖的阻遏而生产1，3_丙二醇，将在本发明中特别有用。产生突变体的方法在本领域中非常普通和熟知。例如，野生型细胞可暴露在各种试剂如辐射或化学诱变剂中，然后筛选所需要的表型。当用辐射来产生突变时，紫外线(UV) 或离子辐射都可以使用。用于遗传突变的合适短波紫外线的波长范围为200nm至300nm， 优选波长为2Mnm。这个波长的UV辐射原则上导致核酸序列中的鸟嘌呤和胞嘧啶改变为腺嘌呤和胸腺嘧啶。因为所有的细胞都有DNA修复机制，能修复多数UV诱导的突变，可加入试剂如咖啡碱和其它抑制剂来干扰修复过程，使有效突变的数量变得最大。使用波长在 300nm至400nm范围的长波UV诱变也可以，但除非与多种激活剂如能与DNA作用的补骨质素染料联用，一般不如短波UV有效。用化学试剂来产生突变体也非常有效，常用的物质包括能影响非复制DNA的化合物如HNO2和NH2OH,以及影响复制DNA的试剂如吖啶染料，吖啶染料因能引起移码突变而非常引人注目。用辐射或化学试剂产生突变体的特殊方法在本领域中文献非常多。例如见， Thomas D. Brock，《生物技术工业微生物教程》，第二版(1989) Sinauer Associates, Inc.， Sunderland, ΜΑ.，或Deshpande，Mukund V.，《应用生物化学和生物技术》，36卷，227页， (1992)，这里引入作为参考。诱变发生后，具有所需表型的突变体可用多种方法进行选择。随机筛选是最常用的，即选择能产生所需产物或中间产物的诱变细胞。另外，可使诱变群体在只有抗性克隆能够生长的选择培养基上生长来选择性地分离突变体。突变体选择的方法在工业微生物领域已经非常完备和熟知。见Brook,上文，DeMancilha等，《食品化学》，14卷，313页，(1984)。
1,3-丙二醇产生途径中的突变和转化代表性的酶途径。从葡萄糖产生1，3_丙二醇可由下面的系列步骤来完成。这个步骤系列是本领域的技术人员所熟知的多种途径的代表。葡萄糖经过一系列步骤在糖酵解途径的酶催化下转化为磷酸二羟基丙酮(DHAP)和3-磷酸甘油醛(3-PG)。然后，甘油可由 DHAP水解成二羟基丙酮(DHA)后还原形成，或由DHAP还原成甘油3-磷酸(G3P)后水解来形成。水解步骤可由各种已知没有底物特异性的细胞磷酸酶催化，或者这种活性可用转化来导入宿主。还原步骤可由一种NAD+(或NADP+)相连的宿主酶催化，或者这种活性可用转化来导入宿主。值得注意的是dha调节子含有一个甘油脱氢酶(E. C. 1. 1. 1. 6)，这个酶催化方程3的逆反应。甘油一3-HP+H20(方程 1)3-HP+NADH+H+ — 1,3-丙二醇 +NAD+ (方程 2)甘油+NAD+ — DHA+NADH+H+ (方程 3)甘油经3-羟基丙醛(3-HP)中间产物转化为1，3_丙二醇，这已在前面作了详细介绍。从甘油产生3-HP(方程1)是由脱水酶催化的，脱水酶可以由宿主编码或用转化的方法导入宿主。这种脱水酶可以是甘油脱水酶(E. C. 4. 2. 1. 30)、二醇脱水酶(E. C. 4. 2. 1. 28) 或任何能够催化这个转化的酶。甘油脱水酶是由dha调节子编码的，而二醇脱水酶不是。 从3-HP产生1，3_丙二醇(方程幻是由一种NAD+(或NADP+)相目连的宿主酶催化，或者这种活性可用转化来导入宿主。这个产生1，3_丙二醇的最后反应可由1，3_丙二醇脱氢酶 (E. C. 1. 1. 1. 202)或其它乙醇脱氢酶催化。影响碳通道的突变和转化。多种在1，3-丙二醇产生途径含有变异的突变有机体在本发明中非常有用。例如将一个丙糖磷酸异构酶突变(tpi_)引入本发明的微生物是一个应用突变来促进碳通道运行的例子。突变可直接针对一个结构基因来修复或提高一个酶的活性，或直接针对一个调节基因来调节一个酶活性的表达水平。另外，转化和突变可组合使用来控制特定的酶活性，从而增加1，3-丙二醇的生成。因此，对能提高1，3_丙二醇产生的全细胞催化能力的修饰也在本发明的范围内。培养基和碳底物本发明的发酵培养基必须含有合适的碳底物。合适的碳底物包括但不局限于单糖 (如葡萄糖和果糖)、寡糖(如乳糖和蔗糖)、多糖(如淀粉或纤维素)或其混合物和从可再生的原料(如酪清、玉米浆、蔗糖甜菜浆、大麦麦芽)获得的未纯化的混合物。