专利名称：一种提高烟叶含油量的方法
技术领域：
本发明涉及一种提高烟叶含油量的方法。
背景技术：
烟草是重要的叶用经济作物，目前只发现一例通过基因技术提高烟叶含油量的方法美国Thomas Jefferson大学的Andrianov等人在烟草中分别用rbcS和Alc启动子表达拟南芥的 DGAT (diacylglycerol acyltransferase)和 LEC2 (LEAFY COTYLEDON 2)基因，将烟叶单位干重含油量提高到5. 8-6. 8%，比改造前材料的含油量提高了约5个百分点 (Andrianov V et al. , Plant Biotechnology Journal, 2010,8 :277-287)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高烟叶含油量的方法，该方法能提高烟叶的含油量。为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是一种提高烟叶含油量的方法，其特征在于它包括如下步骤1)、烟草rbcS启动子的克隆及序列分析以烟草基因组DNA为模板进行PCR扩增，经1 % (质量)的琼脂糖凝胶电泳显示， 从烟草基因组DNA扩增出IOOObp的单带；将此特异条带回收，连接到克隆载体PMD-18T vector,导入宿主菌E. coli菌株DH5 α后，挑单菌落摇菌，经筛选的重组子pMD-18T_rbcS 的PCR扩增及酶切结果显示，均出现目的条带，说明扩增片段已成功连接于pMD-18T中；测序结果显示扩增片段长度为979bp，序列分析表明，该序列为rbcS启动子序列；2)、SLCl-I基因的克隆及其点突变①SLCl基因编码区的克隆从武汉大学菌种保藏中心取得酵母菌种，该酵母菌种的编号AY92007 = AS2. 159，来源中科院微生物所，用YM培养基在培养过夜，回收培养物，抽提其基因组 DNA作为PCR扩增模版，使用高保真Pyrobest DNA聚合酶和引物，Primer 120为SLCl的5， 编码引物5’ -TTTCCCGGATCCGCCACCATGAGTGTGATAGGTAGGTTCTT-3，；Primer 121 为 SLCl 的 3，编码引物5，-TTTCCCGAGCTCTTAATGCATCTTTTTTACAGATGAAC-3，，进行 PCR 扩增，扩增条件为94°C 2min ；94°C 30sec，50°C 30sec，72°C lmin, 38cycles ；72°C延伸 5min ；YM培养基成分
酵母抽提物3g，
麦芽糖3g，
Peptone5g,
琼脂20g,
双蒸水1000ml; 25 μ 1 PCR 扩增产物中加入 2U Taq 酶和 1 μ 1 2. 5mM dATP 于 72°C加 A 20min,克隆插入pMDIS-T载体，转化DH5 α涂于Amp平板；用通用引物Ml3+和Ml3-进行筛选，程序均为 94°C 2min ；94°C 30sec，50°C 30sec，72°C lmin, 40cycles ；72°C延伸 5min ；为了验证插入序列的方向，再次用120/121、M13+/120、M13-/121进行验证，随机挑取正向和反向插入的两个克隆进行单向测序，结果发现1个克隆其序列与SLCl基因序列仅有1个核苷酸的差异，很可能本身就是一个基因组变异；所以必须突变1个位点，才能得到与突变型SLCl-I基因功能相同的序列；②SLCl基因点突变后获得SLCl-I基因先用Pyrobest DNA 聚合酶和引物 120/126,121/127 和 120/121 分别在 25 μ 1 体系中PCR扩增上述SLCl基因的5’片段、3，片段和全长序列，PCR程序为94°C 2min ； 94°C 30sec，50°C 30sec，72°C lmin, 35cycles ；72°C延伸 5min ；Primer 126 为 SLCl 的 5，突变引物:5，-CGCGCAGTAATCCACAGAGCCAAATGTTG-3，；Primer 127 为 SLCl 的 3，突变引物5， -TTGGCCTTGACGTCAAGGTCGTTGGCG-3’ ；将SLCl基因的5，片段、3，片段和全长序列混合，用Pyrobest DNA聚合酶在50μ1 体系中进行 PCR 扩增，PCR 程序为 94°C lmin ；94°C 30sec，68°C 90sec, 20cycles ；72°C延伸 5min ；PCR体系组成如下