另外，碳底物还可以是已经证明可代谢转化为关键生物化学中间物的一碳底物如二氧化碳或甲醇。由单一碳源(例如甲醇、甲醛或甲酸)生产甘油在嗜甲基酵母(K. Yamada等，《农业生物化学》， 53卷第2期，541-543页，(1989))和细菌(Hunter等，《生物化学》，24卷，4148-4155页， (1985))中都已有报导。这些有机体能同化氧化状态的范围从甲醇到甲酸的单碳化合物，并产生甘油。碳同化的途径可通过核酮糖单磷酸、丝氨酸、或木酮糖单磷酸(Gottschalk，《细菌代谢》，第二版，Springer-Verlag =New York(1986))等途径。核酮糖单磷酸途径包括甲酸与核酮糖-5-磷酸结合而形成一个六碳糖，然后这个六碳糖转化为果糖并最终转化为三碳产物甘油醛-3-磷酸。同样，丝氨酸途径经过亚甲基四氢叶酸将一碳化合物同化到糖酵解途径中。除了一种或两种碳底物外，嗜甲基有机体还已知有着利用多种含碳化合物(如甲胺和葡萄糖胺)和多种氨基酸的代谢活性。例如，嗜甲基酵母已知可利用甲胺的碳来形成海藻糖和甘油(Bellion等，《微生物在一碳化合物上的生长》(Microb. Growth Cl Compd), [Int. Symp]，第 7 期(1993),415-32 页.编辑Murrel，J. Collin ;Kelly，Don P.出版 Intercept,Andover,UK)。同样，假丝酵母属的许多种能代谢丙氨酸或油酸(Suiter等，《微生物学丛刊》，(1990)，153卷第5期，485-9页)。应当理解本发明所用的碳源可包括多种含碳底物，并仅由有机体的选择来限制。虽然可以理解上述所有提到的碳底物及其混合物在本发明中都是适用的，但优选的底物是葡萄糖、果糖、蔗糖或甲醇。除了一种合适的碳源，发酵培养基还必须含有本领域的技术人员所熟知的合适的矿物质、盐、辅助因子、缓冲液和其它成分，这些成分应适于培养物的生长和启动1，3_丙二醇产生所必需的酶促途径。特别应当注意Co(II)的盐类和/或维生素B12或其前体。培养条件细胞一般在合适的培养基中30°C进行培养。本发明优选的生长培养基为普通的商业制备培养基,例如Luria Bertani (LB)肉汤、Sabouraud Dextrose(SD)肉汤、或酵母培养基(YM)肉汤。其它的精确或合成的生长培养基也可以使用，而且特殊微生物生长的合适培养基应为微生物学和发酵科学领域的技术人员所熟知的。还可在反应培养基中使用已知能直接或间接调节代谢终产物抑制的试剂，如环腺苷2' 3'-单磷酸。同样，还可将已知能调节酶活性从而导致1，3_丙二醇产生增加的化合物(如甲基紫精)与遗传操作结合使用， 或用来代替遗传操作。发酵的合适pH范围在pH5. O至pH9. O之间，其中pH6. O至pH8. O为优选的初始条件。反应可在有氧或无氧的条件下进行，其中，优选的条件是无氧或微氧。分批发酵和连续发酵本方法包括一个分批发酵的方法。经典的分批发酵是一个封闭的系统，培养基的成分在发酵开始时设置好，并在发酵过程中不再人为改变。因此，在发酵开始时培养基与所需的有机体或有机体混合物一起接种，在发酵开始后不再向系统中加入任何东西。在典型情况下，“分批”发酵是就碳源的加入而言的，人们常常需要控制某些因素如PH和氧浓度。 在分批发酵系统中，系统的代谢和各组分的生物量持续改变直到发酵结束。在分批培养物中，细胞从静止的延迟期进入高速生长的对数期并最后进入稳定期，在稳定期中，细胞的生长率降低或停止。如果不进行处理，处于稳定期的细胞会最终死亡。处于对数期的细胞通常产生大多数的终产物和中间物。补料分批系统是标准分批系统的一个变化。补料分批发酵方法也适用于本发明， 它除了包括经典的分批系统外，还包括在发酵过程中增加底物的量。补料分批系统在分解代谢物抑制细胞代谢时非常有用，因为在这种情况下需要限制培养基中的底物量。测定补料分批系统中的实际底物浓度非常困难，因而只能以可测量因素的变化为基础进行估计， 例如用PH、溶解氧和废气如(X)2的分压的变化进行估计。分批发酵和补料分批发酵在本领域非常普通和熟知，相应的例子可在以上Brock文中找到。虽然本发明以分批模式进行，但应当理解这些方法也适合于连续发酵方法。