IOXbuffer5ul,
dNTP4ul,
Pyrobest0.25ul,
双蒸水25.75ul，
5，PCR 产物5ul,
3，PCR 产物5ul，
100 X稀释全长PCR产物 5ul;电泳分离Pyrobest扩增体系中的全长PCR产物，切胶回收并测序；测序表明其中一个克隆(SLC-3-31)成功完成了 1个目标氨基酸位点的突变；用BamHI和McI从 SLC-3-31切下目的片段并插入PBI121载体，即获得了点突变后的SLCl-I基因；3)、目的表达载体rbcS =SLCl-I的构建用HindIII和Xba I限制性内切酶双酶切质粒!35S :pBI121、;35S :SLC1_1和 pMD-18T-rbcS，完毕后分别回收酶切载体大片段和启动子序列片段产物，将酶切载体大片段和启动子序列片段产物按照4 1的质量比例混合，在T4DNA Iigase作用下于16°C温育 12h以上，将连接产物导入宿主菌Ε. coli DH5 α，通过PCR鉴定和酶切鉴定显示，得到植物表达载体 rbcS :pBI121 和 rbcS =SLCl-I ；4)、烟草转基因体系的建立及阳性苗的PCR检测将目的表达载体rbcS =SLCl-I转化农杆菌LBA4404，得到含有目的表达载体rbcS SLCl-I的农杆菌；取烟草幼嫩的无菌叶片，用打孔器制取叶盘，并用含有目的表达载体 rbcS =SLCl-I农杆菌进行侵染；将叶盘直接放置烟草叶盘预、共培养基MSl上，在弱光下预培养和共培养3-4天后；共培养3-4天后将叶盘转移到筛选培养基MS2上进行筛选培养，每隔2-3周进行一次继代培养；待出现Icm小芽时将小芽切下放置烟草生根培养基MS3上进行生根培养，待苗子生长稍大一点可提取DNA进行PCR检测；
烟草转基因采用农杆菌浸染法转化，农杆菌介导的烟草叶盘转化法参照 Agrobacterium protocols I ；用附加AS的基本培养基MS0重悬菌液，OD值达到0. 5-1. 0， 侵染经过预培养或未经预培养的烟草叶盘，侵染20-30分钟，弱光下共培养3天，含IOOmg/ L卡那、400mg/L羧苄培养基筛选，每两周更换一次新鲜培养基，直至抗性芽长至Icm时移入烟草生根培养基MS3，附加75mg/L卡那筛选；长势健壮的植株采用NPTII进行PCR检测；将小芽移植，生长至成熟，得到Ttl代烟草转基因植株。所述基本培养基MStl 大量元素+微量元素+有机成分+铁盐成分+3%蔗糖+0. 7% 琼脂；所述烟草叶盘预、共培养基MSl :MS0+2mg/L 6-BA+O. 2mg/L IAA ；所述蹄选培养基MS2 :MS0+2mg/L 6-BA+O. 2mg/L IAA+500mg/L Carb+lOOmg/L Kan ；所述烟草生根培养基MS3 :MS0+0. 2mg/L IAA+200mg/L Carb+75mg/L Kan ；
大量元素NH4NO31650mg/L,KNO31900mg/L,CaCl2 · 2H20440mg/L,MgS04 · 7H20370mg/L,KH2PO41700mg/L；微量元素KI0. 83mg/L,H3BO36.2mg/L,MnSO4 · 4H2022.3mg/L,ZnSO4 · 7H208.6mg/L，Na2MoO4 · 2H200.25mg/L，CuSO4 · 5H200.025mg/L,CoCl2 · 6H200. 025mg/L；铁盐成分FeSO4 · 7H2027.8mg/L,Na2-EDTA · 2H2037. 3mg/L；有机成分:肌醇100mg/L，烟酸0. 5mg/L,盐酸吡哆醇(VB6)0. 5mg/L,盐酸硫胺素(VB1)0. 5mg/L,甘氨酸2mg/L。 本发明的有益效果是该方法能提高烟叶的含油量。挑选转基因T2代转基因植株中拷贝数较低且RT-PCR结果较好的样品，取全株叶片研磨混勻编号，进行粗脂肪的测定， 样品slc5的粗脂肪含量较ck的粗脂肪含量高了 5. 9个百分点。