连续发酵是一个开放系统，在连续发酵中，一种精确发酵培养基被连续加入生物反应器中，同时等量的反应培养基被移出。连续发酵一般使培养物维持持续的高浓度，而细胞主要处于对数生长期。连续发酵允许对影响细胞生长或终产物浓度的一个因素或多种因素进行调节。例如，一种方法能严格保持限制性养分如碳源或氮水平，而让其它参数改变。在其它系统中， 可以连续改变多种影响生长的因子，而细胞浓度(用细胞浊度进行测量)保持恒定。连续系统尽量保持稳定的生长环境，因此，发酵中由于取出培养基而造成的细胞损失必须与细胞生长率相平衡。在连续发酵过程中调节养分和生长因子的方法以及使产物形成率达到最大的技术在工业微生物领域是众所周知的，而且多种方法已由Brock，上文，作了详细介绍。应当理解，本发明可使用分批、补料分批或连续的方法实现，任何已知的发酵模式都是适用的。另外，应当理解细胞可作为全细胞催化物固定在底物上，为1，3_丙二醇的生成提供发酵环境。1,3-丙二醇的纯化和鉴定从发酵培养基中纯化1，3-丙二醇的方法为本领域所熟知。例如，丙二醇可用下述方法从细胞培养基中获得，这个方法包括用一种有机溶剂抽提反应混合物、蒸馏和柱层析 (U. S. 5，356，812)。在这个过程中，一个特别好的有机溶剂是环己烷(U. S. 5，008，473)。可以通过对培养基进行高压液相色谱(HPLC)来直接鉴定1，3-丙二醇。在本发明中优选的方法是在一个分析用离子交换柱上，使用等梯度的0. OlN的硫酸作流动相对发酵培养基进行分析。细胞适用于本发明的细胞包括那些携带脱水酶的细胞。应当理解，合适的细胞既可以是原核细胞也可以是真核细胞，并仅受它们表达活性脱水酶的能力的限制。在本发明中特别有用的细胞是能方便地应用于大规模发酵方法的细胞。这样的有机体在工业生物工程领域是众所周知的，它们的例子可在《应用于工业和农业的重组微生物》，Murooka等编辑， Marcel Dekker, Inc. ,New York,New York(1994)中找到，包括发酵型的细菌以及酵母和丝状真菌。典型的酶可以是甘油脱水酶也可以是二醇脱水酶，其特异性底物分别为甘油和1，
2-丙二醇。脱水酶能将甘油转化为羟基丙醛(3-HPA)，然后3-HPA转化为1，3_丙二醇。含有这个途径的细胞可包括来自柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、梭菌属、克雷伯氏菌属、沙门氏菌属和乳杆菌属的突变或重组有机体。为本领域的技术人员所熟知的能通过发酵产生甘油的微生物都可以作为重组脱水酶的宿主，例如曲霉属、酵母属、接合酵母属、毕赤酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属、Dimaliella、德巴利酵母属、毛霉属、球拟酵母属和甲基菌属。其它在本发明中适合用作宿主的细胞包括芽胞杆菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属和链霉菌属。若不囿于理论，可以认为，自然界中存在的、属于上面所提到种类的有机体都适用于本发明。在申请人的实验工作基础上，应当理解多种细胞可用于本发明。例如申请人已经证明，在遗传和表型组合上差别很大的多种细胞都能将一种合适的碳底物生物转化为1，
3-丙二醇，所举的细胞例子包括一个组合有dha基因的肺炎克雷伯氏菌突变菌株、含有克雷伯氏菌属基因组中甘油或二醇脱水酶编码基因的元件的重组大肠杆菌菌株、和也用克雷伯氏菌属的元件转染并在编码磷酸丙糖异构酶的基因上带有一个突变的重组大肠杆菌 (tpil菌株。
虽然，即使在存在葡萄糖和木糖的情况下，含有来自肺炎克雷伯氏菌的dha调节子的大肠杆菌重组子也能将甘油转化为1，3_丙二醇(Tong等，《应用生物化学和生物技术》，34卷，149页(199 )。但在仅有葡萄糖存在的情况下，在这些有机体中不能检测到1， 3-丙二醇。与这一公开内容不同，本发明的申请人发现，三株大肠杆菌在没有外源加入甘油存在的情况下由葡萄糖原料产生1，3-丙二醇，这三株大肠杆菌携带两种独立分离的、含来自肺炎克雷伯氏菌的dha调节子的粘粒中的一种。携带有含肺炎克雷伯氏菌dha调节子的粘粒载体ρΚΡ-l或ρΚΡ-2的大肠杆菌菌株ECL707，显示在没有外源加入甘油的情况下可以检测到由葡萄糖产生的1，3_丙二醇，虽然产量不高(实施例4)。