图1 rbcS启动子PCR扩增产物电泳图，1 DL2000marker ；2阴性对照；3PCR产物。图2是pMD-18T-rbcS为模板的PCR产物电泳图，1 DL2000Marker ；2阴性对照；3-5 为PCR产物。图3是pMD-18T-rbcS酶切产物电泳图，1 Hind III和Xba I酶切产物；2 DGL2000 markerο图4是克隆到的rbcS启动子片段序列图(用于与已报道序列(GenBank :X02353) 比对结果)。图 5 是质粒;35S :SLC1_1 酶切鉴定图，IDL 2000marker ；2 BamH I 和 Sac I 双酶切。图6克隆到的SLCl-I片段序列图[用于与已报道序列SLCl (GenBank :Z74100. 1)
比对结果]。图 7rbcS :pBI121、rbcS =SLCl-I 阳性克隆 PCR 检测电泳图，lDGL2000Marker ；2 阴性对照；3-21 PCR产物。图 8rbcS :pBI121、rbcS =SLCl-I 质粒酶切电泳图，lDL2000Marker ；2 质粒 rbcS pBI121Hind III和 Xba I 酶切产物；3 质粒 rbcS =SLCl-I Hind III和 Xba I 酶切产物。图 9 是 rbcS :pBI121、rbcS =SLCl-I 载体图谱，LB、RB 为左右边界；NOSp,NOSt 为 NOS启动子和终止子；nptll 为卡那抗性筛选基因；rbcS 为烟草叶部组织特异性启动子 rbcS ；Hindi 11 ,XbaI, BamHI, SacI 为限制性内切酶酶切位点；⑶S为报告基因。图10是烟草遗传转化过程图，a切苗，b预培养，c共培养，d筛选，e生根，f移栽。图11转基因烟草的PCR检测电泳图，1 DL2000Marker ；2-21 PCR产物；22空白对照；23阴性对照；24阳性质粒。图12转基因烟草的PCR电泳图，1 DL2000Marker ；2阴性对照；3阳性质粒； 4-13PCR 产物。图13对照、转rbcs :pBI121、转35S :pBI121植株的不同部位⑶S活性的组织化学染色图，图中A1、A2、A3分别为未转基因植株(阴性对照)的根、茎、叶进行GUS染色后体式解剖镜观察图；B1、B2、B3分别为转rbcS :pBI121的烟草根、茎、叶进行⑶S染色后经体式解剖显微镜观察图；C1、C2、C3分别为转35S :pBI121的烟草根、茎、叶进行⑶S染色后体式解剖显微镜观察图。图14利用RT-PCR技术分析烟草叶片SLCl-I基因的表达量图。
具体实施例方式为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。一、英文缩略词CaMV35S 椰菜花叶病毒启动子⑶S β -葡糖醛酸酶NPTII 氨基糖苷-3'-磷酸转移酶(卡那霉素抗性)rbcS 核酮糖-1，5- 二磷酸加氧酶/羧化酶小亚基SLC 基因编码酵母 sn-2 Acyltransferase 的基因IPCR 反向 PCR
TaiL-PCR 热不对称交错PCRCTAB 十六烷基三甲基溴化铵6-BA 6-苄氨基嘌呤NAA: α-萘乙酸Car 羧苄青霉素Rif 利福平Amp 氨苄青霉素DEPC 焦碳酸二乙脂X-gluc 5-溴-4氯-3-吲哚葡萄糖苷。二、实验材料1. 1载体及菌株E. coli 菌株 DH5a、农杆菌 LBA4404、植物表达载体!35S :pBI12U35S =SLCl-I 由中国农科院油料作物研究所提供。1. 2DNA纯化回收试剂盒为i^ermentas产品，质粒提取试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司，PMD-18T vector、T4DNA 连接酶、Hind III Jba I、BamH I.Sac I、 Taq I和Mst I限制性内切酶购于Takara、Promega公司。1. 3培养基MS培养基配方
权利要求
1. 一种提高烟叶含油量的方法，其特征在于它包括如下步骤1)、烟草rbcS启动子的克隆及序列分析以烟草基因组DNA为模板进行PCR扩增，经1 % (质量)的琼脂糖凝胶电泳显示，从烟草基因组DNA扩增出IOOObp的单带；将此特异条带回收，连接到克隆载体pMD-18T vector, 导入宿主菌Ε. coli菌株DH5a后，挑单菌落摇菌，经筛选的重组子pMD-18T_rbcS的PCR扩增及酶切结果显示，均出现目的条带，说明扩增片段已成功连接于PMD-18T中；测序结果显示扩增片段长度为979bp，序列分析表明，该序列为rbcS启动子序列；2)、SLCl-I基因的克隆及其点突变①SLCl基因编码区的克隆从武汉大学菌种保藏中心取得酵母菌种，该酵母菌种的编号AY92007 = AS2. 