从另一个宿主有机体-DH5 α构建而来的重组大肠杆菌菌株也含有ρΚΡ-l或ρΚΡ_2粘粒载体，这种菌株被发现在合适的条件下由葡萄糖产生1，3-丙二醇比ECL707重组体有效得多，(实施例3)。在实施例4的条件下，由葡萄糖产生1，3-丙二醇更有效的菌株是含有粘粒载体ρΚΡ-l或ρΚΡ-2 的重组大肠杆菌菌株ΑΑ200，实施例2，大肠杆菌ΑΑ200含有一个有缺陷的丙糖磷酸异构酶 (tpD。从转化反应独立分离株的混合物中选择了 ΑΑ200-ρΚΡ1的一个菌株作进一步的研究，这株细菌经过一个两阶段反应将葡萄糖转化为1，3_丙二醇。在第一阶段，菌株 ΑΑ200-ρΚΡ1-5在不含葡萄糖和甘油的条件下生长到高细胞浓度。在第二阶段，将培养好的细胞悬浮在含有葡萄糖但没有甘油的培养基中，细胞就会以很高的转化率和选择性将葡萄糖转化为1，3-丙二醇，实施例5。虽然在免疫化学、色谱和遗传上不同，依赖于辅酶B12的酶-甘油脱水酶(E. C. 4. 2. 1. 30)和二醇脱水酶(E. C. 4. 2. 1. 28)都能催化甘油转化为3-羟基丙醛。dha调节子中包含甘油脱水酶，但不含二醇脱水酶。肺炎克雷伯氏菌ATCC87M含有一个二醇脱水酶而不是甘油脱水酶，它能将甘油转化为1，3_丙二醇O^rage等，《细菌学杂志》，149卷，413页，(1982))。重组大肠杆菌菌株ECL707和AA200均含有能编码二醇脱水酶的粘粒PKP4，它们都能将葡萄糖转化为1，3-丙二醇，实施例2和实施例4。肺炎克雷伯氏菌ECL2106是从一个天然存在的菌株通过诱变制备而来的(Ruch 等，《细菌学杂志》124卷，348页，(197 )，它能够组成型表达dha调节子(Ruch等，上文； Johnson等，《细菌学杂志》164卷，479页(1985))。用同样方法制备了具有同样表型的肺炎克雷伯氏菌ATCC25955的一个衍生菌株Oarage等，《细菌学杂志》149卷，413页(1982))。 克雷伯氏菌属dha结构基因的表达部分受一个抑制子的控制(dha R的产物)(Sprenger等， 《普通微生物学杂志》135卷，1255页(1989))。本发明的申请人已经证示，含有组成型dha 结构基因的ECL2106能在没有外源加入甘油的条件下，由葡萄糖原料生产1，3-丙二醇，实施例6。这与野生型的肺炎克雷伯氏菌ATCC25955相反。肺炎克雷伯氏菌ATCC25955在相同条件下不能产生可检测水平的1，3-丙二醇，实施例6。ECL2016中dha结构基因的表达进一步受到分解代谢物表达的控制(Sprenger 等，《普通微生物学杂志》135卷，1255页，(1989))。将必需的结构基因置于另外的启动子控制下能够消除分解代谢物抑制。这一点已在弗氏柠檬酸杆菌的1，3_丙二醇氧化还原酶 (dhaT)和产酸克雷伯氏菌的二醇脱水酶中得到了证实(Daniel等，《细菌学杂志》177卷， 2151页(1995)和Tobimatsu等，《生物与化学杂志》270卷，7142页，(1995))。通过这种方式在ECL2106中消除分解代谢物抑制，成功地提高了在没有外源甘油的情况下由葡萄糖生产1，3-丙二醇的产量。按前述的方法使用合适的碳通道可进一步提高1，3-丙二醇产量，例如使用tpi—突变。因为柠檬酸杆菌和克雷伯氏菌的dha调节子非常相似。本领域的技术人员可以理解，在克雷伯氏菌中用来在没有外源甘油的条件下由葡萄糖生产1，3_丙二醇的技术也可用于柠檬酸杆菌。而且，因为丁酸梭菌的甘油代谢与肺炎克雷伯氏菌相同Geng等，《生物技术与生物工程》44卷，902页，(1994))，这些技术也可用于梭菌。实施例通用方法磷酸化、连接和转化的过程是本领域众所周知的，在下面的实施例中适用的技术可在Sambrook，J等，《分子克隆实验指南》，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)中找到。适用于细菌培养物维持和生长的材料和方法是本领域众所周知的。在下面的实施例中适用的技术可在《普通细菌学方法手册》(Phillipp Gerhardt, R. G. E. Murray, Ralph N. Costilow，Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg 和 G. Briggs Phillips,编辑)，美国微生物学会，Washington, DC(1994)中，或在Thomas D. Brock的《生物技术工业微生物教程》,第二版(1989) Sinauer Associates, Inc. , Sunderland, ΜΑ.中找到。除非另行说明，所有用于细菌生长和维持的试剂和材料都购自Aldrich Chemicals (Milwaukee, WI),DIFCO Laboratories(Detroit，MI)、GIBC0/BRL(Gaithersburg，MD)和Sigma Chemical Company(St Louis, M0)。缩写的含义如下“h”指小时，“min”指分钟，“sec”指秒，“d”指天，“mL”指毫升，“ L ”指升，50amp为50ug/mL的氨苄青霉素，LB-50amp为含50ug/mL氨苄青霉素的 Luria-Bertani 肉汤。在表中使用了下列缩写。“Con”为转化，“％1”是以碳为基础的选择性，“nd”指没
有检测。酶试验无细胞抽提物中的甘油脱水酶用1，2-丙二醇作底物来测定。这个试验的基础是醛与甲基苯并-2-噻唑酮腙反应，详见i^rage和faster的介绍(《生物物理与生物化学学 m (B. B. A) 569, 249, (1979))。1，3-丙二醇氧化还原酶有时被称为1，3-丙二醇脱氢酶，其活性可按照Johson和Lin，《细菌学杂志》169卷，2050页(1987)介绍的方法进行测定。1，3-丙二醇的分离和鉴定甘油到1，3_丙二醇的转化用HPLC来监测，使用色谱领域的技术人员常用的标准技术和材料进行分析。一个合适的方法是使用一台WatersMaxima 820HPLC系统，并用 UV(2IOnm)和RI进行检测。样品注入一个已装有Shodex SH-IOllP预装柱(6mmX50mm)的 Shodex SH-IOll 柱(8mmX 300mm，购自 Waters，Milford，MA)，温度控制在 50°C，使用 0. OlN H2SO4作流动相，流速为0. 5mL/min。当需要进行定量分析时，样品与作为外部标准的一定量的三甲基乙酸一起制备。一般来说，甘油(RI检测)、1，3_丙二醇(RI检测)和三甲基乙酸 (UV和RI检测)的保留时间分别为20. 67分、20. 68分和35. 03分。1，3_丙二醇的产生用GC/MS来证实。使用GC/MS领域的技术人员常用的技术和材料进行分析。一个合适的方法是使用一台与Hewlett Packard 5971系列质量选择检测器(EI)偶联的Hewlett Packard 5890系列II气相色谱和一个HP-INNOWax柱(30m长，0. 25mm i. d. ,0. 25micro film厚)。所产生的1，3-丙二醇的保留时间和质谱图与确定的 1，3_丙二醇(m/e :57,58)进行比较。另一个GC/MS方法包含样品的衍生。在1. OmL样品(例如，培养物上清)中加入 30uL浓(70% ν/ν)高氯酸，混勻后将样品冷冻并干燥。在干燥物中加入双(三甲基硅)三氯乙胺吡啶的1 1混合物(300uL)，剧烈混勻，在65°C放置1小时。离心除去不溶物，获得的液体分为两相，用上层液体进行分析。在一个DB-5柱(48m，0. 25mm I. D.，0. 25um film 厚；获自J&W Scientific)上对样品进行层析。从培养物上清中获得的1，3-丙二醇衍生物的保留时间和质谱图与确定的标准物进行比较。TMS衍生的1，3_丙二醇的质谱图包括205、 177、130和115AMU的特征离子。肺炎克雷伯氏菌粘粒文库的构建肺炎克雷伯氏菌(ATCC25955)在IOOmL LB培养基中37°C通气培养8小时。使用 DuPont Sorvall GLC 2. B离心机在室温下将细菌(每管25ml) 3000rpm离心15分钟。取细菌沉淀并弃去上清。将细菌沉淀在_20°C冷冻。按下面指出的方法分离染色体DNA，并注意避免DNA剪切(即避免涡旋)。将每管细菌重新悬浮在2. 5mL的50mM Tris-IOmM EDTA中， 加入500uL溶菌酶(lmg/mL)。