159，来源中科院微生物所，用YM培养基在培养过夜，回收培养物，抽提其基因组DNA作为 PCR扩增模版，使用高保真Pyrobest DNA聚合酶和引物，Primer 120为SLCl的5，编码引物5，-TTTCCCGGATCCGCCACCATGAGTGTGATAGGTAGGTTCTT-3，；Primer 121 为 SLCl 的 3，编码引物5，-TTTCCCGAGCTCTTAATGCATCTTTTTTACAGATGAAC-3’，进行 PCR 扩增，扩增条件为 940C 2min ；94°C 30sec，50°C 30sec，72°C lmin, 38cycles ；72°C延伸 5min ；YM培养基成分 酵母抽提物 3g麦芽糖 3g Peptone5g 琼脂 20g双蒸水 1000ml 、25 μ 1 PCR扩增产物中加入2U Taq酶和1 μ 1 2. 5mM dATP于72°C加A 20min,克隆插入pMD18-T载体，转化DH5 α涂于Amp平板；用通用引物Μ13+和Μ13-进行筛选，程序均为 940C 2min ；94°C 30sec，50°C 30sec，72°C lmin,40cycles ；72°C延伸 5min ；为了验证插入序列的方向，再次用120/121、M13+/120、M13-/121进行验证，随机挑取正向和反向插入的两个克隆进行单向测序，结果发现1个克隆其序列与SLCl基因序列仅有1个核苷酸的差异， 很可能本身就是一个基因组变异；所以必须突变1个位点，才能得到与突变型SLCl-I基因功能相同的序列；②SLCl基因点突变后获得SLCl-I基因先用Pyrobest DNA聚合酶和引物120/126、121/127和120/121分别在25 μ 1体系中 PCR扩增上述SLCl基因的5’片段、3’片段和全长序列，PCR程序为94°C 2min ；94°C 30sec, 50°C 30sec，72°C lmin, 35cycles ；72°C延伸 5min ；Primer 126 为 SLCl 的 5，突变引物:5，_ CGCGCAGTAATCCACAGAGCCAAATGTTG-3，；Primer 127 为 SLCl 的 3，突变引物5，-TTGGCCTTGA CGTCAAGGTCGTTGGCG-3‘；将SLCl基因的5，片段、3，片段和全长序列混合，用Pyrobest DNA聚合酶在50 μ 1体系中进行 PCR扩增，PCR程序为 94°C lmin ；94°C 30sec，68°C 90sec, 20cycles ；72°C延伸 5min ； PCR体系组成如下
2.根据权利要求1所述的一种提高烟叶含油量的方法，其特征在于所述基本培养基 MS0 大量元素+微量元素+有机成分+铁盐成分+3%蔗糖+0. 7%琼脂； 所述烟草叶盘预、共培养基MSl :MS0+2mg/L 6-BA+O. 2mg/L IAA ； 所述筛选培养基 MS2 :MS0+2mg/L 6-BA+O. 2mg/L IAA+500mg/L Carb+lOOmg/L Kan ； 所述烟草生根培养基 MS3 :MS0+0. 2mg/L IAA+200mg/L Carb+75mg/L Kan ；
全文摘要
本发明涉及一种提高烟叶含油量的方法。一种提高烟叶含油量的方法，其特征在于它包括如下步骤1)烟草rbcS启动子的克隆及序列分析；2)SLC1-1基因的克隆及其点突变，获得了点突变后的SLC1-1基因；3)目的表达载体rbcSSLC1-1的构建，得到植物表达载体rbcSpBI121和rbcSSLC1-1；4)烟草转基因体系的建立及阳性苗的PCR检测将叶盘直接放置烟草叶盘预、共培养基MS1上，共培养3-4天后将叶盘转移到筛选培养基MS2上进行筛选培养，每隔2-3周进行一次继代培养；待出现1cm小芽时将小芽切下放置烟草生根培养基MS3上进行生根培养，待苗子生长稍大一点可提取DNA进行PCR检测；将小芽移植，生长至成熟，得到T0代烟草转基因植株。该方法能提高烟叶的含油量。
文档编号C12N15/84GK102229948SQ20111011786
公开日2011年11月2日 申请日期2011年5月9日 优先权日2011年5月9日
发明者江木兰, 闫晓红, 魏文辉 申请人:中国农业科学院油料作物研究所