温和悬浮细菌，并将悬液在37°C保温15分钟。在悬液中加入十二烷基硫酸钠至终浓度为0.5%。这会导致溶液变清。在悬液中加入蛋白酶K(50ug/ mL)并55°C保温2小时。将试管取出转至一个冰槽中，并加入氯化钠至终浓度0. 4M。在溶液中加入两倍体积的乙醇。用一根玻璃管插入界面使DNA温和地缠绕在其上。将DNA浸入一个含70 %乙醇的试管中。真空干燥后，将DNA重新悬浮于50uL水中，并用分光光度法测定DNA的浓度。取小份DNA稀释后在0. 5%的琼脂糖凝胶上观察DNA的完整性。染色体DNA按Sambrook等，上文，介绍的方法用Sau 3A部分消化，DNA (0. 2ug)用 2单位的Sau 3A(Promega, Madison, WI)在室温下消化，反应总体积为200uL。在0、5、10 和20分钟分别取样(50uL)，转入含5umol EDTA的试管中，将这些试管在70°C保温10分钟。取一份(2uL)在0.5%的琼脂糖凝胶上电泳分析，确定消化的水平，剩余的样品G8uL) 在-20°C保存。将凝胶用溴化乙啶染色并在UV下观察来测定染色体的部分消化。观察到染色体DNA的大小随时间的延长而变小，这表明染色体DNA的变小是由于Sau 3A作用。用标准程序方法从剩余样品中抽提DNA (Sambrook等，上文)。肺炎克雷伯氏菌的部分消化DNA粘粒文库用Supercos粘粒载体试剂盒和 GigapackII包装抽提物制备，所用的试剂购自Mratagene (La Jolla, CA)。操作按厂家提供的说明进行。包装后的肺炎克雷伯氏菌用转染大肠杆菌XLl-Blue MR来测定，含有4X IO4 至1.0X105的噬菌体滴度。从6个大肠杆菌转化子中分离到了粘粒DNA，并发现它们含有大的DNA插入片段 (25 至 30kb)。实施例1用粘粒DNA克隆和转化大肠杆菌宿主细胞来表达1，3_丙二醇培养基合成培养基S12用来筛选能产生1，3_丙二醇的细菌转化子。S12培养基含有 IOmM 硫酸铵、50mM 磷酸钾缓冲液，pH7. 0、2mM MgCl2、0. 7mM CaCl2、50uM MnCl2UuM FeCl3, IuM ZnCl2U. 7uM CuSO4,2. 5uM CoCl2、2. 4uM Na2MoO4 和 2uM 盐酸硫胺素。
培养基A用于生长和发酵，它包含10mM硫酸铵、50mMM0PS/K0H缓冲液，pH7. 5、5mM 磷酸钾缓冲液，pH7.5、2mM MgCl2、0. 7mM CaCl2、50uM MnCl2UuM FeCl3UuM ZnCl2U. 72uM CuSO4,2. 53uM CoCl2,2. 4uM Na2Mo04、2uM 盐酸硫胺素、0. 01%酵母抽提物、0. 01%酪蛋白氨基酸、0. 8ug/mL维生素B12和50amp。根据需要，培养基A可补加0. 2 %的甘油或0. 2 %的甘油加0.2%的D-葡萄糖。细胞肺炎克雷伯氏菌ECL2106 (Ruch等，《细菌学杂志》IM卷，348页(1975))在文献中也被称为产气克雷伯氏菌或产气气杆菌。该菌获自E. C. C. Lin(Harvard Medical School, Cambridge, MA)，并作为实验室培养物保藏。肺炎克雷伯氏菌ATCC25955购自美国典型培养物保藏中心(Rockville MD)。大肠杆菌DH5a购自Gibco/BRL，并用分离自肺炎克雷伯氏菌ATCC25955、含有编码甘油或二醇脱水酶的基因的粘粒DNA进行了转化。含有甘油脱水酶的粘粒被确定为pKPl 和pKP2，含有二醇脱水酶的粘粒被确定为pKP4。转化后的DH5 α细胞被确定为DH5 a -pKPl、 DH5 a -pKP2 禾口 DH5 a -pKP4。大肠杆菌ECL707(Sprenger等，《普通微生物学杂志》135卷，1255页(1989))获自 E. C. C. Lin (Harvard Medical School, Cambridge, ΜΑ)，并转化有相同的来自肺炎克雷伯氏菌的粘粒DNA。含有甘油脱水酶基因的转化子被确定为ECL707-pKPl和ELC707_pKP2，含有二醇脱水酶基因的转化子被确定为ECL707-pKP4。大肠杆菌AA200 (Anderson等，《普通微生物学杂志》62卷，3 页(1970))购自 Genetic Stock Center, Yale University (New Haven, CT),这个菌株在 tpi 基因上有一个突变。用克雷伯氏菌粘粒DNA转化该菌株得到含有甘油脱水酶基因的ΑΑ200-ρΚΡ1和 AA200-pKP2重组有机体，和含二醇脱水酶基因的AA200-pKP4重组有机体。DH5a用肺炎克雷伯氏菌DNA转染大肠杆菌XLl-Blue MR，选取约含1000个菌落的六个转化平板，用5mL LB培养基洗涤平板并离心。收集菌体并重新悬浮在5mL LB培养基+甘油中。取一份(50uL)接种到装有S12合成培养基并含有0.2%甘油+400ng/毫升的维生素B12+0. 001%酵母抽提物+50amp的15mL试管中。试管中装满培养基直至顶部，用封口膜封好并在30°C保温。48小时后观察到轻微的浑浊。按上面所述方法分别在78小时和132 小时取一份培养物来分析产物的分布。各份培养物均为1，3_丙二醇阳性，时间点越后，产生的1，3-丙二醇越多。将检测为1，3-丙二醇生成阳性的细菌系列稀释后涂布到LB-50amp平板上来分离单个的菌落。共分离到48个单菌落并再次检测它们能否产生1，3-丙二醇。从6个独立克隆中分离粘粒DNA并将其转化到大肠杆菌DH5 α中。再次检测转化子能否产生1，3_丙二醇。对两个转化子做了进一步的分析，并将它们命名为DH5 a -pKPl和DH5 a -pKP2。将pKPl 中一段 12. Ikb 的 EcoRI-SalI 片段亚克隆到 pIBI31(IBI Biosystem, New Haven, CN)中，对这段序列做序列分析并将其命名为ρΗΙ^8_26 (SEQ ID NO :1)。测序结果揭示了编码甘油脱水酶的dhaT操纵子的相关开放阅读框和必需调节基因的位置，参见SEQ ID NO :1，在碱基1-399上发现了一个编码二羟基丙酮激酶的开放阅读框dhaK;在碱基983-2107上发现了编码甘油脱氢酶的开放阅读框dhaD ；在碱基2209-4134上发现了编码抑制子的开放阅读框dhaR ；在碱基5017-6180上发现了编码1，3_丙二醇氧化还原酶的开放阅读框dhaT;在碱基7044-8711上发现了编码甘油脱水酶α亚单位的开放阅读框 dhaBl ；在碱基87M-9308上发现了编码甘油脱水酶β亚单位的开放阅读框dhaB2 ；在碱基 9311-9736上发现了编码甘油脱水酶Y亚单位的开放阅读框dhaB3 ；并在碱基9749-11572 上发现了编码未知功能蛋白的开放阅读框dhaBX。用来自肺炎克雷伯氏菌的包装好的粘粒转染大肠杆菌XLl-BlueMR，挑取单个菌落接种到含有200uL S15培养基(硫酸铵，10mM、磷酸钾缓冲液，pH7. 0，ImM.MOPS/KOH, pH7. 0、 50mM、MgCl2, 2mM、CaCl2,0. 7mM、MnCl2, 50uM、FeCl3, luM、ZnCl2, luM、CuSO4,1. 72uM、CoCl2, 2. 53uM,Na2MoO4, 2. 42uM和盐酸硫胺素，2uM) +0. 2%甘油+400ng/mL 维生素 B12+0. 001%酵母抽提物+50ug/mL氨苄青霉素的微滴定孔中。除了接种微滴定孔外，还接种一个含LB-50amp 的主平板，96小时后，取出IOOuL,在一个含0. 2微米尼龙纤维膜的Rainin微离心管中离心，细菌留在膜上，将膜处理后做HLPC分析。在筛选了 240个克隆后，鉴定到了证明能产生 1，3_丙二醇的阳性克隆。共鉴定到了三个阳性克隆，其中两个能在LB-50amp上生长，另一个不能。从两个能在LB-50amp上生长的阳性克隆的一个中分离了一个单菌落，并证实这个菌落能产生1，3-丙二醇。这个菌落被命名为pKP4。从含有ρΚΡ4的大肠杆菌菌株中分离粘粒DNA，并用它来转化大肠杆菌DH5 α，将一个独立的转化子命名为DH5 α -ρΚΡ4。这个转化子证实能产生1，3-丙二醇。ECL707用对应于ρΚΡ1、ρΚΡ2、ρΚΡ4的肺炎克雷伯氏菌DNA粘粒和Supercos空载体转化大肠杆菌ECL707菌株，所获得的转化子分别命名为ECL707-pKPl、ECL707-pKP2、ECL707-pKP4 和ECL707-pKP-sc。ECL707含有缺陷的glpK、gld和ptsD，这三个基因分别编码ATP依赖的甘油激酶、NAD+相连的甘油脱氢酶和磷酸烯醇式丙酮酸依赖的磷酸转移酶系统的催化磷酸二羟基丙酮的酶II。在LB-50amp平板上，从每次粘粒转化中分离20个单菌落，并从Supercos空载体 (阴性对照)转化中分离5个单菌落，将它们转入一个LB-50amp主平板。同样检测这些菌落将甘油转化为1，3_丙二醇的能力，从而确定它们是否含有脱水酶活性。用无菌牙签将这些转化子转入微滴定板。微滴定板中含有200uL的培养基A，并补加有0. 2%甘油或0. 2% 甘油+0. 2% D-葡萄糖，再30°C保温48小时后，将微滴定板小孔中的内容物滤过一个0. 45u 的尼龙滤器，然后用HLPC进行层析。这些检测的结果在表1中给出。表1转化的ECL707将甘油转化为1,3-丙二醇阳件菌落的数目/检测菌落的数目转化子甘油甘油+葡萄糖
ECL707-pKPl19/2019/20
ECL707-pKP218/2020/20
ECL707-pKP40 /2020/20
ECL707-SC0/50/5AA200
用对应于pKPl、pKP2、pKP4的肺炎克雷伯氏菌DNA粘粒和Supercos空载体转化大 肠杆菌AA200菌株，所获得的转化子分别命名为AA200-pKPl、AA200_pKP2、AA200-pKP4和 AA200-pKP-sc。菌株AA200在磷酸丙糖异构酶上有缺陷，(tpi_)。按在大肠杆菌ECL707中介绍的方法，从每次粘粒转化中分离20个单菌落，并从 Supercos空载体转化中分离5个单菌落，检测这些菌落将甘油转化为1，3_丙二醇的能力， 这些检测的结果见表2。表2转仆,的AA200将甘油转仆,为1,3- 二醇阳丨牛菌落的数目/检测丨菌落的数目
转化子甘油甘油+葡萄糖
AA200-pKPl17/2017/20
AA200-pKP217/2017/20
AA200-pKP42/2016/20
AA200-SC0/50/5实施例2转化有含脱水酶活性的肺炎克雷伯氏菌DNA的大肠杆菌AA200菌株将D-葡萄糖 转化为1，3_丙二醇从含有肺炎克雷伯氏菌dha调节子粘粒pKPl或pKP2、肺炎克雷伯氏菌pdu操纵 子粘粒pKP4或Supercos空载体的大肠杆菌菌株AA200中挑取单菌落，接种到装满培养基 (约14mL实施例1中介绍的培养基A，并补加有10ug/mL的卡那霉素和0. 2%的D-葡萄糖， 加上或减去0. 5-1. OmM的环腺苷酸-2‘ 3'单磷酸(cAMP))的玻璃血清瓶中。为避免与 甘油接触，接种可用一个LB-50amp琼脂)平板或用相同培养基制备的液体培养物来进行。 整个反应可在30°C保温约72小时并250rpm振荡。细菌的生长用600nM处的光吸收值的变 化来测定，起始0D_为0.020AU。葡萄糖减少和产物分布的量用HLPC来测定。单菌落用编 号的后缀“-X”来表示。例如，AA200-pKPl-x。积累的结果见表3和表4。表3转化的大肠杆菌AA200菌株将0. 2%的D-葡萄糖转化为1，3_丙二醇无cAMP
权利要求
1. 一种生产1，3_丙二醇的生物转化方法，包括在合适的条件下，使甘油与具有至少一个能表达脱水酶的基因的单一微生物接触，所述微生物选自曲霉属、糖酵母属、接合糖酵母属、毕赤氏酵母属、克鲁维氏酵母属、假丝酵母属、汉逊氏酵母属、德巴利氏酵母属、毛霉属、 球拟酵母属、甲基细菌属、沙门氏菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属和假单胞菌属的成员。
全文摘要
本发明涉及利用单一微生物将可发酵碳源生物转化为1，3-丙二醇。具体地，本发明提供一种用单一微生物将一种碳底物生物转化为1，3-丙二醇的方法，所使用的微生物含有编码一种活性甘油脱水酶或二醇脱水酶的基因，本方法通过将这类微生物与一种碳底物在合适的发酵条件下接触来进行。
文档编号C12N9/88GK102304551SQ201110093628
公开日2012年1月4日 申请日期1996年5月10日 优先权日1995年5月12日
发明者C·E·纳卡穆拉, L·A·拉芬德, V·纳加拉杰安 申请人:纳幕尔杜邦公司, 詹伦卡国际有限公司